KR101854766B1 - 미백 효능을 갖는 트리히드록시 이소플라본 및 감초 추출물의 복합체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물로, 트리히드록시 이소플라본 및 감초 추출물을 함유하여 감초 추출물의 세포 독성을 저감시키고 미백 효과가 우수한 미백용 조성물에 관한 것이다.

Description

미백 효능을 갖는 트리히드록시 이소플라본 및 감초 추출물의 복합체{SKIN WHITENING COMPLEX CONTAINING TRIHYDROXYISOFLAVONE AND GLYCYRRHIZA URALENSIS EXTRACTS}

본 발명은 감초 추출물을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 트리히드록시 이소플라본 및 감초 추출물을 함유하여 감초 추출물의 세포 독성을 저감시키고 미백 효과가 우수한 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색을 결정하는 데는 여러가지 요인들이 관여하는데, 그 중에서도 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드, 빌리루빈 등의 인체 내외의 색소 함유 유무 등의 요인들이 중요하다.

이중 특히 가장 중요한 요인은 인체 내의 멜라노사이트에서 타이로시나제 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소이다. 이 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인 등이 영향을 미친다.

신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 등 피부 내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 담당한다.

이와 같이 피부 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은, 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다. 그러나 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미나 주근깨, 점 등과 같은 과색소 침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다. 또한, 레저 인구의 증가로 외부에서 활동하는 것을 즐기는 사람들이 많아지면서 자외선에 의한 멜라닌 색소 침착을 막고자 하는 요구가 늘어나게 되었다.

이와 같은 요구에 부응하여 종전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체, 또는 타이로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용하여 왔으나, 이들의 불충분한 미백 효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합시 나타나는 제형 및 안정성의 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 피부 안전성 및 제품 안정성이 유지되면서 피부 미백 효과가 뛰어난 감초 추출물을 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 해결하기 위하여 본 발명은 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 트리히드록시 이소플라본은 3',4',7-트리히드록시 이소플라본, 다이드진 및 다이드제인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 트리히드록시 이소플라본은 트리히드록시 이소플라본를 함유하는 식물로부터 미생물을 이용하여 얻어지는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미생물은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움( bifidobacterium)속, 모르티에렐라(mortierella)속, 크립토코커스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물은 대두일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본 복합체를 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10중량% 함유하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 생성 억제를 통해 피부를 미백시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 색소 침착 개선을 통해 피부를 미백시키는 것일 수 있다.

본 발명에 의한 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물은, 피부 안전성 및 제품 안정성을 유지하면서도 피부 세포 사멸 억제, 멜라닌 생성 억제, 및 자외선(ultraviolet rays; UV)에 의해 생성된 색소 침착 개선에 따라 우수한 피부 미백 효과를 나타내므로, 피부 미백용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

이하에서는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예들에 관하여 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물의 일성분인 감초 추출물의 원료인 감초는 글라이시리자 유랄렌시스(Glycyrrhiza uralensis) 또는 리코라이스(Licorice)라고 불리기도 하며, 콩과의 다년생 초본으로 중국 동북부 및 아시아 각지에서 자라는 약용 식물이다. 본 발명에서 이용되는 감초 추출물은 감초의 다양한 기관, 조직 (예: 뿌리, 잎, 꽃, 줄기, 과실 및 종자 등) 등을 이용하여 수득할 수 있으며, 가장 바람직하게는 감초의 뿌리로부터 얻은 추출물이다. 상기 감초의 뿌리는 적갈색으로 땅 속 깊이 들어가고 줄기는 모가 지며 1 m 정도 곧게 자라고, 흰 털이 밀생하여 회백색으로 보이면서 점이 흩어져 있다. 뿌리는 단맛이 나서 한약재로 많이 사용된다. 감초는 글리시리진, 플라보노이드, 사포닌, 쿠마린, 탄닌 및 효소 등을 많이 함유하고 있어 자외선에 의해 만들어진 유해 산소를 제거하고, 멜라닌의 광산화를 방지하여 주며 피부를 하얗고 투명하게 가꿔 주는 역할을 한다.

감초로부터 추출물을 얻는 방법은 종래에 알려진 방법을 이용하여 감초 추출물을 수득할 수 있다. 바람직하게는, 감초를 분쇄하여 열수로 추출하여 사용하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 조성물의 또 다른 일성분인 트리히드록시 이소플라본은 3',4',7-트리히드록시 이소플라본, 다이드진 및 다이드제인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 3',4',7-트리히드록시 이소플라본은 하기 화학식 1과 같이 표현될 수 있다.

