JP2007526299A - 新規なアビエタンジテルペノイド系化合物、及び榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物を有効成分とする心臓循環系疾患の予防及び治療用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物を有効成分とする心臓循環系疾患の予防及び治療用組成物に関するものである。
【解決手段】
本発明の榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物は、低密度脂質タンパク質に対する抗酸化活性が優秀なだけではなく、ＡＣＡＴに対する活性を効果的に抑制する。また、本発明の榧抽出物は、血清ＬＤＬを減少させると同時に血中コレステロールを下げる。
したがって、本発明の組成物は、コレステリルエステルの合成及び蓄積により誘発される高脂血症及び動脈硬化症のような心臓循環系疾患の予防及び治療に有用に使用することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規なアビエタンジテルペノイド系化合物、及び榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物を有効成分とする心臓循環系疾患の予防及び治療用組成物に関するものである。

最近、成人病の増加とともに動脈硬化症等の血管障害疾患が徐々に増加している。動脈硬化は、脳動脈または冠状動脈で起きやすく、脳動脈硬化症の場合には頭痛、めまい、精神障害を起こして脳軟化症の原因になり、冠状動脈硬化症の場合には心臓部に疼痛や不整脈を起こして狭心症、心筋梗塞等の原因になることが知られている。また、それによって高血圧、心臓病、脳溢血等が誘発され、動脈硬化症による疾病が現代社会において、特に５０〜６０代の男性の最大の死亡要因として注目されている。

血中コレステロール濃度が高ければ冠状動脈性心血管疾患が誘発されやすく、血中コレステロール濃度を減らすためには、コレステロール及び脂肪の摂取を減らす食事療法を行なったり脂質代謝に関係する酵素を阻害することにより、コレステロールの吸収を抑制しなければならない。

したがって、このような疾病を予防する目的で、従来からコレステロール吸収の抑制と生合成の阻害を通じた血漿低密度脂質タンパク質（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）量を減少させようとする試みが進められて来た（非特許文献１及び２）。

最近では、動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の要因として、血液内ＬＤＬ酸化物の生成が主な関心対象になっていて（非特許文献３及び４）、特に、ＬＤＬの過度な酸化と構造の変形を通じて生成されたＨＭ−ＬＤＬ（ｈｉｇｈｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＬＤＬ）の大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）への流入による泡沫細胞（ｆｏａｍ ｃｅｌｌ）生成が明らかにされることによってＬＤＬペルオキシドの生成要因と除去に関する研究が活発に進められている（非特許文献５）。

血管壁内におけるプラク（ｐｌａｑｕｅ）形成と破裂は、心筋梗塞の発病の主な要因であり、動脈硬化は血管壁の損傷に対する慢性炎症過程で、損傷機序よりはむしろ防御機序として提示されている（非特許文献６）。

アシル−ＣｏＡ：コレステロール転移酵素（ａｃｙｌ−ＣｏＡ：ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＣＡＴ）は、一般的にコレステロールをエステル化する酵素として、その作用機序は大きく分けて体内の三つの部位（腸、肝臓、そして血管壁細胞）で起きる。

第一に、ＡＣＡＴは腸で摂取されたコレステロールをエステルの形態に変えて腸内で吸収することを促進させる。第二に、外部から吸収されたり体内で生合成されたコレステロールは肝臓でＶＬＤＬ（ｖｅｒｙ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）という運搬体中に蓄積された後、血管を通じて身体各器官に供給されるが、その時、ＡＣＡＴによってコレステロールがコレステリルエステル形態に転換されることにより、運搬体内にコレステロールの蓄積が可能になる。第三に、動脈血管壁を成す細胞内でＡＣＡＴは、コレステロールをそのエステル形態に転換させて細胞内にコレステロールが蓄積することを促進させる。これは動脈硬化を起こす直接的な原因になる。

また、ＡＣＡＴ活性によって泡沫細胞がコレステロールから誘導された多量のコレステリルエステルを含むため、実験的、臨床的な側面で大食細胞と平滑筋細胞から誘導された泡沫細胞の形成は、非常に重要である。血管壁内の泡沫細胞の増殖は、ＡＣＡＴ活性増加と直接的に関連しているので強力な抗動脈硬化剤として、ＡＣＡＴ阻害剤の開発が好ましい。

したがって、ＡＣＡＴの活性を抑制する薬物は、第一に、腸内コレステロールの吸収を抑制して体内に流入するコレステロールの量を減少させることができ、第二に、肝臓で血管内にコレステロールが放出されることを抑制して血中コレステロール濃度を減少させることができ、第三に、血管壁細胞にコレステロールが蓄積することを防止して直接的に動脈硬化を予防することができることが期待される。

今まで報告されたＡＣＡＴ活性阻害剤は、ネズミの肝臓ミクロゾームＡＣＡＴまたはネズミの肝臓大食細胞（Ｊ７７４）ＡＣＡＴに対する活性阻害剤である。

ヒトのＡＣＡＴは、ヒトＡＣＡＴ−１及びヒトＡＣＡＴ−２があり、ヒトＡＣＡＴ−１（５０ｋＤａ）は大人の肝臓、副腎、大食細胞、腎臓で主に作用し、ヒトＡＣＡＴ−２（４６ｋＤａ）は小腸で作用する（非特許文献７）。ヒトＡＣＡＴ活性を阻害する物質は、食物から流入するコレステロールの吸収を抑制して、血管内壁でのコレステリルエステルの蓄積を抑制する機序を通じて、高コレステロール症、コレステロール結石または動脈硬化予防及び治療剤の標的になっている（非特許文献８）。

