KR101685251B1

KR101685251B1 - 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부수렴 및 주름개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101685251B1
Application number: KR1020140064559A
Authority: KR
Inventors: 황유진; 신수영; 모상현; 박제권; 김대영
Original assignee: 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2014-05-28
Filing date: 2014-05-28
Publication date: 2016-12-09
Also published as: KR20150136887A

Abstract

본 발명은 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부수렴 및 주름개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물은 프리 라디칼 소거, 피부 수렴 효과, 피부 주름 개선 효과를 가지므로, 항산화, 피부 수렴 또는 주름 개선용 화장료 조성물로 사용할 수 있다.

Description

순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부수렴 및 주름개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법{Cosmetic composition comprising extract of Brassica Rapa, Brassica Rapa radish leaves or Brassica Rapa callus with anti-oxidant, astringent activity and skin wrinkle improvement effect and the manufacturing method thereof}

본 발명은 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부수렴 및 주름개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

피부의 노화 과정으로 피부는 건조해지고, 주름이 생기며 피부의 탄력을 잃게 된다. 피부노화에 관한 연구에서 가장 중요하게 다루어지는 것이 프리 라디칼(free radical)과 활성 산소종(Reactive oxigen species)이다.

유해산소(toxic oxygen species)라고도 하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 호흡 등과 같은 생리작용에 의해 세포에서 생성되는 독성물질로 끊임없이 생산되고 소멸하며, 정상적인 상태에서는 3-5% 정도로 존재한다. 이런 활성산소종은 수퍼옥시드 라디칼(Superoxide radical, O₂-), 하이드록시라디칼 (hydroxyl radical, HO⁺)과 같은 자유라디칼(free radical: 화학적으로 최외각 전자궤도에 쌍을 이루고 있지 않은 원자나 분자로 매우 불안정하여 높은 반응성을 가지는 형태)로 존재하거나 혹은 과산화수소(hydorgen peroxide, H₂O₂)나 일중항산소(Singlet radical, ¹O₂)와 같이 쌍을 이룬 전자를 가진 화합물의 형태로 존재한다. 활성산소종은 생리계 내에서 세균을 살균하는 생체 방어 작용을 하는 장점도 있지만, 일반적으로 생체 내에서 산화를 일으켜 질병의 원인이 되는 유해한 작용을 한다. 이러한 활성산소종은 생물분자를 공격하여 세포나 조직에 피해를 주며, 노화나 각종 성인병 질환에 관여하는 여러 종류의 질병을 야기한다는 보고도 있다. 이러한 활성산소종에 의한 산화작용을 억제할 수 있는 항산화제에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 항산화 효과가 우수한 천연물이나 물질들의 연구개발은 노화 예방 물질로서 각광받고 있다.

피부 노화를 방지하고 건강한 피부를 유지해 주는 기능 중의 하나로 수렴 작용을 들 수 있다. 수렴 작용의 원리는 피부 단백질의 고분자 플라보노이드(flavonoids)와 결합하여 가교결합을 형성하여 피부가 수축되는 현상을 말한다. 수렴이란 뜻에는 기본적으로 주름이 지고 혹은 움츠린다는 의미가 있으며, 수렴제는 피부와 점막 혈관 등을 수축시키는 작용이 있고, 세포간극 및 림프간극을 가로막아 점액의 분비를 억제시키는 효과가 있다. 또한 수렴제는 단백질과 결합하는 성질을 가지기 때문에 일반적으로 헤모글로빈 단백질이 추출물과 결합하는 정도에 따라서 수렴효과 정도를 판단할 수 있다. 따라서, 수렴 효과란 과도하게 열려진 모공이나 땀구멍을 수축시킴으로써 피부에 탄력감과 유연감을 주는 것이라 할 수 있다.

