KR100949011B1

KR100949011B1 - 사자발쑥 추출물을 포함하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR100949011B1
Application number: KR1020090080306A
Authority: KR
Inventors: 백남인; 이경태; 최명숙; 정태숙; 정해곤; 방면호; 한민우; 이경원
Original assignee: 강화군
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2010-03-23
Also published as: KR20090107005A

Abstract

본 발명은 사자발쑥 추출물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 특히 사자발쑥 추출물 중 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드를 유효성분으로 포함하여 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 효과적인 약학 조성물에 관한 것이다.

3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드, 사자발쑥, 동맥경화, 고지혈증

Description

사자발쑥 추출물을 포함하는 약학 조성물{Composition containing Artemisia princeps}

본 발명은 사자발쑥 추출물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 사자발쑥 추출물 중 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

세포자가사멸(Apoptosis) 유도 물질은 최근 함암 치료의 새로운 표적 (target)으로 부상되고 있다. 세포자가사멸은 세포를 죽음으로 이끄는 가장 중요한 과정으로서 진핵세포의 항상성 유지와 조직 성장 조절에 있어 매우 중요한 역할을 담당하고 있다(Douglas R Green et al., Science, 281, pp1309-1312, 1998; Michael O et al., Nature, 407, pp770-776, 2002). 세포의 증식 및 사멸은 세포 내 항상성을 유지하기 위해 반드시 필요한 과정이며, 이를 정상적으로 실행하기 위해 세포는 정상상태를 유지할 필요성이 있다. 그러나 세포 내 항상성이 파괴되면 암을 포함한 여러 가지 병이 유발된다(Thompson CB et al., Science, 267, pp1456- 1462, 1995).

세포자가사멸은 세포 외부의 사멸 수용체(death receptor) 의존성 경로와 세포 내부의 미토콘드리아 의존성 경로를 통해서 일어난다. 또한 이러한 세포자가사멸은 화학요법약제의 처리에 의해서도 유도된다(Kaufmann SH et al., Exp. Cell Res., 256(1), pp42-49, 2000 ; Walker PR et al., Cancer Research, 51, pp1078-1085, 1991). 세포질에서 시스테인 프로테아제(cysteine proteases)의 종에 속하는 카스파제(caspase)는 세포자가사멸의 실행에 중요한 역할을 담당한다. 최초 시행자인 프로카스파제-8(procaspase-8)은 세포사로 이끄는 자극에 대해서 자가-공정(self-processing)에 의해 활성형인 카스파제-8로 바뀐다. 반면, 프로카스파제-9는 미토콘드리아의 경로에 의해서 활성화된다(Denecker G et al., Cell. Mol. Life Sci., 58, pp356-370, 2001). 이는 미토콘드리아 또한 성장 인자의 결핍, 자외선, 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 에토포사이드(etoposide)와 같은 항암제 등의 신호 전달에 의해 세포를 세포사로 유도하는 데에 중요한 역할을 담당한다는 것을 보여준다(Wilson SE, Exp. Eye Res., 69, pp255-266, 1999). 미토콘드리아 경로는 Bcl-2 종(family) 단백질의 중개로 일어난다. Bcl-2 종 단백질에는 Bcl-2 와 Bax 단백질이 속해 있으며, 이들 단백질은 미토콘드리아에서 시토크롬-c(cytochrome-c)의 이동을 조절한다(Kelekar A et al., Trends Cell Biol., 8, pp.324-330, 1998). 여러 가지 세포자가사멸 유도 신호를 받은 세포에서는 자가사멸이 일어나고, 이때 세포에서는 시토크롬-c가 미토콘드리아에서 세포질로 방출된다(Newmeyer DD et al., Cell, 112, pp.481-490, 2003). 방출된 시토크롬-c는 세포 질의 아포프토솜 복합체(apoptosome complex) 내에 있는 디옥시아데노신트리포스페이트(dATP), Apaf1(apoptosis protease activating factor 1)과 프로카스파제-9와 서로 상호 작용하며 결과적으로 프로카스파제-9를 활성형인 카스파제-9로 변형시킨다(Chandra J et al., Free Radic. Biol. Med., 29, pp323-333, 2000). 활성화된 카스파제-9는 카스파제-3, 카스파제-6, 카스파제-7과 같은 실행자를 활성화시킨다(Salvesen GS et al., Cell, 91, pp443-446, 1997). 상기 실행자 카스파제들은 폴리 ADP-리보스 중합효소(PARP, poly ADP-ribose polymerase), 세포막(laminas)과 ICAD(inhibitor of caspase activated DNase)를 절단한다. 상기의 절단된 단백질들은 세포자가사멸의 실행 표적 단백질로 사용된다. 이와 같은 세포자가사멸에 따른 여러 가지 현상에 의해 세포들은 염색체의 응축, DNA의 단편화, 아폽토시스 소체 형성 등의 형태학적인 특징을 가지게 된다(Germain M et al., J. Biol. Chem., 274, pp28379-28384, 1999).