現在、高脂血症治療剤に使用されているプロブコール（Ｐｒｏｂｕｃｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジフェニレンジアミン（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、フェノール系合成抗酸化剤であるＢＨＡ（ｂｕｔｙｌａｔｅｄｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌ）とＢＨＴ（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙ ｔｏｌｕｅｎｅ）は、ＬＤＬコレステロールを減少させて、酸化程度を弱化させて病変形成を減少させ、抗酸化力は優秀であるが、副作用が多くて使用が制限されている。

したがって、高脂血症や動脈硬化患者においてＬＤＬ抗酸化剤と共に脂質降下剤を並行投与する療法に対する関心度が高まっている。

一方、榧（Ｔｏｒｒｅｙａ ｎｕｃｉｆｅｒａ）はイチイ科（Ｔａｘａｃｅａｅ）に属する常緑針葉喬木で全世界的に韓国と日本にだけ分布する。榧は、食用、観賞用、工業用、薬用に使用され、種子は食べたり油を絞り出したりして利用する。また、漢方や民間療法では、果実を駆虫、発毛、健胃、調経、膓出血等に薬剤として利用している。木材は、建築材、器具材、船舶用材等に使用する。榧の葉と種子から分離して報告された成分としては、セスキテルペノイド（ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ，非特許文献９）、ラブダン（ｌａｂｄａｎｅ）系列とアビエタン（ａｂｉｅｔａｎｅ）系列ジテルペノイド（ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ，非特許文献１０及び１１）、及びフラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ，非特許文献１２）等がある。

以上のことに鑑みて、本発明者等は副作用が少ない新しい高脂血症、動脈硬化症治療剤を天然物から探索する中で、榧抽出物またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物において、低密度脂質タンパク質に対する抗酸化活性及びＡＣＡＴ酵素に対する優秀な阻害活性があることを確認して本発明を完成した。
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｌｉｐｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、７７０−８１７頁，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００年 Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， １９８９年， 第３２０巻， ９１５−９２４頁 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９５年，第９１巻，２４８８−２４９６頁 Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ．，１９９７年，第１７巻，３３３８−３３４６頁 Ｃｕｒｒ． Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ． Ｒｅｓ．，２０００年，第２巻，３６３−３７２頁 Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ２００１年， 第８９巻， ２９８−３０４頁 Ｒｕｄｅｌ， Ｌ． Ｌ． 等．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｌｉｐｉｄｏｌ １２，２００１年，１２１−１２７頁 Ｂｕｈｍａｎ， Ｋ． Ｋ．等．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６，２０００年，１３４１−１３４７頁 Ｓａｋａｉ， Ｔ．等， Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊａｐａｎ， １９６５年， 第３８巻， ３８１頁 Ｓａｙａｍａ， Ｙ．等， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．，１９７１年，第３５巻，１０６８頁 Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｌ． ａｎｄ Ａｓａｋａｗａ， Ｙ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７年，第２６巻，１２１１頁 Ａｈｍａｄ， Ｉ．等， Ｐｈｙｔｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８１年，第２０巻，１１６９頁

本発明は、新規なアビエタンジテルペノイド系化合物を提供する。

また、本発明は榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物を有効成分とする心臓循環系疾患の予防及び治療用組成物を提供する。

本発明は、新規なアビエタンジテルペノイド系化合物、及び榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物を有効成分とする心臓循環系疾患の予防及び治療用組成物を提供する。

本発明の組成物は、心臓循環系疾患の予防及び治療に有用な製薬組成物及び健康食品組成物を含む。

以下、本発明に対して詳しく説明する。
本発明は、下記化学式１で表される新規なアビエタンジテルペノイド系化合物を提供する。

（式中、Ｒは、ジメトキシメチルである。）

前記化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物は、１２−ヒドロキシアビエチック−８，１１，１３−トリエン−１８−ジメチルアセタルである。

また、本発明は榧抽出物、またはそれから分離した下記化学式１で表されるアビエタンジテルペノイド系化合物または下記化学式２ないし化学式５で表されるテルペノイド系化合物の中から選択される、いずれか一つの化合物を有効成分とする心臓循環系疾患の予防及び治療用組成物を提供する。

（式中、Ｒはメチル、ヒドロキシメチル、アルデヒド、メチルエステルまたはジメトキシメチルである。）

前記化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物の中でフェルギノール（ｆｅｒｒｕｇｉｎｏｌ、Ｒ＝メチル）、１８−ヒドロキシフェルギノール（１８−ｈｙｄｒｏｘｙｆｅｒｒｕｇｉｎｏｌ、Ｒ＝ヒドロキシメチル）、１８−オキソフェルギノール（１８−ｏｘｏｆｅｒｒｕｇｉｎｏｌ、Ｒ＝アルデヒド）、及び１２−ヒドロキシアビエチック−８，１１，１３−トリエン−１８−オイック酸メチルエステル（Ｒ＝メチルエステル）を含む。化学式２及び３の化合物は、アビエタンジテルペノイド系化合物であるイソピマル酸（ｉｓｏｐｉｍａｒｉｃ ａｃｉｄ）及びデヒドロアビエチノール（ｄｅｈｙｄｒｏａｂｉｅｔｉｎｏｌ）で、化学式４の化合物はラブダンジテルペノイド系化合物であるカヤジオール（ｋａｙａｄｉｏｌ）で、かつ、化学式５の化合物はセスキテルペノイド系化合物であるデルタ−カジノール（δ−ｃａｄｉｎｏｌ）である。