한편, 피부주름의 발생원인으로 피부교원질(콜라겐) 결핍과 엘라스틴의 구조변형이 제시되고 있다. 콜라겐과 엘라스틴은 피부 진피를 구성하는 주요 단백질로서 피부구조와 탄력을 유지하는 역할을 한다. 콜라겐은 나이가 들어 갈수록 생성이 감소하고 분해속도가 증가하게 된다. 한편, 엘라스틴은 자외선에 노출된 후 활성이 증가된 분해효소 엘라스타제에 의해 3차원 구조가 뒤틀려진다고 알려져 있다. 이러한 현상으로 인해 피부 진피층 함몰로 이어져 피부 주름이 생성되는 것으로 알려져 있다.

순무(Brassica Rapa. L.또는 B.Rapa hortenisis. L)는 배추과에 속하는 1년생 초본으로 유럽 서남부 해안지방이 원산지로 알려져 있다. 우리나라에서는 강화와 김포 등 일부 지역에서 재배되고 있으며 그대로 식용하거나 극히 일부가 순무 김치로 가공되고 있다. 순무는 일반무와 달리 단맛이 높고 독특한 향기가 있으며 조직감이 단단한 특징이 있다. 순무의 잎에는 무기질 및 비타민류가 풍부하고 뿌리에는 트립토판과 리진이 다량 함유되어 있다. 순무의 효능에 관하여는 과학적인 연구가 미흡하여 그 효능이 구체적으로 규명되어 있지는 않지만, 순무의 매운 맛을 내는 이소티오시아네이트(Isothiocyanate)가 오래 전부터 항암 성분으로 알려져 왔으며 동물 실험을 통해 식도암, 간암, 폐암, 대장암을 예방하는 효과가 입증되기도 했다. 또한, 순무에는 항암 물질로 알려진 인돌(indole) 및 설포라페인(sulforaphane) 등의 성분이 들어 있다.

본 발명의 목적은 피부에서 진행되는 여러 요인에 의한 피부의 노화를 억제하고, 항산화, 피부 수렴효과 및 피부 주름 개선 효과를 가지는 한편, 다른 부작용을 초래하지 않는 천연 식물 추출물 및 이의 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부수렴 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스를 자연건조, 동결건조, 열풍건조 또는 저온건조에 의해 건조하는 1단계; 및 상기 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스 중량의 5배 내지 80배 부피의 정제수를 포함한 물, C1 내지 C4의 저급 알콜, 헥산 또는 이들의 혼합용매를 가하여 50℃ 내지 1000℃에서 5분 내지 5 시간 동안 추출하여 여과하는 2단계를 포함하는 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부수렴 및 주름개선용 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 2단계의 여과된 추출액을 감압 농축하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 추출물은 순무의 열수 추출물, 초음파 추출물 또는 에탄올 추출물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 추출물은 순무 무청의 열수 추출물, 초음파 추출물 또는 에탄올 추출물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 추출물은 순무 캘러스의 열수 추출물, 초음파 추출물 또는 에탄올 추출물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 알코올, 헥산 또는 이들의 혼합용매에 의해 추출되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 순무 캘러스는 순무 종자로부터 발아가 유도된 순무 식물체의 줄기 또는 잎에서 캘러스가 유도된 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 알코올은 C1 내지 C4의 저급 알코올인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 저급 알코올은 에탄올, 메탄올 또는 부탄올인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 에탄올은 20% 내지 90%의 에탄올인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 수분로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 수분크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물은 프리 라디칼 소거, 피부 수렴 효과, 피부 주름 개선 효과를 가지므로 항산화, 피부 수렴 및 주름 개선용 화장료 조성물로 사용할 수 있다.

도 1은 순무 종자를 나타낸다.
도 2는 순무 종자를 기본 엠에스 배지에서 발아한 것을 나타낸다.
도 3은 발아한 순무 식물체에서 순무 캘러스를 유도한 것을 나타낸다.
도 4는 순무, 순무 무청, 순무 캘러스의 추출물의 DPPH 자유 라디칼 소거능을 통한 항산화 효과를 나타낸다.
도 5는 순무, 순무 무청, 순무 캘러스의 추출물의 피부 수렴 효과를 나타낸다.
도 6은 순무, 순무 무청, 순무 캘러스의 추출물의 피부 주름 개선 효과를 나타낸다.
도 7은 설포라판의 화학구조식 및 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 순무 추출물의 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 순무 무청 추출물의 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 10은 순무 캘러스 추출물의 HPLC 분석 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 항산화, 피부수렴 및 주름개선용 화장료 조성물의 유효성분인 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스의 추출물이 프리 라디칼 소거, 피부 수렴 효과, 피부 주름 개선 효과를 가지므로, 항산화, 피부 수렴 및 주름 개선용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

