KR100949001B1

KR100949001B1 - 순무 추출물을 포함하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR100949001B1
Application number: KR1020070131999A
Authority: KR
Inventors: 백남인; 이경태; 최명숙; 정태숙; 정해곤; 방면호; 이대영; 김종빈
Original assignee: 강화군
Priority date: 2007-12-17
Filing date: 2007-12-17
Publication date: 2010-03-23
Also published as: KR20090064702A

Abstract

본 발명은 순무 추출물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 특히 순무로부터 추출한 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴(4-methoxyindole-3-acetonitrile)을 유효성분으로 포함하여 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환뿐 아니라 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

4-메톡시인돌-3-아세토니트릴, 순무, 시스플라틴, 신장 독성, 항암제, 심장순환계 질환

Description

순무 추출물을 포함하는 약학 조성물 {Pharmaceutical composition containing Brassica camperstris ssp rapa}

본 발명은 순무 추출물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 순무로부터 추출한 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴(4-methoxyindole-3-acetonitrile)을 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환과 심장순환계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

암(cancer)은 전 세계적으로 연간 약 700만 명의 사망 원인이 되는 질병이며, 특히 우리나라에서는 지난 통계청의 『2000년 사망원인 통계연보』(2000년 사망 자료 분석 결과)에 의하면, 암으로 인한 사망은 23.5%로 전체 사망원인 중 1위를 차지하고 있어 국가차원의 암 관리 대책이 요구되고 있다. 현재 암을 치료하는 방법으로 수술, 방사선 치료, 유전자 치료 등 여러 방법들이 사용되고 있으나, 가장 많이 사용되고 있는 치료방법 중의 하나가 항암제를 투여하는 화학요법(chemotherapy)이다.

항암 화학요법은 전신 치료로, 대부분 주사나 경구로 항암제를 투여하면 혈류를 따라 전신에 퍼진다. 그러므로 국소적인 효과보다는 전신에 퍼져있는 미세전 이(micometastasis)에 작용하는 치료이다. 따라서 전신적인 부작용이 많으며 수술이나 방사선치료에 비해서 그 정도가 매우 심한 편이다. 정상세포와 암세포 간의 약물에 대한 감수성 차를 이용하여 항암제가 암세포에 대해 선택적으로 작용하도록 하는 것이 화학요법이나 대부분의 항암제가 정상세포와 암세포를 구별하지 못하여 용량 제한적 특성(dose-limiting toxicity)을 나타내는데 그 문제점이 있다.

대표적인 항암제인 시스플라틴(cis-diammine-dichloroplatinum [Ⅱ])은 난소암, 방광암, 폐암, 두경부암, 고환암 등의 치료를 위한 화학요법제로 임상에서 널리 사용되고 있다(Rosenberg B., Cancer, 55: pp2303-2315, 1985). 시스플라틴은 활성산소종을 생성하여 암세포를 공격하고, 암세포에서 DNA의 인터-인트라스트랜드 교차결합(inter-intrastrand cross-linking), DNA 부가체 형성을 유도하여 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 치료과정 중 약물의 제한된 함량 이상에서는 청각의 상실, 신경 독성, 신장 독성과 같은 부작용이 나타나며(Mollman et al., 1998; Screnci and McKeage, 1999), 고농도의 시스플라틴의 투여 시에는 간 독성 또한 빈번하게 관찰되는 것으로 알려져 있다(Cerosimo R. J., Ann. Pharm., 27: pp438-441, 1993; Cavalli F. et al., Cancer Treat. Rep., 62: pp2125-2126, 1978; Pollera C. F. et al., J. Clin. Oncol., 5: pp318-319, 1987). 시스플라틴에 의한 이러한 부작용은 시스플라틴에 의해 생성된 활성산소종으로 인한 지질 과산화의 증가(Matsushima H. et al., J. Lab. Clin. Med., 131: pp518-526, 1998; Koc A. et al., Mol. Cell Biochem., 278(1-2): pp79-84, 2005), 조직에 존재하는 항산화 효소 활성의 억제(Sadzuka Y. et al., Biochem. Pharmacol., 43: pp1873- 1875, 1992), 글루타시온(glutathione)의 고갈(Zhang J. G. and Lindup W. E., Biochem. Pharmcol., 45: pp2215-2222, 1993) 및 세포내 칼슘 항상성의 붕괴(Zhang J.G. and Lindup W.E., Toxicology in Vitro, 10: pp205209, 1996)와 밀접한 관련이 있다.