前記化学式１ないし５の化合物等は、製薬的に許容される塩の形態で使用することができ、通常の方法によって製造されるすべての塩、水和物及び溶媒化物が含まれる。

本発明で使用する榧抽出物は、榧の葉、枝または種子を水、アルコールまたはその混合溶液で抽出して使用する。ここで、アルコールは、メタノール、エチルアルコール及びブタノールの中から選択したものを使用する。

また、榧抽出物から分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物は、通常の方法によって得ることができ、市販されている試薬を使用することができる。

本発明による榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物の抽出、分離及び精製方法を下記に示す。

乾燥した榧の葉（枝または種子）に水を加えて４０〜１２０℃で２〜２４時間煮た後、ろ過して抽出液及び固体状残留物を得る。取得した抽出液を減圧濃縮して榧の葉（枝または種子）熱水抽出物を得る。

または、乾燥した榧の葉（枝または種子）をメタノール（またはエチルアルコール）中に３週間放置してろ過した後、ろ過液に炭を入れて１２時間室温で撹拌する。この溶液をろ過して濃縮した後、そこに水を入れて懸濁させてもう一度ろ過する。前記で得た上層を酢酸エチルで溶解して、濃縮して黄色の油性物質を得る。前記で得た濃縮液をジクロロメタンに溶解した後、ｎ−ヘキサンをゆっくり加えて再結晶をした後、ガラスフィルターを利用してろ過して、液相を濃縮して油性物質を得る。

ここで、得たオイル分画について低密度脂質タンパク質に対する抗酸化活性及びヒトアシルコＡ：コレステロール転移酵素１と２に対する抑制能を測定した結果、二重性阻害効果を示す。

前記で得た酢酸エチルオイル分画をｎ−ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒を移動相にしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離する。ここで、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９８：２、９７：３、９５：５、１０：１、５：１、３：１、１：１及び酢酸エチル１００％（ｖ／ｖ）の移動相溶媒条件にして１７個の分画物（分画１〜１７）に分離する。

この中で一番優秀な抗酸化活性を示す分画８（５９３ｍｇ）をｎ−ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒を移動相にしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離する。ここで、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９８：２、９５：５、１０：１、５：１、３：１、１：１及び酢酸エチル１００％（ｖ／ｖ）の移動相溶媒条件にして、１１個の分画物（分画８−１〜８−１７）に分離する。この中で抗酸化活性が一番優秀な分画８−８〜８−１０の混合物（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５：１ないし１：１溶媒条件、１４９ｍｇ）は、分取用ＴＬＣ（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ＝８０：１の移動相溶媒条件）及びセパデックスＬＨ−２０カラム（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ＝１：１の溶媒条件）を利用して精製された二つの化合物を得る。すなわち、化学式１の化合物の中で１２−ヒドロキシアビエチック−８，１１，１３−トリエン−１８−ジメチルアセタル（Ｒ＝ジメトキシメチル、１８ｍｇ）と１２−ヒドロキシアビエチック−８，１１，１３−トリエン−１８−オイック酸メチルエステル（Ｒ＝メチルエステル、１７．５ｍｇ）を得る。

また、前記で得た酢酸エチルオイル分画を酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合溶媒を移動相にしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離する。ここで、移動相溶媒は、酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１０〜２０：９０〜８０（ｖ／ｖ）溶媒を使用するのが好ましい。前記のような方法によって、乾燥した榧の葉１ｋｇ当たり純粋活性物質である化学式１の化合物中でフェルギノール（Ｒ＝メチル、２２ｍｇ）、１８−ヒドロキシフェルギノール（Ｒ＝ヒドロキシメチル、３０７ｍｇ）及び１８−オキソフェルギノール（Ｒ＝アルデヒド、６２ｍｇ）を得る。

また、前記で得た酢酸エチルオイル分画を酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合溶媒を移動相にしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離する。ここで、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１、５：１、３：１、１：１（ｖ／ｖ）及び酢酸エチル１００％の移動相溶媒条件にして、１１個の分画物（分画１〜１１）に分離する。

この中で阻害活性が強い分画５をｎ−ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒を移動相にしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離する。ここで、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝７：１（ｖ／ｖ）の移動相溶媒条件で展開させて、７個の分画物（分画５−１〜５−７）に分離する。ＡＣＡＴ阻害活性がすぐれた分画５−４をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離する。ここで、クロロホルム１００％の移動相溶媒条件にして４個の分画物（分画５−４−１〜５−４−４）に分離する。分画５−４−１で純粋活性物質である化学式２の化合物（イソピマル酸、７６ｍｇ）を得る。

前記で実施した一番目のカラムで得た分画１０を塩化メチレン：メタノール＝５０：１（ｖ／ｖ）の移動相溶媒条件でシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施して１４個の分画物（分画１０−１〜１０−１４）に分離する。ここで活性分画１０−４をメタノール：水＝１５：１の移動相溶媒条件でＣ１８逆相カラムクロマトグラフィーを実施して１１個の分画物（分画１０−４−１〜１０−４−１１）に分離する。この中で阻害活性が強い分画１０−４−５をｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５０：１、３０：１、１０：１、１：１（ｖ／ｖ）及び酢酸エチル１００％を移動相溶媒条件にしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施して５個の分画物（１０−４−５−１〜１０−４−５−５）に分離する。分画１０−４−５−２から純粋活性物質である化学式３の化合物（デヒドロアビエチノール、２５ｍｇ）を得る。