상기 항산화, 피부 수렴 및 주름 개선용 화장료 조성물의 유효성분인 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스의 추출물은 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스를 자연건조, 동결건조, 열풍건조 또는 저온건조에 의해 건조하는 1단계; 및 상기 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스 중량의 5배 내지 80배 부피의 정제수를 포함한 물, C1 내지 C4의 저급 알콜, 헥산 또는 이들의 혼합용매를 가하여 50℃ 내지 1000℃에서 5분 내지 5 시간 동안 추출하여 여과하는 2단계에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스를 열풍건조한 후, 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스 0.1 내지 5g을 칭량하고, 상기 칭량한 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스 시료 중량의 20 내지 40배 부피의 정제수를 포함한 물, 알코올, 헥산 또는 이들의 혼합용매를 가하여 30℃ 내지 300℃에서 10분 내지 3 시간 동안, 바람직하게는 열수 추출, 환류 추출, 가압 추출, 에탄올 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출하고 여과하는 2단계; 및 상기 여과된 추출액을 감압 농축 및 동결 건조하여 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스 추출물을 수득할 수 있다. 상기 초음파 추출 방법에서, 초음파란 인간의 귀로 들을 수 없는 높은 진동수의 소리를 말한다. 초음파 추출 방법은 20 KHz 이상의 주파수를 갖는 초음파를 추출 물질 및 추출 용매에 발사함으로써 초음파의 공동효과에 의해 높은 압력이 발생하고 이에 따라 세포 내부 조직이 파괴되어 천연물 등의 추출원료의 유효성분을 효과적으로 추출하는 기술이다.

상기 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스의 추출물을 추출하기 위한 용매로 정제수를 포함한 물, 알코올, 헥산 또는 이들의 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하며, 상기 알코올은 C1 내지 C4의 저급 알코올을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 저급 알코올은 에탄올, 메탄올 또는 부탄올을, 더욱 바람직하게는 20% 내지 90%의 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 순무 캘러스는 순무 종자로부터 발아가 유도된 순무 식물체의 줄기 또는 잎에서 캘러스가 유도되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 순무 캘러스를 제조하기 위하여, 순무 종자를 70% 에탄올(Ethanol)에 30초간 침지하고, 0.3 % 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 10-15분 진탕하여 표면 살균을 한 후, 멸균수로 세척하여, 무균 상태의 순무 종자를 제조한다. 이후, 무균 상태의 순무 종자를 기본 엠에스 배지(무라시게 스쿠그 배지, MS, Murashige & Skoog, Duchefa, Cat No. M0221.0050)에서 1 내지 15 일간, 바람직하게는 3 내지 10 일간 배양하여 발아를 유도한 후(도 2 참조), 발아가 유도된 순무 식물체에서 자란 순무 줄기 또는 잎, 바람직하게는 자엽(종자식물의 개체발생에 있어 최초로 형성되는 잎)을 잘라(도 3a 참조), 생물생장조절호르몬이 함유된 배지에 치상한 후, 23±2 ℃의 배양실에서 배양하며 캘러스가 유도된다. 순무 줄기 또는 순무 잎으로부터 캘러스가 유도되는 과정은 도 3b, 도3c에 도시되는 바와 같다. 상기 순무 캘러스는 생물생장조절호르몬이 함유된 기본 엠에스 배지에서 치상한 후, 3주 간격으로 계대 배양하여 증식될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부의 항산화, 피부수렴 및 주름개선 효과를 위한 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 추출물 이외에 본 발명의 효과를 저해하지 않는 범위 내에서 보습제, 증점제, 계면활성제, 유상기제, 방부제, 산화방지제, 알코올, 향료, pH 조절제, 천연추출물 등을 비롯하여, 피부 미백 및 노화 방지를 배가시키기 위한 화학적 성분의 피부 노화 방지 성분을 당업계의 통상적인 사용량으로 배합할 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 수분로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 수분크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 순무 캘러스 제조