최근 시스플라틴과 글루타시온 에스테르(glutathione ester)를 같이 투여하였을 때 시스플라틴으로 인한 신장 독성이 효과적으로 억제된다는 것을 관찰하였으며(Babu E. et al., Mol. Cell Biochem., 144: pp7-11, 1995) 식이를 통해 항산화 물질을 섭취함으로써 시스플라틴으로 인한 독성을 억제하는데 많은 관심이 집중되고 있다(Appenroth D. et al., Arch. Toxicol., 71: pp677-683, 1997; Bogin E. et al., Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 32: pp843-851, 1994; Rao M. et al., J. Biochem., 125: pp383-390, 1999).

시스플라틴을 비롯한 많은 화학요법제들이 활성산소종을 생성하여 암세포를 공격하는 것으로 알려져 있고, 생성된 활성산소종들은 정상세포에도 작용하여 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 따라서 항산화효과를 가지는 물질들은 화학요법제에 의해 유발된 독성을 감소시킬 가능성이 높다. 또한, 활성산소종이나 라디칼을 생성하는 외부 유해물질에 의한 간 독성 및 신장 독성도 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 생각된다.

최근 성인병 증가와 더불어 동맥경화 등의 혈관장애 질환이 크게 증가하고 있다. 대표적인 혈관장애 질환으로서 동맥경화는 지질대사와 관련된 유전적 요인과 식습관, 흡연, 운동부족 등의 환경적 요인에 의하여 동맥이 경화되는 질환으로, 뇌 동맥 또는 관상동맥에서 일어나기 쉬우며, 이로 인하여 심장질환, 뇌혈관 질환 등의 순환계 질환으로 발전하게 된다. 뇌동맥경화의 경우에는 두통, 현기증, 정신장애 등을 나타내고 뇌연화증의 원인이 되며, 관상동맥경화의 경우에는 심장부에 동통과 부정맥을 일으켜 협심증, 심근경색 등의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 또한, 이로 인해 고혈압, 심장병, 뇌일혈 등이 유발되어, 동맥경화로 인한 질병이 현대 사회에 있어 특히 50~60 대 남성들에게 가장 큰 사망요인으로 부각되고 있다.

혈관 내벽의 플라그(plaque) 형성 및 혈관파열은 심근경색 발병의 주요한 요인이며, 동맥경화의 초기 발생에 관한 가설은 혈관벽의 손상에 대한 만성 염증과정으로 손상기작 보다는 오히려 방어기작인 '손상에 대한 반응(response-to-injury hypothesis)'으로 제시되고 있다(Nature 1993, 362, 801-809). 이는 유전적 변이, 과산화물, 고혈압, 당뇨, 혈장 호모시스테인 농도 증가 또는 미생물 감염 등의 원인에 의하여 혈관 내피세포가 정상적인 항상성을 유지하지 못하는 기능부전 상태가 되는 것이다.

또한, 혈중 콜레스테롤 농도가 높으면 관상동맥성 심혈관 질환이 유발되기 쉬우므로 혈중 콜레스테롤 농도를 줄이기 위해서는 콜레스테롤 및 지방의 섭취를 줄이는 식이요법을 시행하거나 지질대사와 관련된 효소를 저해함으로써 콜레스테롤의 흡수를 억제해야 한다. 이에, 콜레스테롤을 에스테르화하는 효소인 아실 코에이: 콜레스테롤 아실 전이효소(acyl-CoA: cholesterol acyltransferase; ACAT)에 관한 연구가 많이 행해지고 있다.

ACAT의 작용 기작은 크게 체내의 장, 간 및 혈관벽 세포의 세 부위에서 일어 난다.