[화학식 1]

상기 트리히드록시 이소플라본은 일반적인 화학 합성 방법에 의해 제조된 것일 수 있다.

또한, 상기 트리히드록시 이소플라본은 이를 함유하는 식물로부터 미생물을 이용하여 얻어지는 것일 수 있다. 트리히드록시 이소플라본을 함유하는 식물이면 어느 것도 상관없으나, 바람직하게는 대두가 사용될 수 있다.

보다 구체적으로, 미생물을 이용한 반응을 통해 트리히드록시 이소플라본을 얻는 방법의 예를 들어보도록 한다.

먼저, 대두 또는 대두 배아에 약 1 내지 6 배, 바람직하게는 약 3배의 물 또는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매 또는 이들 유기용매와 물과의 혼합용매를 넣는다. 그 후, 상온에서 1 내지 5회 교반하면서 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 식물에 약 1 내지 8 배, 바람직하게는 약 4 배의 물 또는 상기 유기용매를 넣고, 1 내지 5회 환류 추출한 후, 10 내지 20℃에서 1 내지 3일간 침적시킨 후, 여과와 원심분리를 통하여 잔사와 여액을 분리한다. 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 등을 이용하여 색소를 제거한 다음, 수층을 상기 유기용매를 사용하여 1 내지 5회 추출한 후, 수득한 유기용매층을 감압농축하여 상기 유기용매 엑기스를 얻는다. 이를 소량의 메탄올 등에 녹인 후, 대량의 에틸아세테이트 등을 추가하여 생성된 침전물을 건조시켜, 본 발명의 상기 다이드진 또는 다이드제인을 함유하는 추출물을 수득할 수 있다.

　그 다음 상기 다이드진 또는 다이드제인을 함유하는 추출물을 미생물을 이용한 반응을 통하게 하여 3`,4`,7-트리히드록시 이소플라본을 제조한다.

상기 다이드진 또는 다이드제인을 함유하는 추출물을 5 내지 10배, 바람직하게는 약 10배의 이온수에 용해시킨 후 121℃에서 30분간 멸균하여 30 ℃로 냉각한 후 미리 배양된 미생물을 액체량 대비 5~10% 로 접종하여 30℃에서 2 내지 5일 배양 시킨 후 5,000 내지 10,000 rpm 으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척 후 원심분리하여 침전물로써 반응액을 수득할 수 있다.　

상기 미생물은 엑소 당결합 분해 효소를 생산하는 미생물과 히드록시기를 전달할 수 있는 효소를 생산하는 미생물을 사용한다. 바람직하게 상기 미생물은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움( bifidobacterium)속, 모르티에렐라(mortierella)속, 크립토코커스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

미생물이 생산하는 효소는 다이드진에서 당 부분을 제거하여 다이드제인을 생성하고 여기에 수산화기를 전달하여 3`,4`,7-트리히드록시 이소플라본을 제조할 수 있다.

상기와 같이 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 3`,4`,7-트리히드록시 이소플라본을 제조한 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 알코올을 가하여 1 내지 5회 교반시킨 후, 침전된 염들을 여과를 통하여 제거하고, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하고, 상기 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름: 메탄올= 8:1 내지 4:1)로 분리하여 일정량의 3`,4`,7-트리히드록시 이소플라본을 수득할 수 있다.　

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본 복합체를 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10중량% 함유하는 것일 수 있다. 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본 복합체가 조성물 총 중량에 대하여 0.0001중량%보다 적게 함유되면 미백 효과가 충분히 나타나지 않고, 10중량%보다 많이 함유되면 함량 증가에 비하여 효과의 증가가 크지 않기 때문이다.

상기 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본의 복합체는, 상기 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본을 1:10 내지 100:1의 중량비로 함유하는 것일 수 있다. 상기 범위 외인 경우, 감초 추출물 또는 트리히드록시 이소플라본 일방의 함량이 너무 적게 되어 시너지 효과를 얻기 어려울 수 있다.

피부색 결정 요인 중에서 가장 큰 부분을 차지하는 것이 피부 중 멜라닌의 분포상태 및 양이다. 멜라닌 생산에 영향을 미치는 인자는 여러 가지가 알려져 있는데, 자외선에 의하여 일어나는 멜라닌 생산의 증가 및 이에 따른 색소 침착이 화장품 분야에서 아주 중요하다.