최근 성인병 증가와 더불어 동맥경화 등의 혈관장애 질환이 크게 증가하고 있다. 대표적인 혈관장애 질환으로서 동맥경화는 지질대사와 관련된 유전적 요인과 식습관, 흡연, 운동부족 등의 환경적 요인에 의하여 동맥이 경화되는 질환으로, 뇌동맥 또는 관상동맥에서 일어나기 쉬우며, 이로 인하여 심장질환, 뇌혈관 질환 등의 순환계 질환으로 발전하게 된다. 뇌동맥경화의 경우에는 두통, 현기증, 정신장애 등을 나타내고 뇌연화증의 원인이 되며, 관상동맥경화의 경우에는 심장부에 동통과 부정맥을 일으켜 협심증, 심근경색 등의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 또한 이로 인해 고혈압, 심장병, 뇌일혈 등이 유발되어, 동맥경화로 인한 질병이 현 대 사회에 있어, 특히 50-60 대의 남성들에게 가장 큰 사망요인으로 부각되고 있다.

혈관 내벽의 플라그(plaque) 형성 및 혈관파열은 심근경색 발병의 주요한 요인이며, 동맥경화의 초기 발생에 관한 가설은 혈관벽의 손상에 대한 만성 염증과정으로, 손상기작보다는 오히려 방어기작인 ‘손상에 대한 반응(response-to-injury hypothesis)’으로 제시되고 있다(Nature 1993, 362, 801-809). 이는 유전적 변이, 과산화물, 고혈압, 당뇨, 혈장 호모시스테인 농도 증가 또는 미생물 감염 등의 원인에 의하여 혈관 내피세포가 정상적인 항상성을 유지하지 못하는 기능부전 상태가 되는 것이다.

또한 혈중 콜레스테롤 농도가 높으면 관상동맥성 심혈관 질환이 유발되기 쉬우므로, 혈중 콜레스테롤 농도를 줄이기 위해서는 콜레스테롤 및 지방의 섭취를 줄이는 식이요법을 시행하거나 지질대사와 관련된 효소를 저해함으로써 콜레스테롤의 흡수를 억제해야 한다. 이에, 콜레스테롤을 에스테르화하는 효소인 아실 코에이: 콜레스테롤 아실 전이효소(acyl-CoA: cholesterol acyltransferase; ACAT)에 관한 연구가 많이 행해지고 있다.

ACAT의 작용 기작은 크게 체내의 장, 간 및 혈관벽 세포의 세 부위에서 일어난다. 첫째, 장에서 ACAT는 섭취된 콜레스테롤을 에스테르의 형태로 바꾸어 장내로 흡수되는 것을 촉진시킨다. 둘째, 외부로부터 흡수되거나 체내에서 생합성된 콜레스테롤은 간에서 VLDL(very low-density lipoprotein)이라는 운반체 안에 축적된 후 혈관을 통해 신체 각 기관으로 공급되는데, 이때 ACAT에 의하여 콜레스테롤이 콜레스테릴 에스테르 형태로 전환됨으로써 운반체 내에 콜레스테롤 축적이 가능하게 된다. 셋째, 동맥혈관벽을 이루는 세포 내에서 ACAT는 콜레스테롤을 그의 에스테르 형태로 전환시켜 세포 내에 콜레스테롤이 축적되는 것을 촉진시키는데, 이는 동맥경화를 일으키는 직접적인 원인이 된다. 또한, ACAT 활성에 의해 거품세포가 콜레스테롤로부터 유도된 다량의 콜레스테릴 에스테르를 포함하기 때문에, 실험적, 임상적인 측면에서 대식세포와 평활근세포로부터 유도된 거품세포의 형성은 매우 중요하다. 혈관벽 내의 거품세포의 증식은 ACAT 활성 증가와 직접적으로 연관되어 있기 때문에 강력한 항동맥경화제로서 ACAT 저해제의 개발은 바람직하다.