첫째, 장에서 ACAT는 섭취된 콜레스테롤을 에스테르의 형태로 바꾸어 장내로 흡수되는 것을 촉진시킨다. 둘째, 외부로부터 흡수되거나 체내에서 생합성된 콜레스테롤은 간에서 VLDL(very low-density lipoprotein)이라는 운반체 안에 축적된 후 혈관을 통해 신체 각 기관으로 공급되는데, 이때 ACAT에 의하여 콜레스테롤이 콜레스테릴 에스테르 형태로 전환됨으로써 운반체 내에 콜레스테롤 축적이 가능하게 된다. 셋째, 동맥혈관벽을 이루는 세포 내에서 ACAT는 콜레스테롤을 그의 에스테르 형태로 전환시켜 세포 내에 콜레스테롤이 축적되는 것을 촉진시키는데, 이는 동맥경화를 일으키는 직접적인 원인이 된다. 또한, ACAT 활성에 의해 거품세포가 콜레스테롤로부터 유도된 다량의 콜레스테릴 에스테르를 포함하기 때문에 실험적, 임상적인 측면에서 대식세포와 평활근세포로부터 유도된 거품세포의 형성은 매우 중요하다. 혈관벽 내의 거품세포의 증식은 ACAT 활성 증가와 직접적으로 연관되어 있기 때문에 강력한 항동맥경화제로서 ACAT 저해제의 개발은 바람직하다.

따라서, ACAT의 활성을 억제하는 약물은 첫째 장내 콜레스테롤의 흡수를 억제하여 체내로 유입되는 콜레스테롤의 양을 감소시킬 수 있을 것이며, 둘째 간에서 혈관 내로 콜레스테롤이 방출되는 것을 억제하여 혈중 콜레스테롤 농도를 떨어뜨릴 수 있고, 셋째 혈관벽 세포에 콜레스테롤이 축적되는 것을 방지하여 직접적으로 동맥경화를 예방할 수 있을 것으로 기대된다.

지금까지 보고된 ACAT 활성 저해제는 쥐간 마이크로좀 ACAT 또는 쥐간 대식세포(J774) ACAT에 대한 활성 저해제이다. 사람의 ACAT에는 hACAT-1(50 kDa) 및 hACAT-2(46 kDa)가 있는데, hACAT-1은 성인의 간, 부신, 대식세포, 신장에서 주로 작용하며, hACAT-2는 소장 및 간에서 작용한다(Rudel, L. L. et al., Curr. Opin. Lipidol. 12, 121-127, 2001). 사람 ACAT 활성을 저해하는 물질은 음식으로부터 유입되는 콜레스테롤의 흡수를 억제하고, 혈관 내벽에 콜레스테릴 에스테르의 축적을 억제하는 기작을 통해 고콜레스테롤증, 콜레스테롤 결석 또는 동맥경화 예방 및 치료제의 표적이 되고 있다(Buhman, K. K. et al., Nature Med. 6, 1341-1347, 2000).

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 본 발명은 시스플라틴 등의 항암제 투여시 항암제의 항암 효능을 증진시키면서 동시에 항암제에 의한 신장 독성을 억제할 수 있는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 시스플라틴으로 인한 신장 독성에 관한 억제 활성을 갖는 항암보조제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 항산화 활성(또는 아실 코에이:콜레스테롤 아실 전이효소 억제 활성)을 가져 LDL의 산화(또는 콜레스테릴 에스테르의 합성 및 축적)로 유발되는 고지혈증, 뇌동맥, 관상동맥 심장병, 동맥경화, 심근경색 등에 유용하게 사용될 수 있는 심장순환계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴(4-methoxyindole-3-acetonitrile)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴은 순무로부터 추출되며, 약학 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 99 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

또한, 본 본 발명은 항암제에 의해 유발되는 신장 독성에 대한 억제 활성을 갖는 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴을 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴(4-methoxyindole-3-acetonitrile)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 심장순환계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

바람직하게, 상기 심장순환계 질환은 고지혈증, 뇌동맥, 관상동맥 심장병, 동맥경화 또는 심근경색이다.