また、一番目のカラムで得た分画１１を再結晶溶媒であるｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５：１（ｖ／ｖ）を利用して純粋活性物質である化学式４の化合物（カヤジオール、４０ｍｇ）を得る。

前記で実施した二番目のカラムで１４個の分画中の活性分画である分画１０−６をメタノール：水＝１０：１（ｖ／ｖ）を移動相溶媒にしてＣ１８逆相カラムクロマトグラフィーを実施した結果、１２個の分画物（分画１０−６−１〜１０−６−１２）に分離する。この中の活性分画１０−６−３をｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１５：１、１０：１、５：１、１：１（ｖ／ｖ）及び酢酸エチル１００％を移動相溶媒条件でシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離して、５個の分画物（分画１０−６−３−１〜１０−６−３−５）に分離する。分画１０−６−３−１から純粋活性物質である化学式５の化合物（デルタ−カジノール、１５ｍｇ）を得る。

本発明の榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物は、ＩＣ_５０値が低く現れ、低密度脂質タンパク質に対して優秀な抗酸化活性を示す。

また、本発明の榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物は、ｈＡＣＡＴ−１及びｈＡＣＡＴ−２でＡＣＡＴに対する活性を効果的に抑制する。

また、本発明の榧抽出物は、血清ＬＤＬを減少させると同時に血中コレステロールを下げる作用をする。

したがって、本発明の組成物は、コレステリルエステルの合成及び蓄積に誘発される高脂血症及び動脈硬化症のような心臓循環系疾患の予防及び治療に有用に使用することができる。

本発明の組成物は、前記榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物に同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上追加して含むことができる。

本発明の組成物は、投与のために前記記載した有効成分以外に薬剤学的に許容可能な運搬体をさらに１種以上含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な運搬体としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストローズ溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中から１成分以上を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、整菌剤等他の通常の添加剤を添加することができる。また希薄剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液等のような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法で、またはレミングストンの製剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）最近版に開示されている方法を使用して、各疾患または成分に合わせて製剤化することができる。

本発明の組成物は、目的と方法によって非経口投与（例えば静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）又は経口投与することができ、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。一日の投与量は、榧抽出物の場合１０〜２，０００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは５０〜５００ｍｇ／ｋｇである。また、前記化学式１ないし５の化合物の場合０．１〜１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇであり、一日に一回ないし数回に分けて投与することがさらに好ましい。

本発明の榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物をマウスに経口投与して毒性実験を遂行した結果、経口投与毒性試験による５０％致死量（ＬＤ_５０）が、少なくとも１，０００ｍｇ／ｋｇ以上の安全な物質であると判断された。

本発明の組成物は、心臓循環系疾患の予防及び治療のために単独で、または手術、ホルモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用することができる。

本発明の組成物は、心臓循環系疾患の改善を目的に健康食品に添加することができる。本発明の榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物を食品添加物として使用する場合、前記榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物をそのまま添加したり他の食品または食品成分と共に使用することができ、通常の方法によって適切に使用することができる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）によって適合するように決めることができる。一般的に、食品または飲料の製造時には本発明の榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物は、原料に対して１〜２０重量％、好ましくは５〜１０重量％の量で添加する。しかし、健康及び衛生を目的とするまたは健康調節を目的にする長期間の摂取の場合には、前記量は前記範囲以下であり得て、安全性面で何らの問題がないので有効成分は前記範囲以上の量でも使用することができる。

前記食品の種類には、特別な制限はない。前記物質を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤等があり、通常の意味での健康食品を全て含む。

本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料と同様に様々な香味料または天然炭水化物等を追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコールである。甘味料としてはタウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料等を使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍｌ当たり一般的に約０．０１〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２〜０．０３ｇである。

前記以外に本発明の組成物は、さまざまな栄養剤、ビタミン、電解質、風味料、着色料、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤等を含むことができる。その他に本発明の組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、独立的にまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合は、それほど重要ではないが本発明の組成物１００重量部当たり０．０１〜０．１重量部の範囲で選択することが一般的である。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例及び実験例を提示する。しかし、下記の実施例及び実験例は本発明をより易しく理解するために提供するだけのものであり、これによって本発明の内容が限定されるものではない。

榧からのアビエタンジテルペノイド系化合物の抽出、分離及び精製
１．榧の葉からの熱水抽出物の製造
大韓民国済州島で購入した榧の葉１ｋｇを洗浄して乾燥させた。乾燥した榧の葉２５０ｇに１０００ｍｌの水を加えて９０℃で４時間煮た後、ろ過して抽出液及び固相残留物を得た。取得した抽出液を減圧濃縮して３０ｇの榧の葉熱水抽出物を得た。

２．榧種子からの熱水抽出物の製造
堅い皮を除去して、粉砕機を利用して粉砕した榧の種子１２０ｇに５００ｍｌの水を加えて９０℃で４時間煮た後、ろ過して抽出液及び固相残留物を得た。取得した抽出液を減圧濃縮して９ｇの榧種子熱水抽出物を得た。