따라서, ACAT의 활성을 억제하는 약물은 첫째 장내 콜레스테롤의 흡수를 억제하여 체내로 유입되는 콜레스테롤의 양을 감소시킬 수 있을 것이며, 둘째 간에서 혈관 내로 콜레스테롤이 방출되는 것을 억제하여 혈중 콜레스테롤 농도를 떨어뜨릴 수 있고, 셋째 혈관벽 세포에 콜레스테롤이 축적되는 것을 방지하여 직접적으로 동맥경화를 예방할 수 있을 것으로 기대된다.

지금까지 보고된 ACAT 활성 저해제는 쥐간 마이크로좀 ACAT 또는 쥐간 대식세포(J774) ACAT에 대한 활성 저해제이다. 사람의 ACAT에는 hACAT-1(50 kDa) 및 hACAT-2(46 kDa)가 있는데, hACAT-1은 성인의 간, 부신, 대식세포, 신장에서 주로 작용하며, hACAT-2는 소장 및 간에서 작용한다(Rudel, L. L. et al., Curr. Opin. Lipidol. 12, 121-127, 2001). 사람 ACAT 활성을 저해하는 물질은 음식으로부터 유입되는 콜레스테롤의 흡수를 억제하고, 혈관 내벽에 콜레스테릴 에스테르의 축적을 억제하는 기작을 통해 고콜레스테롤증, 콜레스테롤 결석 또는 동맥경화 예방 및 치 료제의 표적이 되고 있다(Buhman, K. K. et al., Nature Med. 6, 1341-1347, 2000).

한편 사자발쑥(Artemisia spp.)은 우리나라의 강화도 지방에는 자생되어 오던 약쑥으로서, 현재까지 사자발쑥의 항암 활성이나 항산화 활성에 대해 개시되거나 교시된 바는 없다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화, 심근경색 등의 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 심장순환계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 심장순환계 질환은 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화 또는 심근경색이다.

본 발명의 사자발쑥 추출물을 포함하는 약학 조성물은 카스파제-3 및 카스파제-8의 활성을 통한 폴리 ADP-리보스 폴리머라제(PARP)의 절단 유도, XIAP 단백질과 Bcl-2 종양유발인자 단백질의 감소 유도 등 HeLa(난소암 세포) 및 U-937(백혈병 세포) 세포주에 대하여 강한 세포독성 효과가 갖는다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 항산화 활성을 가져 LDL의 산화로 유발되는 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화, 심근경색 등 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 유용하다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 사자발쑥 추출물을 포함하는 약학 조성물은 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드(3β,4β-epoxy-8α-isobutyryloxyguaia-1(10),11(13)-diene-12,6α-olide)를 유효성분으로 포함함으로써 암 질환 및 심장순환계 질환을 예방 및 치료할 수 있다.

상기 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드는 건조한 사자발쑥 전초 중량(kg)의 약 1 내지 15배, 바람직하게는 약 5 내지 10배의 C₁ 내지 C₄의 저급알코올, 바람직하게는 메탄올에 담가 24 시간 동안 반복 정치 추출하고 여과한 후, 감압농축하고 이들을 통상의 분획 공정을 수행하여 얻을 수 있다.