본 발명의 약학 조성물은 기존 항암제인 시스플라틴의 투여시 시스플라틴의 항암 효능을 증진시키면서 동시에 시스플라틴에 의한 신장 세포의 사멸을 억제하고, 시스플라틴에 의해 생성된 ROS 저해, 시스플라틴에 의한 지잘과산화 저해 글루타티온(glutatione) 고갈 저해 등 항암제에 의해 유발되는 신장 독성을 예방 및 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 항산화 활성(또는 아실 코에이:콜레 스테롤 아실 전이효소 억제 활성)을 가져 LDL의 산화(또는 콜레스테릴 에스테르의 합성 및 축적)로 유발되는 고지혈증, 뇌동맥, 관상동맥 심장병, 동맥경화, 심근경색 등에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 약학 조성물은 순무로부터 추출한 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴을 유효성분으로 포함하여 기존 항암제인 시스플라틴에 의한 세포고사를 방지하여 신장 독성의 부작용을 감소시킬 수 있으며, 고지혈증, 뇌동맥, 관상동맥 심장병, 동맥경화, 심근경색 등 심장순환계 질환을 예방 및 치료할 수 있다.

상기 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴은 순무 뿌리부분 생체 중 껍질과 속 부분을 구분한 뒤 속 부분에 C₁ 내지 C₄의 저급알코올, 바람직하게는 메탄올에 담가 반복 정치 추출하고 여과한 후, 감압농축하고 이들을 통상의 분획 공정을 수행하여 얻을 수 있다.

구체적으로, 순무(Brassica camperstris ssp rapa) 뿌리부분 생체 중 100㎏을 껍질과 속 부분을 구분하고 세절하여 속 부분(48 ㎏)을 MeOH 80% 수용액(18ℓ×5)으로 두 차례 걸쳐 추출한 후 여과지로 여과한다. 이렇게 얻어진 여액을 45℃에서 감압 농축하여 MeOH 추출물을 얻는다. 상기 얻어진 MeOH 추출물을 EtOAc(3ℓ×2)/H₂O(3ℓ)로 분배 추출하고, 다시 H₂O층을 n-BuOH(3ℓ×2)/H₂O(3.2ℓ)로 분배 추출한다. 그 다음, 각 층을 감압 농축하면 EtOAc, n-BuOH 및 H₂O 분획을 얻을 수 있 다.

상기 EtOAc 분획에 대하여 실리카 겔 컬럼크로마토그라피(silica gel column chromatography, φ 5×22 ㎝, n-hexane:EtOAc=10:1→5:1→3:1→1:1→CHCl₃:MeOH=10:1→7:1→5:1→3:1→2:1→1:1)를 실시하면 18개의 분획물(BRE-1～BRE-18)을 얻을 수 있다. 상기 18개의 분획물 중 BRE-9 분획에 대하여 ODS c.c.(φ 3.5×12 ㎝, MeOH:H₂O=1:1)로 정제하여 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴(BRE9-3, MeOH:H₂O=3:1)을 추출할 수 있다.

상기와 같이 추출한 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴은 하기 화학식 1로 표시된다.

상기 화학식 1의 화합물(coloress powder)은 TLC에 전개시켜 관찰한 결과 UV 흡수가 있고, 10% aq. H₂SO₄로 분무, 건조 및 가열할 경우 진한 녹색으로 발색된다. EI/MS 스펙트럼으로부터 m/z 186 [M]⁺의 peak가 관측되고, IR 스펙트럼으로부터, 3396 cm^-1에서 하나의 강한 흡수 밴드가 확인됨으로 이차 amine기를 확인할 수 있다. ^IH-NMR (400MHz, CDCl₃) spectrum에서 [δ_H 7.11(1H, dd, J=8.0, 8.0 Hz H-6), 7.03(1H, s, H-2), 6.95(1H, d, J=8.0 Hz, H-5), 6.49(1H, d, J=8.0 Hz, H-7)]를 나타내었으며, proton signal로부터 1,2,3-삼 치환 벤젠 구조의 indole 화합물로 예측할 수 있었다. 또한 δ_H 4.21(3H, s)에서 methoxy proton signal과 δ_H 4.08(2H, s)에서 methylene proton signal이 관측된다. ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) spectrum에서는 11개의 탄소 signal이 관측된다. 따라서 상기 화학식 1의 화합물은 한 개의 methoxy기와 acetonitrile이 결합되어 있는 indole화합물로 판단되어 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴(arvelexin)로 구조 결정하고, 기존의 문헌과 비교하여 구조를 확인 동정할 수 있었다.