３．榧の葉からのアルコール抽出物の製造
大韓民国済州島で購入した榧の葉２．１６ｋｇを洗浄して乾燥させた。乾燥した榧の葉を１００％エチルアルコール１８ｌに入れて常温で３週間放置してろ紙でろ過した後、ろ過液に炭を入れて室温で１２時間撹拌した。この溶液をろ過して減圧下で濃縮して黄色の油性物質を得た。

４．榧抽出物からのアビエタンジテルペノイド系化合物の分離及び精製
前記３で得た黄色の油性物質に水１０００ｍｌを加えて懸濁させて、ｎ−ヘキサン、クロロホルム及び酢酸エチルの順に分画して、ｎ−ヘキサン可溶抽出物７５ｇ、クロロホルム可溶抽出物３７ｇ及び酢酸エチル可溶抽出物１８ｇをそれぞれ取得した。

酢酸エチル層から得た黄色い油性物質の脂質タンパク質に対する抗酸化効果を観察した結果、低密度脂質タンパク質に対する抗酸化活性が優れていることを確認した。

前記で得た酢酸エチルオイル分画１８ｇをｎ−ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒を移動相にしてシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：Ｍｅｒｋ、Ａｒｔ ９３８５、カラムサイズ：φ７×４０ｃｍ）で分離した。ここで、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９８：２、９７：３、９５：５、１０：１、５：１、３：１、１：１及び酢酸エチル１００％（ｖ／ｖ）の移動相溶媒条件にそれぞれ１．５ｌずつを展開させて、１７個の分画物（分画１〜１７）に分離し、各分画物の抗酸化活性を観察した。

この中で一番優秀な抗酸化活性を示す分画８（５９３ｍｇ）をｎ−ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒を移動相にしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離した。ここで、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９８：２、９５：５、１０：１、５：１、３：１、１：１及び酢酸エチル１００％（ｖ／ｖ）の移動相溶媒条件にそれぞれ１００ｍｌずつを展開させて、１１個の分画物（分画８−１〜８−１７）に分離し、各分画物の抗酸化活性を観察した。観察の結果、抗酸化活性が一番優秀な分画８−８〜８−１０の混合物（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５：１ないし１：１溶媒条件、１４９ｍｇ）を、分取用ＴＬＣ（ｐｒｅｐ ＴＬＣ、Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｆ_２５４、Ｍｅｒｃｋ、Ａｒｔ ５７４４、ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ＝８０：１の移動相溶媒条件）及びセパデックスＬＨ−２０カラム（ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０ ｃｏｌｕｍｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国、ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ＝１：１の溶媒条件）を利用して精製し、二つの化合物を得た。すなわち、化学式１の化合物中の二つの化合物（１８ｍｇ、１７．５ｍｇ）を得た。

５．アビエタンジテルペノイド系化合物の構造分析
前記４で得た化合物は、ＶＧ高分解能ＧＣ／ＭＳ分光器（ＶＧ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＧＣ／ＭＳ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、Ｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ＭＳ、Ａｕｔｏｓｐｅｃ−ｕｌｔｉｍａ）を使って分子量及び分子式を決定し、旋光度は偏光器（Ｊａｓｃｏ ＤＩＰ−１８１ ｄｉｇｉｔａｌ ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ）を使って測定した。また核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ ３００、５００）を通じて^１Ｈ ＮＭＲ、^１３Ｃ ＮＭＲ、ホモ−コジ（ＨＯＭＯ−ＣＯＳＹ）、ＨＭＱＣ（^１Ｈ−Ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）、ＨＭＢＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｂｏｎｄ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）、ＤＥＰＴ（Ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｌｅｓｓ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｂｙ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）スペクトルを得て、分子構造を決めた。

測定結果は下記に示すとおりであり、発表されている文献の記録と比較分析した結果、化学式１の化合物の中で一つの化合物は、１２−ヒドロキシアビエチック−８，１１，１３−トリエン−１８−ジメチルアセタルでまだ報告されていない新規な化合物であり、もう一つの化合物は、１２−ヒドロキシアビエチック−８，１１，１３−トリエン−１８−オイック酸メチルエステル（Ｃｈｅｍ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｐｏｄ （Ｅｎｇｌ． Ｔｒａｎｓｌ），１９８８年，第２４巻，４４７頁）と確認した。