구체적으로, 건조한 사자발쑥 전초 2.4kg을 80% MeOH 수용액(15ℓ×2)에 24 시간 동안 담궈 실온에서 추출하였다. 상기 추출물을 여과하고, 남은 것은 동일한 방법으로 2회 더 추출하였다. 상기 얻어진 여액을 모두 합쳐 감압농축하여 MeOH 추출물을 얻었다. 이렇게 얻어진 MeOH 추출물을 에틸 아세테이트(EtOAc, 2ℓ×2)로 분배 추출하였으며, 물층은 다시 n-부탄올(n-BuOH, 2ℓ×2)로 분배 추출하였다. 각층을 감압농축하여 EtOAc 분획(SJBE), n-BuOH 분획(SJBB)과 H₂O 분획(SJBW)을 얻었다. 그 다음 상기 SJBE-12 분획을 silica gel c.c.(n-hexane:EtOAc=5:1)를 실시하 여 10 개의 분획물(SJBE-12-1~SJBE-12-10)을 얻었다. 이 중 SJBE-12-7 분획을 ODS c.c.(MeOH:H₂O=5:1)로 정제하여 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드를 분리할 수 있다.

상기와 같이 분리한 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드는 하기 화학식 1로 표시된다.

상기 화학식 1의 화합물은 IR에서 1650 cm^-1의 공역화된 오원환의 락톤 흡수 peak가 관측되었으며, 분자량은 EI/MS spectrum에서 분자이온피크([M]⁺ m/z 366)로부터 366으로 결정하였다. ¹H-NMR(400MHz, CDCl₃) spectrum에서, exomethylene proton signal[(δ_H 6.10, H-13a), (δ_H 5.50, H-13b)]과 oxygenated methine proton signal[(δ_H 4.11, H-8), (δ_H 3.67, H-6), (δ_H 3.37, H-3)] 3개가 관측되 었다. δ_H 2.09~δ_H 3.11 사이에서는 3개의 methine proton signal[(δ_H 3.10, H-7), (δ_H 3.05, H-5), (δ_H 2.54, H-2')]과 4개의 methylene proton signal[(δ_H 2.68, H-2a), (δ_H 2.44, H-2b), (δ_H 2.40, H-9a), (δ_H 2.11, H-9b)]이 관측되었으며, 2개의 singlet methyl proton signal[(δ_H 1.69, H-14), (δ_H 1.63, H-15)]와 2개의 doublet methyl proton signal[(δ_H 1.16, H-3'), (δ_H 1.16, H-4')]이 관측되었다. ¹³C-NMR(100MHz, CDCl₃) spectrum 에서는 총 19개의 signal이 관측되었다. 저자장 영역에서는, carbonyl carbon signal[(δ_C 175.8, H-1'), (δ_C 1687.6, H-12)] 2개와 olefine quaternary carbon signal[(δ_C 136.9, H-11), (δ_C 136.3, H-1), (δ_C 128.3, H-10)] 3개 및 exomethylene signal(δ_C120.4, C-13) 이 관측되었으며, oxygenated methine 및 quaternary 영역에서 총 4개의 signal[(δ_C 77.8, H-6), (δ_C 66.9, H-8), (δ_C 66.8, H-4), (δ_C 63.5 (H-3)]이 관측되었다. 고자장 영역에서는 2개의 methylene signal과 3개의 methine signal[(δ_C56.5, C-7), (δ_C 51.3, C-5), (δ_C 41.2, C-9), (δ_C 34.2, C-2'), (δ_C33.2, C-2)], 4개의 methyl signal[(δ_C 22.07, C-14), (δ_C 19.07, C-15), (δ_C 18.97, C-3'), (δ_C,18.76, C-4')]이 관측되었다. 따라서, 탄소 15개의 sesquiterpene에 탄소수 4개가 결합한 구조임을 추정할 수 있었다. 그러나, 1D-NMR 데이터만으로는 sesquiterpene의 정확한 구조를 동정하기 어려워, 2D-NMR 기법을 이용하여, 구조를 동정하였다. gCOSY 스펙트럼으로부터 exomethylene H-13a/b이 H-7(3.10 ppm)과 각각 coupling을 보이는 cross peak를 보여 주었다. 또한, H-7이 oxygenated methine H-6(3.67 ppm)/H-8(4.76 ppm)과 각각 cross peak를 보였고, oxygenated methine H-6이 H-5(3.05 ppm)와 cross peak를 보여 주어, 고리구조의 부분 구조를 확인할 수 있었다. 또한, oxygenated methine H-3(3.37 ppm)이 methylene H-2a/2b와 각각 coupling하고 있음을 확인하였으며, 2개의 doublet methyl H-3'/4'이 H-2'(2.54 ppm)와 coupling하고 있음을 확인하였다. gHSQC로부터 각 수소와 탄소의 연결 관계를 확인하였으며, 이를 바탕으로 gHMBC를 분석하였다. H-2'수소가 methyl C-3'/4'와 carbonyl C-1'과 cross peak를 보임으로써, isobutylic acid 구조임을 알 수 있었으며, oxygenated methine H-8이 C-1'과 cross peak를 보여주어 isobutylic acid가 8번에 결합한 sesquiterpene임을 알 수 있었다. 또한, exomethylene proton H-13a/b가 C-6, 7, 11, 12와 각각 cross peak를 보이고, H-6이 C-12와 cross peak를 보임으로써, 이 부분구조가 olide 형태를 취하고 있음을 알 수 있었다. 또한, methine H-5가 oxygenated methine 및 quaternary인 C-3, C-4 및 olefine quaternary C-1과 각각 cross peak를 보였으며, H-3은 C-4, C-2 및 C-1과 각각 cross peak를 보여주어 이 구조는 guaianolide 계열의 화합물임을 알 수 있었다. 또한, 각 methyl H-14 및 H-15가 각각 C-10과 C-4에 cross peak를 보여주어 위치를 확인할 수 있었다. 따라서, 데이터를 종합하여 본 결과, C1과 C10 사이에 이중결합을 가지며, C11의 위치에 exomethylene을 가지며, C3과 C4 사이에 epoxy로 연결되어지고, C8에 isobutyric acid ester를 갖는, sesquiterpene으로 동정하였으며, 문헌을 조사하여 본 결과, 상기 화학식 1의 화합물은 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드로 동정하였다.