상기 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴이 근위세뇨관 세포주인 LLC-PK1에서 기존 항암제인 시스플라틴(cisplatin)의 사용에 의한 세포고사를 방지함을 확인함으로써 항암제에 의해 유발되는 신장 독성을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명은 상기와 같은 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴을 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 예방 및 치료용 약학 조성물 및 항암보조제를 제공한다. 상기 항암보조제는 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 독소루비신, 탁솔, 탐옥시펜, 캄토벨, 아드루실, 글리벡, 에토포사이드, 조메타, 온코빈 등의 기존 항암제와 병용 투여하여 항암 효능을 증진시킬 수 있다.

또한 본 발명은 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴을 유효성분으로 포함하는 심장순환계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 바, 상기 심장순환계 질환은 고지혈증, 뇌동맥, 관상동맥 심장병, 동맥경화 또는 심근경색이다.

상기 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴은 본 발명의 약학 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 99 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 그 함량이 상기 범위 내일 경우에는 기존 항암제인 시스플라틴에 의한 세포고사를 효율적으로 방지할 수 있어 신장 독성의 예방과 치료뿐 아니라, 고지혈증, 뇌동맥, 관상동맥 심장병, 동맥경화, 심근경색 등 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 있어 더욱 좋다.

상기 약학 조성물에는 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함될 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물의 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타약학적 활성 화합물과 결합뿐 아니라 적당한 집합으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 약학 조성물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여 량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시하나, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

[실시 예]

이하 실시 예들에서 사용된 실험재료로 LLC-PK1(돼지 신장의 근위세뇨관 세포주)은 American Type Culture Collection에서 분양받아 사용하였다. M199 배지, fetal bovine serum(FBS), penicillin 및 streptomycin은 Life Technologies Inc의 것을 사용하였다. 또한, 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tertazolium bromide(MTT), dimethylsulfoxide(DMSO), N-actetyl cysteine(NAC), cisplatin, DCFH-DA, H₂O₂, butanol, acetic acid, thiobarbituric acid, pyridine, sodium dodecyl sulfate(SDS)는 Sigma Chemical Co.의 것을 사용하였다. Glutathione kit는 Oxisresearch(USA)의 것을 사용하였다.

실시 예 1. 4- 메톡시인돌 -3- 아세토니트릴 추출

순무(Brassica camperstris ssp rapa) 뿌리부분 생체 중 100㎏을 껍질과 속 부분을 구분한 뒤 세절하여 속 부분(48 ㎏)을 MeOH 80% 수용액(18ℓ×5)으로 두 차례 걸쳐 추출한 후 여과지로 여과하였다. 상기 얻어진 여액을 45℃에서 감압 농축하여 MeOH 추출물을 얻었다. 이렇게 얻어진 MeOH 추출물을 EtOAc(3ℓ×2)/H₂O(3ℓ) 로 분배 추출하고, 다시 H₂O층을 n-BuOH(3ℓ×2)/H₂O(3.2ℓ)로 분배 추출하였다. 그 다음, 각 층을 감압 농축하여 EtOAc, n-BuOH 및 H₂O 분획을 얻었다.

상기 n-BuOH 분획에 대하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(silica gel column chromatography, φ 5×22 ㎝, n-hexane:EtOAc=10:1→5:1→3:1→1:1→CHCl₃:MeOH=10:1→7:1→5:1→3:1→2:1→1:1)를 실시하여 얻은 18개의 분획물(BRB-1~BRB-16) 중 BRE-9 분획에 대하여 ODS c.c.(φ 3.5×12 ㎝, MeOH:H₂O=1:1)로 정제하여 하기 화학식 1의 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴(BRE9-3, MeOH:H₂O=3:1)을 분리하였다.

[화학식 1]

4-메톡시인돌-3-아세토니트릴: colorless powder(MeOH-CHCl₃); m.p. 141-142 ℃; EI/MS m/z 186 [M]^＋, 171; IRυ_max 3396, 2955, 2850, 1619, 1258 cm^-1; ¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃, δ), 7.11(1H, dd, J=8.0, 8.0 Hz H-6), 7.03(1H, s, H-2), 6.95(1H, d, J=8.0 Hz, H-5), 6.49(1H, d, J=8.0 Hz, H-7), 4.21(3H, s, H-12), 4.08(2H, s, H-10); ¹³C-NMR(100 MHz, CDCl₃,δ_C) 154.09(C-4), 137.63(C-8), 125.12(C-9), 123.49(C-7), 121.26(C-5), 119.18(C-11), 104.85(C-3), 104.61(C-2), 99.67(C-6), 55.14(C-12), 16.02(C-10).