본 발명에 따른 조성물은 멜라닌 생성을 억제하는 효과를 달성하여 이를 통해 피부를 미백시킨다. 이를 하기 실험예 2에서 확인할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 자외선에 의한 색소 침착을 저하시킴으로써 피부를 미백시킨다. 이를 하기 실험예 3에서 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 미백용 조성물은 예를 들어, 약학 조성물 또는 화장료 조성물일 수 있다.

상기 피부 미백용 약학 조성물에는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 비경구 투여 형태로 경피 투여형 제형일 수 있으며, 예를 들어 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 약물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 미만 진행 정도, 발병 시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 상기 조성물 1㎍/kg 내지 200mg/kg, 바람직하게는 50㎍/kg 내지 50mg/kg을 1일 1 내지 3회 분할하여 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

상기 피부 미백용 화장료 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 유효 성분의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 상기 유효 성분이 상기 함량을 만족하는 경우 부작용 없이 우수한 효능을 나타낼 수 있다.

상기 화장료 조성물에는 상기 제조된 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본 복합체 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

이하의 실시를 통하여 본 발명이 더욱 상세하게 설명된다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 이들만으로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1]

1-1. 트리히드록시 이소플라본의 미생물 반응을 통한 제조

(1) 대두 추출물의 제조

대두 2 ㎏에 각각 헥산 6 ℓ를 넣고, 상온에서 3회 교반 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 대두 1 kg에 80 % 메탄올 4 ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 후, 15 ℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 1 ℓ로 5회 추출하여 색소를 제거하고, 수층을 1-부탄올 500 ㎖로 3회 추출하였다. 이로부터 얻은 총 1-부탄올 층을 감압농축하여 1-부탄올 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올에 녹인 다음, 대량의 에틸아세테이트에 추가하여, 생성된 침전물을 건조함으로써, 대두 추출물 300 g을 수득하였다.

(2) 미생물을 이용한 3',4',7-트리히드록시 이소플라본의 제조

상기 (1)에서 수득한 대두 추출물 10 g을 100 ㎖의 이온수에 용해시키고, 121 ℃에서 30분간 멸균하여 30 ℃로 냉각한 후 미리 배양된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) KCCM 11885를 액체량 대비 5~10 %로 접종하여 30 ℃에서 7일 동안 배양시킨 후, 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료시켰다. 이 배양액을 5,000 내지 10,000 rpm으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척 후 원심분리하여 침전물로써 반응액을 얻은 다음, 상기 침전물에 에탄올(200㎖)을 가해 교반시킨 후(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거하였다. 그 다음, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였다. 이후 상기 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름: 메탄올 = 8:1 ~ 4:1)로 분리하여 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 0.12 g을 수득하였다.

1-2. 감초 추출물의 제조

감초 2 ㎏를 분쇄하여 열수 4 ℓ를 넣고 3회 환류 추출한 후, 15 ℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분무 건조하여 감초 추출물 400 g을 수득하였다.

1-3. 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본 복합체의 제조

상기 방법으로 제조된 감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본을 60: 1 의 비율로 혼합한 후, 즉 감초추출물 6g 과 트리히드록시 이소플라본 0.1g 의 비율로 혼합한 후, 추출물 총 중량 대비 10배의 70% 에탄올 수용액으로 재추출하고 원심분리와 여과포 여과를 통해 잔사와 여액을 분리하였다. 그 후 감압 농축하여 감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 복합체를 제조하였다.

[ 실험예 1] 세포 독성 시험

상기 실시예 1에서 얻은 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본 복합체와, 비교예로서 상기 실시예 1-2에서 얻은　감초 추출물에 관하여, 쥐의 색소세포에서의 세포 독성 정도를 확인하였다.