상기 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드는 암세포주인 HeLa(난소암 세포) 및 U-937(백혈병 세포)에서의 세포사멸 유도 활성, HeLa 세포의 카스파제-3 및 카스파제-8의 활성, 폴리 ADP-리보스 폴리머라제(PARP)의 절단 유도, XIAP 단백질과 Bcl-2 종양유발인자 단백질 양 감소 효과와 ACAT 활성 억제능을 확인함으로써 암 질환 및 심장순환계 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 상기 추출 공정을 통해 얻어지는 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드를 유효성분으로 포함하는 암 질환 및 심장순환계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드는 본 발명의 약학 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 94 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 그 함량이 상기 범위내일 경우에는 난소암, 백혈병 등 암 질환과 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화, 심근경색 등 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 있어 더욱 좋다.

상기 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

또한 상기 약학 조성물의 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태 로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타약학적 활성 화합물과 결합뿐 아니라 적당한 집합으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로 필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 약학 조성물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

이하 실시예에서 사용한 실험재료로 U-937(인체 조직상 임파종 세포주), HeLa(인체 자궁경부암 세포주)는 한국 세포주 은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다. RPMI 1640 배지, fetal bovine serum(FBS), penicillin 및 streptomycin은 Life Technologies, Inc의 것을 사용하였다. 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tertazolium bromide(MTT), 4',6-diamino-2-phenylindole(DAPI), cisplatin은 Sigma Chemical Co.의 것을 사용하였다. anti-caspase-3, anti-caspase-8, anti-XIAP, anti-PARP, anti-Bcl-2 항체(antibody)는 Santa Cruz Biotechnology의 것을 사용하였다.

실시예 1. 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드의 추출

건조한 사자발쑥 전초 2.4 ㎏을 80% MeOH 수용액(15ℓ×2)에 24 시간 동안 담궈 실온에서 추출하였다. 상기 추출물을 여과하고, 남은 것은 동일한 방법으로 2회 더 추출하였다. 이렇게 얻어진 여액을 모두 합쳐 감압농축하여 MeOH 추출물을 얻었다. 상기 얻어진 MeOH 추출물을 에틸아세테이트(EtOAc, 2ℓ×2)로 분배 추출하였으며, 물층은 다시 n-부탄올(n-BuOH, 2ℓ×2)로 분배 추출하였다. 각층을 감압농축하여 EtOAc 분획(SJBE), n-BuOH 분획(SJBB)과 H₂O 분획(SJBW)을 얻었다.