실시 예 2. 4- 메톡시인돌 -3- 아세토니트릴의 시스플라틴에 대한 신장 보호효과 측정

상기 실시 예 1에서 추출한 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴의 시스플라스틴에 대한 세포고사의 방지효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저 근위세뇨관 세포인 LLC-PK1을 10% FBS, 페니실린(100 유니트/㎖), 스트렙토마이신 설페이트(100㎍/㎖)가 포함된 M199 배지에서 37 ℃, 5% 이산화탄소의 습기 있는 환경에서 배양하였다. 세포를 원심분리 및 티릅신으로 수집하여 10% FBS를 포함하는 M199 배지 100 ㎕를 포함하는 96 웰 플레이트에 1×10⁵/웰을 넣었다. 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴은 디메틸설폭사이드(DMSO) 용매에 용해시켜 농도별로 처리하였으며, 항산화제인 NAC(5mM)를 양성대조군으로 사용하였다. 모든 시험에서 DMSO의 농도는 0.1%를 초과하지 않도록 하였다. 하룻밤 경과 후, 시료를 첨가하고 3 시간 뒤에 시스플라스틴이 50 ㎛이 되도록 각 웰에 처리하였다. 플레이트는 36 시간 동안 배양하였다. 세포들은 한 차례 세척한 후 5 ㎎/㎖의 MTT를 함유하는 FBS 없는 배지 50㎕를 첨가하였으며, 37℃에서 4 시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 세포 내에서 형성된 포마잔 블루(formazan blue)를 100㎕의 DMSO에 녹인 후, 540nm 에서 흡광도를 측정하여 시스플라틴에 대한 신장 보호효과를 세포 생존력(cell viability, %) 값으로 구하였다. 세포 생존력은 화합물을 처리하지 않았을 때의 세포의 숫자를 기준으로 하여 나타내었으며, 그 결과는 도 1에 나타내었고, 이때 제시되는 값은 3회 평균값이다.

실험 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴은 농도 의존적으로 시스플라틴에 의한 신장세포의 사멸을 저해함을 확인할 수 있었다. 이같은 결과를 통하여 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴은 시스플라틴의 부작용인 신장 독성을 감소시킴을 알 수 있었다.

실시예 3. 4- 메톡시인돌 -3- 아세토니트릴의 시스플라틴에 의한 ROS 저해효과

본 실시 예에서는 상기 실시예 1에서 추출한 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴이 시스플라틴에 의한 ROS의 생성을 저해시키는지 알아보았다. ROS의 측정은 DCFH-DA를 사용하였다.

배양된 LLC-PK1 세포를 0.2% FBS, 페니실린(100 유니트/㎖)이 포함된 M199 배지에서 37 ℃, 5% 이산화탄소의 습기 있는 환경에서 배양하여 1×10⁵개/㎖을 세포배양 플레이트에 넣고 하룻밤 배양하였다. 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴을 농도별로 DMSO에 용해시켜 처리하고, 항산화제인 NAC(5 mM)를 양성대조군으로 사용하였다. 3 시간 뒤 시스플라틴(50 ㎛)을 가하여 4.5 시간 동안 배양하였다. DCFH-DA를 DMSO에 용해시켜 각 군당 20㎛이 되도록 처리하고 30 분간 37℃에서 배양하였다. 모든 시험에서 DMSO의 농도는 0.1%를 초과하지 않도록 하였다. DCFH-DA는 세포에서 탈아세틸화되어 무형광의 DCFH를 형성하였으며, 산화상태에서는 DCF로 변화되어 이의 형광도를 유세포측정기(FACS)로 측정하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴은 시스플라틴에 의해 생성된 ROS를 농도 의존적으로 저해함을 확인할 수 있었다.