［１２−ヒドロキシアビエチック−８，１１，１３−トリエン−１８−ジメチルアセタル］

（式中、Ｒは、ジメトキシメチルである。）
１） 物性：黄色油性
２） 旋光度：［α］_Ｄ ^２５ −５．８°（ｃ＝０．３， ＣＨＣｌ_３）
３） 分子量：３４６
４） 分子式：Ｃ_２２Ｈ_３４Ｏ_３
５） ^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， ５００ ＭＨｚ） δ ０．９ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−１９）， １．１２ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−２０）， １．１５ （ｄ， Ｊ＝７．２Ｈｚ， Ｈ−１６）， １．１６ （ｄ， Ｊ＝７．２Ｈｚ， Ｈ−１７）， １．２７ （ｄｔ， Ｊ＝４．２， １２．７Ｈｚ， Ｈ−１ａ）， １．３６−１．４３ （ｍ， ２Ｈ， Ｈ−３）， １．５３−１．６２ （ｍ， ２Ｈ， Ｈ−２）， １．６４−１．７５ （ｍ， ２Ｈ， Ｈ−６）， １．８１ （ｄｄ， Ｊ＝１．７， １２．１ Ｈｚ， Ｈ−５）， ２．０５ （ｄ ｌｉｋｅ， Ｊ＝１２．６Ｈｚ， Ｈ−１ｂ）， ６．５５ （ｓ， １Ｈ， Ｈ−１１）， ６．７５ （ｓ， １Ｈ， Ｈ−１４）。
６） ^１３Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， １２５ ＭＨｚ） δ １６．７ （Ｃ−１９）， １８．３ （Ｃ−２）， １９．４ （Ｃ−６）， ２２．５ （Ｃ−１６）， ２２．７ （Ｃ−１７）， ２５．２ （Ｃ−２０）， ２６．７ （Ｃ−１５）， ２９．３ （Ｃ−７）， ３０．４ （Ｃ−３）， ３７．３ （Ｃ−１０）， ３８．２ （Ｃ−１）， ４２．６ （Ｃ−４）， ４２．８ （Ｃ−５）， ５８．７ （Ｃ−１８ｂ）， ５９．０ （Ｃ−１８ａ）， １１０．９ （Ｃ−１１）， １１３．３ （Ｃ−１８）， １２６．５ （Ｃ−１４）， １２６．９ （Ｃ−８）， １３１．４ （Ｃ−１３）， １４８．７ （Ｃ−９）， １５０．７ （Ｃ−１２）。
７） ＥＩＭＳ （ｒｅｌ． ｉｎｔ．） ｍ／ｚ ［Ｍ］^＋ ５９ （２２％）， ７５ （１００％）， １８９ （１４％）， ２０１ （１０％）， ３４６ （３３％）。

［１２−ヒドロキシアビエチック−８，１１，１３−トリエン−１８−オイック酸メチルエステル］

（式中、Ｒは、メチルエステルである。）
１） 物性：黄色油性
２） 旋光度：［α］_Ｄ ^２５ ＋７５．７°（ｃ＝０．２８， ＥｔＯＨ）
３） 分子量：３３０
４） 分子式：Ｃ_２１Ｈ_３０Ｏ_３
５） ^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， ５００ＭＨｚ） δ １．１２ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−２０）， １．１５ （ｄ， Ｊ＝７．４ Ｈｚ， ３Ｈ， Ｈ−１６）， １．１６ （ｄ， Ｊ＝７．３ Ｈｚ， ３Ｈ， Ｈ−１７）， １．１９ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−１９）， １．２９ （ｍ， １Ｈ， Ｈ−６α）， １．４１ （ｍ， １Ｈ， Ｈ−２α）， １．５５−１．７７ （ｍ， ５Ｈ， Ｈ−１α， Ｈ−２β， Ｈ−３， Ｈ−６β）， ２．１２ （ｄ ｌｉｋｅ， Ｊ＝１２．７ Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−１β）， ２．１４ （ｄｄ， Ｊ＝１．７， １２．５ Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−５）， ２．７４ （ｍ， ２Ｈ， Ｈ−７）， ３．０４ （ｍ， １Ｈ， Ｈ−１５）， ３．５９ （ｓ， ３Ｈ， ＣＯ_２Ｍｅ）， ４．５８ （ｓ， −ＯＨ）， ６．５５ （ｓ， １Ｈ， Ｈ−１１）， ６．７４ （ｓ， １Ｈ， Ｈ−１４）。
６） ^１３Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３， １２５ ＭＨｚ） δ １６．５ （Ｃ−１９）， １８．５ （Ｃ−２）， ２１．８ （Ｃ−６）， ２２．５ （Ｃ−１６）， ２２．７ （Ｃ−１７）， ２５．０ （Ｃ−２０）， ２６．８ （Ｃ−１５）， ２９．２ （Ｃ−７）， ３６．６ （Ｃ−１）， ３６．９ （Ｃ−４）， ３８．０ （Ｃ−３）， ４４．８ （Ｃ−５）， ４７．７ （Ｃ−１０）， ５１．９ （−ＯＭｅ）， １１０．８ （Ｃ−１１）， １２６．７ （Ｃ−１４）， １２７．０ （Ｃ−８）， １３１．７ （Ｃ−１３）， １４７．９ （Ｃ−９）， １５０．８ （Ｃ−１２）， １７９．２ （Ｃ−１８）。

榧からのアビエタンジテルペノイド系化合物の抽出、分離及び精製
１．榧の葉からのアルコール抽出物の製造
大韓民国済州島で購入した榧の葉１ｋｇを洗浄して乾燥させた。乾燥した榧の葉を９５％メタノール４ｌに入れて常温で３週間放置してろ紙でろ過した後、ろ液に炭を入れて室温で１２時間撹拌した。この溶液をろ過して減圧下で濃縮して黄色の油性物質を得た。

２．榧抽出物からのアビエタンジテルペノイド系化合物の分離及び精製
前記１で得た黄色の油性物質に水２００ｍｌを入れて懸濁させて、ろ紙を利用してろ過した。上層を酢酸エチルで溶解して、濃縮して黄色の油性物質４０ｇを得た。前記で得た濃縮液をジクロロメタンに溶解した後、ｎ−ヘキサンをゆっくり加えて再結晶をした後、ガラスフィルターを利用してろ過して液相を濃縮して３０ｇの油性物質を得た。

ここで、得たオイル分画について低密度脂質タンパク質に対する抗酸化活性及びヒトアシルコＡ：コレステロール転移酵素１と２に対する抑制能を測定した結果、二重性阻害効果を示す。