상기 SJBE-12 분획을 silica gel c.c.(n-hexane:EtOAc = 5 : 1)를 실시하여 10개의 분획물(SJBE-12-1~SJBE-12-10)을 얻었다. 이 중 SJBE-12-7 분획을 ODS c.c.(MeOH:H₂O=5:1)로 정제하여 하기 화학식 1로 표시되는 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드를 분리하였다.

[화학식 1]

3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드(3β,4β-epoxy-8α-isobutyryloxyguaia-1(10),11(13)-dien-12,6α-olide): white powder(MeOH); m.p. 183-191 ℃; IR(KBr, ㎝^-1): 3400, 2294, 2880, 1650; EI/MS m/z(70 eV): 366 [M]^＋, 356, 245; ¹H-NMR(400 MHz, CDCl_3,δ_H): 6.10(1H, d, J=2.8 Hz, H-13a), 5.50(1H, d, J=2.8 Hz, H-13b), 4.76(1H, ddd, J=10.4, 10.4, 2.0 Hz, H-8), 3.67(1H, dd, J=6.4, 6.4 Hz, H-6), 3.37(1H, br s, H-3), 3.10(1H, dddd, J=10.4, 10.4, 2.8, 2.8 Hz, H-7), 3.05(1H, dd, J=6.4, br s Hz, H-5), 2.68(1H, dd, J=17.6, br s Hz, H-2a), 2.54(2H, qq, J=7.2, 7.2 Hz, H-2'), 2.44(1H, dd, J=17.6, 1.6 Hz, H-2b), 2.40(1H, dd, J=13.6, br s Hz, H-9a), 2.11(1H, dd, J=13.6, 2.4 Hz, H-9b), 1.17(3H, d, J=7.2 Hz, H-4'), 1.16(3H, d, J=7.2 Hz, H-3'). ¹³C-NMR(100 MHz, CDCl_3,δ_c): 175.79(C-1'), 168.55(C-12), 136.85(C-11), 136.34(C-1), 128.34(C-10), 120.40(C-13), 77.87(C-6), 69.90(C-8), 66.78 C-4), 63..47(C-3), 56.50(C-7), 51.33(C-5), 41.24(C-9), 34.15(C- 2'), 33.21(C-2), 22.07(C-14), 19.07(C-15), 18.97(C-3'), 18.76(C-4').

실시 예 2. 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드의 암세포주에 대한 세포독성 측정

상기 실시 예 1에서 얻은 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드의 세포 독성효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 한국 세포주 은행(KCLB)에서 분양받은 암세포주인 U-937(인간 조직상 임파종 세포주), HeLa(인간 자궁경부암 세포주)를 10% FBS, 페니실린(100 유니트/㎖), 스트렙토마이신 설페이트(100 ㎍/㎖)가 포함된 RPMI 배지에서 37 ℃, 5% 이산화탄소의 습기 있는 환경에서 배양하였다. 각 암세포들은 원심분리 및 스크래퍼로 수집하여 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지 100 ㎕를 포함하는 96 웰 플레이트에 1×10⁵/웰을 넣었다. 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드는 디메틸설폭사이드(DMSO) 용매에 용해시켰으며, 모든 시험에서 DMSO의 농도는 0.1%를 초과하지 않도록 하였다. 하룻밤 경과 후, 시료를 첨가하고 플레이트는 48 시간 동안 배양하였다. 그 다음 세포들은 한차례 세척한 후, 5 ㎎/㎖의 MTT를 함유하는 FBS 없는 배지 50 ㎕를 첨가하였으며, 37 ℃에서 4 시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 세포내에서 형성된 포마잔 블루(formazan blue)를 100 ㎕의 DMSO에 녹인 후, 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 암세포 증식억제효과를 IC₅₀ 값으로 구하였다. IC₅₀은 화합물을 처리하지 않았을 때에 비하여 세포의 숫자가 50% 감소효과를 나타내는 농도(IC₅₀)를 의미한다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었으며, 제시되는 값은 3회 평균값이다.