C57BL/6 마우스 유래의 쥐의 색소세포(Mel-Ab cell)(Dooley, T.P. et al, Skin pharmacol, 7, pp 188-200)를 DMEM(Dulbeccos modified Eagles media)에 10% 우태반 혈청, 100nM 2-O-테트라데카노일포르빌(tetradecanoyphorbol)-13-아테이트, 1nM 콜레라 독소(cholera toxin)을 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 배양된 Mel-Ab세포를 0.25% 트립신-EDTA로 떼어내고, 24-웰 플레이트에 10⁵ 세포/웰(cells/well)의 농도로 세포를 배양하고 상기 실시예 및 비교예의 샘플을 처리하고 24시간 동안 배양한 후 인산염 완충용액(pH 7.2)로 세척하여 0.1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet. 시그마), 10% 에탄올(Et-OH)을 이용 5분 동안 상온에서 염색하였다. 염색 되지 않은 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 완전히 제거 한 다음, 인산염 완충용액(pH 7.2)로 3회 세척하였다. 그 후 염색된 세포로부터 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 추출하기 위하여 95% 에탄올(Et-OH)을 1시간 동안 상온에서 처리하였으며, 추출액을 PerkinElmer (Lambda 25 spectrophotometer) 540 nm 파장에서 측정, 흡광도를 통하여 세포의 생존율을 비교하였다. 세포의 생존율은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

[수학식 1]

생존율 = (A / B) ⅹ 100

A: 샘플 첨가한 흡광도

B: 샘플 첨가하지 않은 흡광도

시험물질	세포 생존율(%)
감초 추출물	29.6
감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 복합체	98.6

상기 표 1에 나타낸 바와 같이,　본 발명에 따른 감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 복합체는 감초 추출물 단독의 경우에 비하여 피부 세포의 독성을 현격히 감소시키는 것으로 확인되었다.

[ 실험예 2] 쥐의 색소세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정

상기 실시예 1에서 얻은 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본 복합체와, 비교예로서 상기 실시예 1-2에서 얻은　감초 추출물 및 상기 실시예 1-1에서 얻은 3',4',7-트리히드록시 이소플라본에 관하여,　멜라닌 생성 억제효과를 알아보기 위하여 쥐의 색소세포를 이용하여 측정하였다.

먼저, C57BL/6 마우스 유래의 쥐의 색소세포(Mel-Ab cell)(Dooley, T.P. et al, Skin pharmacol, 7, pp 188-200)를 DMEM(Dulbeccos modified Eagles media)에 10% 우태반 혈청, 100nM 2-O-테트라데카노일포르빌(tetradecanoyphorbol)-13-아테이트, 1nM 콜레라 독소(cholera toxin)을 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 배양된 Mel-Ab세포를 0.25% 트립신-EDTA로 떼어내고, 24-웰 플레이트에 10⁵ 세포/웰(cells/well)의 농도로 세포를 배양하고 이틀째부터 3일 연속으로 10ppm의 각 시험물질로 하이드로퀴논, 상기 실시예로부터 수득한 감초 추출물, 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 및 이의 복합 컴플렉스를 가하여 배양하였다. 이때, 상기 하이드로퀴논은 양성대조군으로 사용하였다. 그 다음 배양액을 제거하고, PBS로 세척한 후, 1N 수산화나트륨으로 세포를 녹여 400nm에서 흡광도를 측정한 후, 하기 수학식 2에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하여(Dooley의 방법) 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[수학식 2]

시험물질	멜라닌 생성 억제율(%)
감초 추출물	30.3
3',4',7-트리히드록시이소플라본	60.6
감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시이소플라본 복합체	85.5
하이드로퀴논(양성대조군)	58.9

상기 표 2에 나타낸 바와 같이,　본 발명에 따른 감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 복합체는 하이드로퀴논, 감초 추출물 단독 및 3',4',7-트리히드록시이소플라본 단독의 경우와 비교하여 현저하게 우수한 멜라닌 생성 억제율을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 상기 감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 복합체는 우수한 미백용 조성물임을 알 수 있었다.

[ 실험예 3] 인체 피부에 대한 미백 효과 시험

　상기 실시예 1에 의해 제조된 감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 복합체의 인체 피부에 대한 미백 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 미백 효과 실험을 수행하였다.

먼저, 건강한 12명의 남자를 대상으로 피검자의 상박 부위에 직경 1.5㎝의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5 ~ 2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다.

상기 자외선 조사 후 시험물질로 상기 실시예 1로부터 수득한 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 및 감초 추출물 복합체를　 각 1% (용매는 1,3-부틸렌그리콜:에탄올 = 7:3), 하이드로퀴논(양성 대조군) 각 1%,　 용매(vehicle)(음성 대조군) 1% 만을 바르고, 한 곳은 아무 것도 바르지 않고 10 주 동안 상태변화를 관찰했다. 1주 단위로 피부의 색깔을 색차계 CR2002(일본, 미놀타 사)로 측정하였다.