前記で得たオイル分画３０ｇを酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合溶媒を移動相にしてシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：Ｍｅｒｋ， Ａｒｔ ９３８５， カラムサイズ：φ７×４０ｃｍ）で分離した。ここで、移動相溶媒として、酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：９（ｖ／ｖ）溶媒を使用した場合、活性物質が最も効果的に分離した。ここで純粋活性物質であるフェルギノール（Ｒ＝メチル，２２ｍｇ）、１８−ヒドロキシフェルギノール（Ｒ＝ヒドロキシメチル，３０７ｍｇ）及び１８−オキソフェルギノール（Ｒ＝アルデヒド，６２ｍｇ）を得た。

また、無色固体の化合物１８−ヒドロキシフェルギノール（Ｒ＝ヒドロキシメチル）１００ｍｇをジクロロメタン５ｍｌに溶解してｎ−ヘキサン１０ｍｌをゆっくり加えた。ここで、ジエチルエーテル１ｍｌを入れて、２４時間室温で放置した。このようにして得た単結晶は、Ｘ−線結晶分析法を利用して１８−ヒドロキシフェルギノールの立体化学を決定することができた。

３．アビエタンジテルペノイド系化合物の構造分析
前記２で得た物質の構造分析結果は下記に示すとおりであり、化学式２の化合物は、フェルギノール（Ｒ＝メチル）、１８−ヒドロキシフェルギノール（Ｒ＝ヒドロキシメチル）及び１８−オキソフェルギノール（Ｒ＝アルデヒド）［Ｌ． Ｊ． Ｈａｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｙ． Ａｓａｋａｗａ， Ｐｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８７年， 第２６巻， １２１１頁］と確認した。

［フェルギノール］

（式中、Ｒは、メチルである。）
１） 物性：無色オイル
２） 旋光度：［α］_Ｄ ^２５ ＋５６．６°（ｃ＝０．６， ＣＨＣｌ_３）
３） 分子量：２８６
４） 分子式：Ｃ_２０Ｈ_３０Ｏ
５） ^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， ３００ＭＨｚ） δ ０．９０（ｓ， ３Ｈ， Ｈ−１８）， ０．９３（ｓ， ３Ｈ， Ｈ−１９）， １．１６ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−２０）， １．２１（ｄ， Ｊ＝５．１Ｈｚ， ３Ｈ， Ｈ−１６）， １．２３（ｄ， Ｊ＝５．１Ｈｚ， ３Ｈ， Ｈ−１７）， １．２０（ｄｄ， Ｊ＝３．０， １０．４Ｈｚ， １Ｈ）， １．２２（ｔ ｌｉｋｅ， Ｊ＝５．１Ｈｚ， ６Ｈ， Ｈ−１８， １９）， １．３１ （ｄｄ， Ｊ＝１．７， ９．３Ｈｚ， １Ｈ）， １．３８（ｄｄ， Ｊ＝２．８， １０．４Ｈｚ， １Ｈ）， １．５８−１．８９（ｍ， ３Ｈ）， １．８４（ｍ， １Ｈ）， ２．１５（ｄｄ ｌｉｋｅ， Ｊ＝０．７， ８．７Ｈｚ， １Ｈ）， ２．７６（ｄｄｄ， Ｊ＝１．３， ５．３， ８．５Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−７ａ）， ２．８５（ｄｄｄ， Ｊ＝１．３， ５．２， ８．６Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−７ｂ）， ３．１０（ｍ， １Ｈ， Ｈ−１５）， ４．４９（ｂｒ， １Ｈ， −ＯＨ）， ６．６２（ｓ， １Ｈ， Ｈ−１３）， ６．８２（ｓ， １Ｈ， Ｈ−１０）。
６） ^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， ７５ＭＨｚ） δ １９．２（Ｃ−２）， １９．３（Ｃ−６）， ２１．６（Ｃ−１９）， ２２．５（Ｃ−１６）， ２２．７（Ｃ−１７）， ２４．８（Ｃ−２０）， ２６．８（Ｃ−１５）， ２９．７（Ｃ−７）， ３３．３（Ｃ−１８）， ３３．４（Ｃ−４）， ３７．５（Ｃ−１０）， ３８．８（Ｃ−１）， ４１．７（Ｃ−３）， ５０．３（Ｃ−５）， １１０．９（Ｃ−１１）， １２６．６（Ｃ−１４）， １２７．３（Ｃ−８）， １３１．３（Ｃ−１３）， １４８．７（Ｃ−９）， １５０．６（Ｃ−１２）。
７） ＥＩＭＳ（ｒｅｌ． ｉｎｔ．） ｍ／ｚ ［Ｍ］＋ ６９（７８．４）， （６４．５）， １５９．１（４７．５）， １７５．１（９０．７）， １８７．１（６３．８）， ２０１．１（８６．０）， ２１５．１（５４．４）， ２２９．２（５６．５）， ２７１．２（１００）， ２８６．２ （９９．６）。