구분	U-937	HeLa
IC₅₀ (㎍/㎖)	< 6.25	< 6.25

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 사자발쑥으로부터 추출한 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드는 각각의 암세포주에 대하여 IC₅₀가 6.25 ㎍/㎖ 이하로 암세포의 성장을 억제함을 확인할 수 있었다.

실시 예 3. 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드의 HeLa 세포사멸 유도효과 측정

HeLa 세포는 10% FBS, 페니실린(100 유니트/㎖), 스트렙토마이신 설페이트(100㎍/㎖)가 포함된 RPMI 배지에서 37 ℃, 5% 이산화탄소의 습기 있는 환경에서 배양하였다. 암세포들을 2×10⁵개/㎖을 세포배양 플레이트에 넣고 하룻밤 배양하였다. 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드를 농도별로 DMSO에 용해시켜 24 시간 동안 배양하였다. 모든 시험에서 DMSO의 농도는 0.1%를 초과하지 않도록 하였다. 세포의 세포사멸 유도는 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드의 농도를 증가시켜가면서 24 시간 동안 세포의 사멸유도 정도를 DAPI assay 방법으로 측정하였고(이경태 등, Biol. Pharm. Bull., 28: 854-859, 2005), 그 결과를 하기 도 1에 나타내었다. 실험결과는 3회의 독립적인 실험에 따른 평균 및 표준편차로 나타내었다. 이때, cisplatin은 대표적인 항암제로서 이 실험의 대조군으로서 비교되었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, HeLa 세포의 세포사멸은 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드 화합물에 농도 의존적으로 유도되었으며, 이를 통하여 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드가 세포사멸(apoptosis)을 통하여 암세포에 대한 세포독성을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 4. 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드의 HeLa 세포의 caspase-3, caspase-8, XIAP, PARP, Bcl-2 단백질 변화에 미치는 효과 측정

Western blotting 방법을 통하여 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드가 HeLa 세포의 caspase-3, caspase-8, XIAP, PARP, Bcl-2 단백질 변화에 미치는 효과 측정하였다.

3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드 15 ㎍/㎖으로 HeLa 세포(5×10⁵ 개/㎖)를 24 시간 동안 배양시킨 후 세포내의 단백질을 추출하여 전기영동으로 분리한 뒤 각각의 단백질의 변화량을 특이적인 항체를 사용하여 측정하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, HeLa 세포에 15㎍/㎖의 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드를 처리하면 caspase-3와 caspase-8이 전구체가 잘려져 활성화됨을 알 수 있었으며, caspased-3의 기질인 PARP 또한 절단됨을 확인하였다. 이같은 결과를 통해 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 화합물은 세포사멸 억제인자인 XIAP와 Bcl-2 단백질 양의 감소를 유도시킴을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과들을 통하여, 본 발명에 따라 사자발쑥으로부터 추출한 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드는 caspase-3와 caspase-8 효소의 활성화 증가, 세포사멸억제인자인 XIAP, Bcl-2 단백질의 감소시킴으로서 HeLa 세포사멸(apoptosis)을 효과적으로 유도함을 알 수 있었다. 이같은 결과로부터 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드가 인체 자궁경부암에 효과적인 치료 물질임을 알 수 있었다.

실시 예 5. 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드의 ACTC 활성에 미치는 영향

(ACTC 효소원 제조)

상기 실시 예 1에서 추출한 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드의 사람 ACAT-1 및 ACAT-2의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 베큘로바이러스 발현체제를 이용하여 hACAT-1 및 hACAT-2 각각의 단백질을 얻었다. 사람 간 cDNA 라이브러리 스크리닝(library screening)을 통하여 얻어진 hACAT-1 및 hACAT-2 각각의 cDNA를 베큘로바이러스 전달 벡터에 삽입하고, 곤충세포인 sf9 세포에 도입하여 바이러스를 제조하였다. 다음으로, 플라크 정제(plaque purification) 방법으로 hACAT-1 및 hACAT-2 각각의 재조합 바이러스를 분리한 후, 3 차례의 증폭과정을 거쳐 저장용 바이러스(viral stock)의 역가(titer)를 높였다. 단백질 발현 효율이 좋은 Hi5 곤충세포에 재조합 바이러스를 감염다중도(Mutiplicity of Infection)가 1이 되도록 감염시킨 후, 27 ℃에서 하루 동안 진탕배양하였다. 배양된 hACAT-1과 hACAT-2가 각각 과량 발현된 Hi5 세포들로부터 마이크로좀 분획을 분리하기 위하여, 500 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포들을 모으고 저장완충액(hypotonic buffer)에서 급냉동, 급해동 방법으로 세포를 깬 후, 100000 rpm에서 한 시간 동안 초원심분리하였다. 얻어진 마이크로좀 분획들은 단백질 농도가 8 ㎎/㎖이 되도록 저장완충액으로 현탁하여 사용 전까지 저온냉동기에 보관하였다.