실시 예 4. 4- 메톡시인돌 -3- 아세토니트릴의 시스플라틴에 의한 지질과산화 감소효과

본 실시 예에서는 상기 실시 예 1에서 추출한 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴이 ROS 생성에 의한 산화적 스트레스를 감소시키는지 확인하기 위하여 지질과산화가 일어나는 정도를 알아보았다. 지질과산화의 정도를 나타내는 지표로서 Malondialdehyde(MDA)의 값을 thiobarbituric acid reaction assay로 측정하였다.

먼저 LLC-PK1 세포를 10% FBS, 페니실린(100 유니트/㎖), 스트렙토마이신 설페이트(100 ㎍/㎖)가 포함된 M199 배지에서 37 ℃, 5% 이산화탄소의 습기 있는 환경에서 배양하여 2×10⁵개/㎖을 세포배양 플레이트에 넣고 하룻밤 동안 배양하였다. 그 다음, 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴을 농도별로 DMSO에 용해시켜 처리하고, 항산화제인 NAC(5 mM)를 양성대조군으로 사용하였다. 3 시간 뒤 시스플라스틴(50 ㎛을 가하여 24 시간 동안 배양하였다. 모든 시험에서 DMSO의 농도는 0.1%를 초과 하지 않도록 하였다. 세포를 모아 ice-cold 50 mM Tris-HCl로 Homogenase시켜 각각의 단백질량을 동일하게 맞춘 후, SDS, Acetic acid buffer, thiobarbituric acid를 처리하였다. 상기 혼합액을 100 ℃에서 1 시간 동안 가열하고 532 ㎚에서 각 샘플의 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.

실험 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 본 발명의 약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴은 시스플라틴에 의한 지질과산화를 농도 의존적으로 저해함을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 4- 메톡시인돌 -3- 아세토니트릴의 시스플라틴에 의한 글루타티온( glutatione ) 고갈 저해효과

시스플라틴으로 유도된 ROS에 의한 환원형 글루타티온(glutathione, GSH)이 고갈되는 정도를 상기 실시예 1에서 추출한 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴이 감소시키는지 알아보기 위하여 글루타티온의 값을 측정하였다.

먼저, LLC-PK1 세포를 10% FBS, 페니실린(100 유니트/㎖), 스트렙토마이신 설페이트(100 ㎍/㎖)가 포함된 M199 배지에서 37 ℃, 5% 이산화탄소의 습기 있는 환경에서 배양하여 2×10⁵개/㎖을 세포배양 플레이트에 넣고 하룻밤 동안 배양하였다. 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴을 농도별로 DMSO에 용해시켜 처리하고, 항산화제인 NAC(5 mM)를 양성대조군으로 사용하였다. 3 시간 뒤 시스플라스틴(50 ㎛)을 가하여 24 시간 동안 배양하였다. 모든 시험에서 DMSO의 농도는 0.1%를 초과하지 않 도록 하였다. 세포를 모아 metaphosphoric acid(MPA)로 Homogenase시켜 각각의 단백질량을 동일하게 맞춘 후, Oxisresearch(USA)의 Glutathione kit를 이용하여 GSH의 값을 측정하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

실험 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴은 시스플라틴에 의한 GSH의 고갈을 농도 의존적으로 저해함을 확인할 수 있었다.

실시 예 6. 4- 메톡시인돌 -3- 아세토니트릴의 ACAT 활성에 미치는 영향

(ACAT 효소원 제조)

상기 실시 예 1에서 추출한 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴의 사람 ACAT-1 및 ACAT-2의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 베큘로바이러스 발현체제를 이용하여 hACAT-1 및 hACAT-2 각각의 단백질을 얻었다. 사람 간 cDNA 라이브러리 스크리닝(library screening)을 통하여 얻어진 hACAT-1 및 hACAT-2 각각의 cDNA를 베큘로바이러스 전달 벡터에 삽입하고, 곤충세포인 sf9 세포에 도입하여 바이러스를 제조하였다. 다음으로, 플라크 정제(plaque purification) 방법으로 hACAT-1 및 hACAT-2 각각의 재조합 바이러스를 분리한 후, 3 차례의 증폭과정을 거쳐 저장용 바이러스(viral stock)의 역가(titer)를 높였다. 단백질 발현 효율이 좋은 Hi5 곤충세포에 재조합 바이러스를 감염다중도(Mutiplicity of Infection)가 1이 되도록 감염시킨 후, 27 ℃에서 하루 동안 진탕 배양하였다. 배양된 hACAT-1과 hACAT-2가 각각 과량 발현된 Hi5 세포들로부터 마이크로좀 분획을 분리하기 위하여 500 rpm에 서 15 분간 원심분리하여 세포들을 모으고 저장완충액(hypotonic buffer)에서 급냉동, 급 해동 방법으로 세포를 깬 후, 100,000 rpm에서 한 시간 동안 초원심분리하였다. 이렇게 얻어진 마이크로좀 분획들은 단백질 농도가 8 ㎎/㎖이 되도록 저장완충액으로 현탁하여 사용 전까지 저온냉동기에 보관하였다.