1.1 순무 종자 소독

순무 종자는 강화도에서 구입하여 사용하였으며(도 1 참조), 순무 종자의 표면 살균을 위해 70% 에탄올(Ethanol)에 30초간 침지, 0.3 % 치아 염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 10-15분 진탕하여 살균 후 멸균수로 세척하였다.

1.2 순무 캘러스의 유도 및 계대배양

무균상태의 순무 종자를 기본 MS배지(Murashige & amp; Skoog; MS)에서 7일 동안 키워 발아를 유도하였다(도 2 참조). 발아가 유도된 순무 식물체에서, 적당히 자란 순무 줄기 또는 잎을 단번에 잘라(도 3a 참조), 생물생장조절호르몬이 함유된 배지에 치상하여 23±2 ℃의 배양실에서 배양하여 캘러스를 유도하였으며, 순무 줄기로부터 캘러스가 유도되는 과정은 도 3b, 순무 잎으로부터 캘러스가 유도되는 과정은 3c에 나타내었다. 이렇게 제조된 순무 캘러스는 3주 간격으로 계대 배양하여 증식되었다.

< 실시예 2> 순무, 순무 무청 및 순무 캘러스의 추출물의 제조

순무 및 무청은 강화도에서 구입하여 사용하였으며, 순무 및 무청은 수세 후 잘게 잘라 열풍건조하였다. 추출용매로 정제수와 70% 에탄올 2가지를 사용하였으며, 추출방법으로 열수추출법, 초음파추출법 및 에탄올 추출법의 3가지 방법을 사용하였다.

2.1 순무, 순무 무청 및 순무 캘러스의 열수 추출물 제조

순무, 순무 무청 및 순무 캘러스의 열수 추출물은 건조된 순무, 순무 무청 및 순무 캘러스 0.7g에 증류수 20 ml을 넣어서 121 ℃에서 15분간 추출하고 거즈로 여과한 후, 여과된 추출물을 동결건조하여 실험에 사용하였다.

2.2 순무, 순무 무청 및 순무 캘러스의 초음파 추출물 제조

순무, 순무 무청 및 순무 캘러스의 초음파 추출은 건조된 순무, 순무 무청 및 순무 캘러스 0.7g에 70% 에탄올 20 ml을 넣어서 초음파 수조(JAC 4020P)에서 온도를 60 ℃로 유지하며, 소닉 하이(SONIC HIGH)로 1시간 동안 추출하고 거즈로 여과한 후, 여과된 추출물을 동결건조하여 실험에 사용하였다.

2.3 순무, 순무 무청 및 순무 캘러스의 에탄올 추출물 제조

순무, 순무 무청 및 순무 캘러스의 에탄올 추출은 건조된 순무, 순무 무청 및 순무 캘러스 0.7g에 70% 에탄올 50 ml을 가한 다음 냉각기를 부착하여 2시간 동안 환류 추출하였고, 여과지(Whatman No.2)로 여과 후, 여과액을 회전식 감압증발기로 농축하여 얻은 액을 동결건조하여 실험에 사용하였다.

< 실험예 1> DPPH 자유 라디칼 소거능을 통한 항산화 효과 실험

화합물 1,1-Diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH, Sigma D9132-1G)는 에탄올 내에서 자유 라디칼을 발생하므로, 에탄올상에서 1,1-Diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH, Sigma D9132-1G)가 발생시키는 자유 라디칼(free radicals)에 대한 소거능을 시험함으로써 항산화 효과의 직접적인 작용 정도를 파악할 수 있다. 따라서, 순무, 순무 무청 및 순무 캘러스 추출물 시료와 혼합하여 자유 라디칼의 양이 어느 정도 감소하는지를 확인하였다. 구체적으로는 에탄올 0.4ml에 0.1mM의 DPPH 용액 0.5ml, 그리고 일정 농도로 희석된 시료 0.1ml를 첨가하였다. 10초간 강하게 볼텍싱(vortexing) 후 냉암소에서 30분간 반응시킨 후, ELISA를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다.