(ACTC 활성 측정)

ACAT 활성의 측정은 [1-14C] 올레오일-코에이(oleoyl-CoA)(56.0 μCi/μmol; Amersham)를 기질로 하여 Brecher & Chan의 방법(P. Brecher and C. Chan, Biochim. Biophys. Acta, 617, 458, 1980)을 일부 수정하여 사용하였다.

상기 실시 예 1에서 추출한 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드 10 ㎕, 상기에서 수득한 마이크로좀 용액 4.0 ㎕, 활성분석 완충액(0.5 M KH2PO4, 10 mM DTT, pH 7.4; Sigma) 20.0 ㎕, 지방이 제거된 우혈청알부민(BSA; bovine serum albumin, 저장액 농도 40 ㎎/㎖; Sigma) 15.0 ㎕, 콜레스테롤(저장액 농도 20 ㎎/㎖; Sigma) 2.0 ㎕, 증류수 41.0 ㎕를 가하여 37 ℃에서 15 분간 예비 반응시켰다. 이 반응액에 [1-14C] 올레오일-코에이(0.05 μCi, 최종농도: 10 μM) 8 ㎕를 첨가하여 다시 37 ℃에서 30 분간 반응시킨 후, 이소프로판올:헵탄 혼합물(4:1 (v/v)) 1 ㎖을 가하여 반응을 정지시켰다. 여기에 600 ㎕의 헵탄과 200 ㎕의 0.1 M KH2PO4(pH 7.4)를 첨가하고, 혼합물을 볼텍서(vortexer)로 격렬하게 혼합한 후, 300 rpm에서 5 분 동안 원심분리를 하였다. 원심분리하여 얻은 100 ㎕의 상층액을 신틸레이션 병(scintillation bottle)에 넣고, 신틸레이션 액(Lipoluma) 4 ㎖을 가하였다. 이 혼합물의 방사선량은 1450 마이크로베타 액체 신틸레이션 계수기(1450 Microbeta liquid scintillation counter, Wallacoy)로 측정하였다.

ACAT 활성은 측정된 방사선량으로부터 시간당 방사선량을 계산하여 1 분 동안 단백질 1 ㎎당 합성된 콜레스테릴 올레이트 피코몰(피코몰/분/㎎ 단백질)로 계산하였으며, 그 결과를 도 3 및 하기 표 2에 나타내었다.

구분	hACTC-1 (100 ㎍/㎖)	hACTC-2 (100 ㎍/㎖)
ACTC 활성 저해율 (%)	96.9 ± 0.0 (IC₅₀ = 4.1 ㎍/㎖)	93.2 ± 2.3 (IC₅₀ = 4.2 ㎍/㎖)

도 3 및 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 사자발쑥으로부터 추출한 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드는 ACAT 활성에 대한 억제능이 우수함을 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 추출한 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드의 농도에 따른 HeLa 세포의 세포사멸유도를 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 추출한 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드 사용에 따른 HeLa 세포의 caspase-3, caspase-8, XIAP, PARP, Bcl-2 단백질 변화량을 나타낸 그림이다.

도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 추출한 3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드의 ACTC 활성 저해율을 나타낸 그래프이다.

Claims

3β,4β-에폭시-8α-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11(13)-디엔-12,6α-올라이드(3β,4β-epoxy-8α-isobutyryloxyguaia-1(10),11(13)-diene-12,6α-olide)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화 및 심근경색으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 심장순환계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
삭제