(ACAT 활성 측정)

ACAT 활성의 측정은 [1-¹⁴C] 올레오일-코에이(oleoyl-CoA)(56.0 μCi/μmol; Amersham)를 기질로 하여 Brecher & Chan의 방법(P. Brecher and C. Chan, Biochim . Biophys . Acta , 617, 458, 1980)을 일부 수정하여 사용하였다.

상기 실시 예 1에서 추출한 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴 10 ㎕, 상기에서 수득한 마이크로좀 용액 4.0 ㎕, 활성분석 완충액(0.5 M KH₂PO₄, 10 mM DTT, pH 7.4; Sigma) 20.0 ㎕, 지방이 제거된 우혈청알부민(BSA; bovine serum albumin, 저장액 농도 40 ㎎/㎖; Sigma) 15.0 ㎕, 콜레스테롤(저장액 농도 20 ㎎/㎖; Sigma) 2.0 ㎕, 증류수 41.0 ㎕를 가하여 37 ℃에서 15 분간 예비 반응시켰다. 이 반응액에 [1-¹⁴C] 올레오일-코에이(0.05 μCi, 최종농도: 10 ㎛) 8 ㎕를 첨가하여 다시 37 ℃에서 30 분간 반응시킨 후, 이소프로판올:헵탄 혼합물(4:1 (v/v)) 1 ㎖을 가하여 반응을 정지시켰다. 여기에 600 ㎕의 헵탄과 200 ㎕의 0.1M KH₂PO₄(pH 7.4)를 첨가하고, 혼합물을 볼텍서(vortexer)로 격렬하게 혼합한 후, 300 rpm에서 5 분 동안 원심분리를 하였다. 상기 원심분리하여 얻은 100 ㎕의 상층액을 신틸레이션 병(scintillation bottle)에 넣고, 신틸레이션 액(Lipoluma) 4 ㎖을 가하였다. 이 혼합물의 방사선량은 1450 마이크로베타 액체 신틸레이션 계수기(1450 Microbeta liquid scintillation counter, Wallacoy)로 측정하였다.

ACAT 활성은 측정된 방사선량으로부터 시간당 방사선량을 계산하여 1 분 동안 단백질 1 ㎎당 합성된 콜레스테릴 올레이트 피코몰(피코몰/분/㎎ 단백질)로 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

구분	hACTC-1 (100 ㎍/㎖)	hACTC-2 (100 ㎍/㎖)
ACTC 활성 저해율 (%)	68.6 ± 3.7	39.5 ± 4.3

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴은 ACAT 활성에 대한 억제능이 우수함을 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 추출한 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴의 농도에 따른 신장 세포 생존 정도를 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 추출한 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴의 농도에 따른 ROS 저해 효과를 나타낸 그림이다.

도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 추출한 4-메톡

시인돌-3-아세토니트릴의 농도에 따른 지질과산화 저해 효과를 나타낸 그림이다.

도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 추출한 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴의 농도에 따른 글루타티온(GSH) 고갈 저해 효과를 나타낸 그림이다.

Claims

4-메톡시인돌-3-아세토니트릴(4-methoxyindole-3-acetonitrile)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,

상기 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴은 순무로부터 추출된 것을 특징으로 하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,

상기 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴은 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 98 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
항암제에 의해 유발되는 신장 독성에 대한 억제 활성을 갖는 4-메톡시인돌-3-아세토니트릴을 유효성분으로 포함하는 항암보조제.
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