프리 라디칼 활성 저해율(%) = 100-{(각시료액의 반응흡광도/공시료액의 반응흡광도)X100}

정제수를 사용한 대조군과 비교하여, 순무 추출물의 경우, 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml 농도로 처리하였을 경우, 열수추출법에 의하여 16%, 51%, 56% 효과를 보였고, 초음파 추출법에 의하여 50%, 45%, 55% 효과를 보였고, 70% 에탄올 추출법에 의하여 21%, 66%, 68% DPPH 자유 라디칼 감소한 항산화 효과를 보였다(도 4 참조).

순무 무청 추출물의 경우, 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml 농도로 처리하였을 경우, 열수추출법에 의하여 19%, 59%, 54% 효과를 보였고, 초음파 추출법에 의하여 8%, 38%, 62% 효과를 보였고, 70% 에탄올 추출법에 의하여 36%, 58%, 41% DPPH 자유 라디칼이 감소한 항산화 효과를 보였다(도 4 참조).

순무 캘러스 추출물의 경우, 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml 농도로 처리하였을 경우, 열수추출법에 의하여 5%, 19%, 31% 효과를 보였고, 초음파 추출법에 의하여 6%, 19%, 36% 효과를 보였고, 70% 에탄올 추출법에 의하여 31%, 33%, 60% DPPH 자유 라디칼이 감소한 항산화 효과를 보였다(도 4참조).

< 실험예 2> 수렴 효과 실험 ( Astringent activity test )

수렴 효과 측정을 위해 피부단백질과 유사한 혈액 단백질인 헤모글로빈 (hemoglobin)을 사용하여 측정하였다. 원심분리관 용기에 각각의 시료용액과 헤모글로빈 용액(500ppm)을 1:1로 넣어서 진탕 혼합한 다음 1,500 rpm에서 3분간 원심분리 후 576 nm에서 흡광도를 측정하였다. 수렴 효과의 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

수렴효과(%) = (1-시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) × 100

순무 추출물의 경우, 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml 농도로 순무 추출물을 처리하였을

경우, 초음파 추출법 및 70% 에탄올 추출법은 수렴(astringent) 효과가 미비하였으나, 열수추출법에 의하여 1.9%, 11.9%, 12.0% 수렴(astringent) 효과를 보였다(도 5 참조).

순무 무청 추출물의 경우, 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml 농도로 순무 무청 추출물을 처리하였을 경우, 열수추출법에 의하여 1.6%, 4.8%, 6.1% 효과를 보였고, 초음파 추출법에 의하여 1.0%, 8.4%, 17.4% 효과를 보였고, 70% 에탄올 추출법에 의하여 2.1%, 9.1%, 21.5% 수렴(astringent) 효과를 보였다(도 5 참조).

순무 캘러스 추출물의 경우, 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml 농도로 순무 캘러스 추출

물을 처리하였을 경우, 열수추출법에 의하여 1.3%, 1.7%, 4.5% 효과를 보였고, 초음파 추출법에 의하여 0.0%, 2.3%, 6.4% 효과를 보였고, 70% 에탄올 추출법에 의하여 4.7%, 15.5%, 32.7% 수렴(astringent) 효과를 보였다(도 5 참조).

추출방법 및 농도별 순무, 순무 무청 및 순무 캘러스 추출물의 수렴(astringent) 활성을 측정한 결과, 열수 추출물에 비하여 70% 에탄올 추출물에 의한 수렴(astringent) 효과가 탁월하게 우수한 것을 확인하였다. 따라서 순무 캘러스 70% 에탄올 추출물의 경우 모공축소 및 피부 보호 작용이 우수한 화장품에 적용이 가능할 것으로 판단된다.