그 다음 상기 각 시험물질의 도포 개시시점과 도포 완료시점에서의 피부색의 차이(△L*)를 하기 수학식 3에 따라 계산하고, 이를 하기 표 3에 나타내었다. 한편, 미백 효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 △L*의 비교로 판정하는데, △L*값이 2 정도일 경우는 침착된 색소의 미백화가 뚜렷한 경우이고, 1.5정도 이상이면 미백효과가 있다고 판정할 수 있다.

[수학식 3]

△L* = 도포 완료시점에서의 L*값 - 도포 개시시점에서의 L*값

시험물질	피부색 밝기 정도(△L*)
감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 복합체	1.94± 0.13
하이드로퀴논(양성 대조군)	1.70± 0.11
용매(Vehicle)(음성 대조군)	0.50± 0.15

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 복합체는 하이드로퀴논보다 우수한 피부색 밝기 정도를 보임을 확인하였다. 이는 감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 복합체가 피부 세포의 사멸을 억제하고, 자외선에 의해 생성된 색소 침착을 개선하여 피부색을 밝게 하기 때문이다.

본 발명의 감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 복합체를 함유하는 조성물의 제형예를 하기에서 설명하지만, 본 발명의 조성물이 이 예로만 한정되는 것은 아니다.

[ 제형예 1] 로션형 제형

실시예 1의 감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 복합체 3.00

L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 1.00

수용성 콜라겐 (1% 수용액) 1.00

시트르산나트륨 0.10

시트르산 0.05

감초 엑기스 0.20

1,3-부틸렌글리콜 3.00

정제수 잔량

(단위: 중량%)

[ 제형예 2] 크림형 제제

실시예 1의 감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 복합체 1.00

폴리에틸렌글리콜모노스테아레이트 2.00

자기유화형 모노스테아르산글리세린 5.00

세틸알코올 4.00

스쿠알렌 6.00

트리2-에틸헥산글리세릴 6.00

스핑고당지질 1.00

1,3-부틸렌글리콜 7.00

정제수 잔량

(단위: 중량%)

[ 제형예 3] 팩형 제제

실시예 1의 감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 복합체 5.00

폴리비닐알코올 13.00

L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 1.00

라우로일히드록시프롤린 1.00

수용성 콜라겐 (1% 수용액) 2.00

1,3-부틸렌글리콜 3.00

에탄올 5.00

정제수 잔량

(단위: 중량%)

[ 제형예 4] 미용액형 제제

실시예 1의 감초 추출물 및 3',4',7-트리히드록시 이소플라본 복합체 2.00

히드록시에틸렌셀룰로오스 (2% 수용액) 12.00

크산탄검 (2% 수용액) 2.00

1,3-부틸렌글리콜 6.00

진한 글리세린 4.00

히알루론산나트륨 (1% 수용액) 5.00

정제수 잔량

(단위: 중량%)

Claims (9)

1. 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본 복합체를 유효성분으로 함유하며, 상기 트리히드록시 이소플라본은 감초 추출물의 독성을 감소시키는 것이며,
   상기 트리히드록시 이소플라본은 3',4',7-트리히드록시 이소플라본인 피부 미백용 조성물.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서,
   상기 트리히드록시 이소플라본은 트리히드록시 이소플라본를 함유하는 식물로부터 미생물을 이용하여 얻어지는 것인 피부 미백용 조성물.
4. 제 3항에 있어서,
   상기 미생물은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움(bifidobacterium)속, 모르티에렐라(mortierella)속, 크립토코커스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 피부 미백용 조성물.
5. 제 3항에 있어서,
   상기 식물은 대두인 피부 미백용 조성물.
6. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본 복합체를 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10중량% 함유하는 것인 피부 미백용 조성물.
7. 제 1항에 있어서,
   상기 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본 복합체는, 상기 감초 추출물 및 트리히드록시 이소플라본을 1:10 내지 100:1의 중량비로 함유하는 것인 피부 미백용 조성물.
8. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 멜라닌 생성 억제를 통해 피부를 미백시키는 것인 피부 미백용 조성물.
9. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 색소 침착 개선을 통해 피부를 미백시키는 것인 피부 미백용 조성물.