< 실험예 3> 피부 주름개선 효과 실험

콜라겐의 생성, 분해정도와 엘라스타제의 억제 정도를 실험하여 피부 주름개선 효과를 나타내는지 확인하였다.

1.1 세포주 선택 및 세포배양

사람섬유아세포(primary cell line) 또는 이와 유사한 섬유아세포(CCD-986sk)를 배양접시의 바닥에 접종한 후 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신(100 ㎍/mL), 10%FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 넣고 37℃를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기내에서 배양하였다.

1.2 콜라겐 양 측정

콜라겐 양을 측정하는 방법으로는 3H-Proline incorporation assay, Collagen mRNA 측정법, ELISA 방법 등이 있는데, 본 실험에서는 ELISA법을 사용하여 Krupsky M 등의 방법에 따라 콜라겐 양을 측정하였다(Krupsky M, Fine A, Berk JL, Goldstein RH. Retinoic acid-induced inhibition of type I collagen gene expression by human lung fibroblasts Biochimica et Biophysica Acta 1219:335-341. 1994).

구체적인 방법으로는 Antibody-PoD conjugate solution 100 ㎕를 well에 넣은 다음 1/5로 희석한 배양액 및 표준액 20 ㎕를 넣고 37℃에서 3시간 배양하였다. well에서 배양액을 제거한 다음 인산염완충액 (PBS) 400 ㎕로 4회 씻었다. 발색시약 100 ㎕를 넣고 상온에서 15분간 배양하고 1N 황산 100 ㎕을 넣은 다음 450nm에서 ELISA reader로 측정하였다. 표준액조제는 콜라겐 표준폼에 물을 넣어 녹여 각각 0, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640ng/mL가 되도록 희석하였으며, 시약은 Procollagen kit(Takara Biomedical Co.) 사용하여 PIP(procollagen type-1 peptide)의 농도를 측정하였다.

그 결과, 정제수를 사용한 대조군과 비교하여, 열수추출방법, 70% 에탄올 추출방법에 의하여 추출된 순무, 순무 무청 추출물의 경우, 1, 5 및 10 ppm 농도에서 PIP(procollagen type-1 peptide) 농도에 별다른 차이가 없었다. 그러나, 순무 캘러스 추출물의 경우, 열수 추출물과 달리 에탄올 추출물의 경우, 5 및 10 ppm 농도에서 PIP(procollagen type-1 peptide) 농도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

추출방법 및 농도별 순무, 순무 무청 및 순무 캘러스 추출물의 수렴(astringent) 활성을 측정한 결과, 순무 캘러스 70% 에탄올 추출물의 경우 피부 주름개선 효과가 우수한 화장품에 적용이 가능할 것으로 판단된다.

< 실험예 4> 순무, 순무 무청 및 순무 캘러스 소재의 용매 추출법에 따른 HPLC 분석 조건 확립

순무, 순무 무청 및 순무 캘러스 소재의 열수 추출, 초음파 추출 및 에탄올 추출물의 순도검증은 고성능액체크로마토그래피(High performance liquid chromatography; HPLC)를 이용하여 Waters 650E Advanced Protein Purification System 기기를 사용하여 정량분석을 하였다. 컬럼(Column)은 규격 250 * 4.60 mm, 5 micron인 Gemini 5u C18 110 A(Phenomenex 사) 컬럼을 사용하였으며, 1mL/min의 유속으로 230 nm (UV 램프)의 검출파장으로 분석을 했고, 용매로는 물 (Water) (0.1 % TFA (트리플루오로아세트산, Trifluoro acetic acid) 함유)과 아세토니트릴(Acetonitrile, ACN) (0.1 % TFA (트리플루오로아세트산, Trifluoro acetic acid) 함유)을 사용하였다. 인젝션 볼륨(Injection volumn)은 각각의 추출법에 의하여 얻어진 추출물을 필터하여 20㎕로 주입하여 각각의 추출물들의 순도검증을 수행하였다.

용매 기울기 조건은 표 1과 같다.

Time (min)	용매 A (%) 물	용매 B (%) ACN
0	100	0
40	20	80
45	20	90
46	100	0
51	100	0

순무, 순무 무청 및 순무 캘러스 소재의 열수 추출물, 초음파 추출물 및 에탄올 추출물을 이용하여 HPLC분석결과를 확인한 결과, 순무 캘러스 초음파 추출물 및 에탄올 추출물에서 설포라판(Sulforaphane) 물질(도 7 참조)과 같은 RT값을 보이는 peak를 확인하였다(도 10 참조).

< 제제예 1 > 화장수의 제조

상기 실시예 2에서 제조한 순무 캘러스의 70% 에탄올 추출물을 함유한 화장수의 성분 구성을 표 2에 나타내었다. 화장수의 제조는 당업계의 통상적인 방법에 따라 제조하였다.

	원료	함량(중량 %)
1	순무 캘러스의 70% 에탄올 추출물	5.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌 글리콜	2.0
4	프로필렌 글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌(60)경화 피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량
		100

< 제제예 2 > 로션의 제조

상기 실시예 2에서 제조한 순무 캘러스의 70% 에탄올 추출물을 함유한 로션의 성분 구성을 표 3에 나타내었다. 로션의 제조는 당업계의 통상적인 방법에 따라 제조하였다.

	원료	함량(중량 %)
1	순무 캘러스의 70% 에탄올 추출물	5.0
2	시토 스테롤	1.7
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
4	세라마이드	0.7
5	세테아레스-4	1.2
6	콜레스테롤	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4
8	글리세린	5.0
9	선플라우어오일	10
10	카르복시비닐폴리머	0.2
11	산탄검	0.3
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	향료	미량
15	정제수	잔량
		100

< 제제예 3 > 크림의 제조

상기 실시예 2에서 제조한 순무 캘러스의 70% 에탄올 추출물을 함유한 크림의 성분 성을 표 4에 나타내었다. 크림의 제조는 당업계의 통상적인 방법에 따라 제조하였다.

	원료	함량(중량 %)
1	순무 캘러스의 70% 에탄올 추출물	5.0
2	시토 스테롤	4.0
3	폴리글리세릴 2-올레이트	3.0
4	세라마이드	0.7
5	세테아레스-4	2.0
6	콜레스테롤	3.0
7	디세틸포스페이트	5.0
8	글리세린	5.0
9	선플라우어오일	22
10	카르복시비닐폴리머	0.5
11	트리에탄올아민	0.5
12	방부제	미량
13	향료	미량
14	정제수	잔량
		100

Claims

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순무의 열수 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부수렴 및 주름개선용 화장료 조성물.
순무 무청의 초음파 추출물 또는 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부수렴 및 주름개선용 화장료 조성물.
순무 캘러스의 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부수렴 및 주름개선용 화장료 조성물.
제7항에 있어서,
상기 순무 캘러스는 순무 종자로부터 발아가 유도된 순무 식물체의 줄기 또는 잎에서 캘러스가 유도된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 에탄올은 20% 내지 90%의 에탄올인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서,
상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 수분로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 수분크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스를 자연건조, 동결건조, 열풍건조 또는 저온건조에 의해 건조하는 1단계; 및
상기 순무, 순무 무청 또는 순무 캘러스 중량의 5배 내지 80배 부피의 정제수를 포함한 물, 또는 에탄올을 가하여 5분 내지 5 시간 동안 추출하여 여과하는 2단계를 포함하는 순무의 열수 추출물, 순무 무청의 초음파 추출물 또는 에탄올 추출물 또는 순무 캘러스의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 제5항 내지 제7항 중 어느 하나의 항의 항산화, 피부수렴 및 주름개선용 화장료 조성물의 제조방법.
제14항에 있어서,
상기 2단계의 여과된 추출액을 감압 농축하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물의 제조방법.
제14항에 있어서,
상기 순무 캘러스는 순무 종자로부터 발아가 유도된 순무 식물체의 줄기 또는 잎에서 캘러스가 유도된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물의 제조방법.
삭제
제14항에 있어서,
상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 수분로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 수분크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물의 제조방법.