［１８−ヒドロキシフェルギノール］

（式中、Ｒは、ヒドロキシメチルである。）
１） 物性：無色プリズム、融点（Ｍ．Ｐ．）＝１８５〜１８７℃
２） 旋光度：［α］_Ｄ ^２５ ＋１１０°（ｃ＝０．２， ＣＨＣｌ_３）
３） 分子量：３０２
４） 分子式：Ｃ_２０Ｈ_３０Ｏ_２
５） ^１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ， ５００ＭＨｚ） δ ０．８４（ｓ， ３Ｈ， Ｈ−１９）， １．１６（ｔ ｌｉｋｅ， Ｊ＝５．７Ｈｚ， ６Ｈ， Ｈ−１６， １７）， １．１８（ｓ， ３Ｈ， Ｈ−２０）， １．３１（ｍ， ２Ｈ， Ｈ−３）， １．５１（ｄｔ， Ｊ＝３．９， １３．４Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−２ａ）， １．６５（ｍ， ３Ｈ， Ｈ−６， Ｈ−２ｂ）， １．７９（ｍ， ２Ｈ， Ｈ−１）， ２．２０（ｄ ｌｉｋｅ， Ｊ＝１２．７Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−５）， ２．７５（ｄ ｌｉｋｅ， Ｊ＝７．７Ｈｚ， ２Ｈ， Ｈ−７）， ３．０９（ｄ， Ｊ＝１１．０Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−１８ａ）， ３．２２（ｍ， １Ｈ， Ｈ−１５）， ３．３０（ｓ， １Ｈ， −ＯＨ）， ３．４１（ｄ， Ｊ＝１１．０Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−１８ｂ）， ６．６３（ｓ， １Ｈ， Ｈ−１１）， ６．７８（ｓ， １Ｈ， Ｈ−１４）。
６） ^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ， １２５ＭＨｚ） δ １８．０（Ｃ−１９）， １９．８（Ｃ−２）， ２０．１（Ｃ−６）， ２３．２（Ｃ−１６， １７）， ２５．８（Ｃ−２０）， ２７．７（Ｃ−１５）， ３０．４（Ｃ−７）， ３６．３（Ｃ−３）， ３８．４（Ｃ−４）， ３８．９（Ｃ−１０）， ３９．９（Ｃ−１）， ４５．０（Ｃ−５）， ７２．０（Ｃ−１８）， １１１．６（Ｃ−１１）， １２６．９（Ｃ−１４）， １２７．２（Ｃ−８）， １３３．２ （Ｃ−１３）， １４９．１（Ｃ−９）， １５３．１（Ｃ−１２）。
７） ＥＩＭＳ（ｒｅｌ． ｉｎｔ．） ｍ／ｚ ［Ｍ］＋ １４７（４６．５）， １７５（７０．２）， １８９（７８．０）， ２０１（４５．０）， ２２７（５０．７）， ２６９（１００．０）， ２８７（６０．０）， ３０２（９５．１）。

［１８−オキソフェルギノール］

（式中、Ｒは、アルデヒドである。）
１） 物性：無色プリズム、融点（Ｍ．Ｐ．）＝１４０〜１４２℃
２） 旋光度：［α］_Ｄ ^２５ ＋６１°（ｃ＝０．２， ＣＨＣｌ_３）
３） 分子量：３００
４） 分子式：Ｃ_２０Ｈ_２８Ｏ_２
５） ^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， ３００ＭＨｚ） δ １．１３（ｓ， ３Ｈ， Ｈ−１９）， １．２１（ｓ， ３Ｈ， Ｈ−２０）， １．２２ （ｄ， Ｊ＝４．２３Ｈｚ， ６Ｈ， ３Ｈ−１６，１７）， １．２８（ｍ， ２Ｈ）， １．４４（ｍ， ３Ｈ）， １．７９（ｍ， ３Ｈ）， ２．２２（ｍ， １Ｈ）， ２．７９（ｍ， ２Ｈ， Ｈ−７）， ３．０９（ｍ， １Ｈ， Ｈ−１５）， ４．５２（ｓ， １Ｈ， Ｃ１２−ＯＨ）， ６．６２（ｓ， １Ｈ， Ｈ−１１）， ６．８２（ｓ， １Ｈ， Ｈ−１４）， ９．２４（ｓ， １Ｈ， −ＣＨＯ）。
６） ^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， ７５ＭＨｚ） δ １４．０（Ｃ−１９）， １７．８（Ｃ−２）， ２１．５（Ｃ−６）， ２２．５（Ｃ−１６）， ２２．７（Ｃ−１７）， ２５．０（Ｃ−２０）， ２６．８（Ｃ−１５）， ２９．０（Ｃ−７）， ３２．０（Ｃ−３）， ３６．２（Ｃ−１０）， ３７．８（Ｃ−１）， ４２．８（Ｃ−５）， ４９．８（Ｃ−４）， １１０．８（Ｃ−１１）， １２６．７（Ｃ−８）， １２６．９（Ｃ−１４）， １３２．０（Ｃ−１３）， １４７．２（Ｃ−９）， １５０．９（Ｃ−１２）， ２０６．４（Ｃ−１８）。

榧からテルペノイド系化合物の抽出、分離及び精製
１．榧からの抽出、分離及び精製
大韓民国済州島で購入した榧の葉１ｋｇを洗浄して乾燥させた。乾燥した榧の葉を１００％メタノール４ｌに入れて常温で３週間放置してろ紙でろ過した後、ろ液に炭（１００ｇ）を入れて室温で１２時間撹拌した。この溶液をろ過して減圧下で濃縮して黄色の油性物質を得た。ここに水２００ｍｌを入れて懸濁させてろ紙を利用してろ過した。前記で得た上層を酢酸エチルで溶解して、濃縮して黄色の油性物質４０ｇを得た。前記で得た濃縮液をジクロロメタンに溶解した後、ｎ−ヘキサンをゆっくり加えて再結晶をした後、ガラスフィルターを利用してろ過して液相を濃縮して３０ｇの油性物質を得た。

ここで、前記で得たオイル分画についてヒトアシルコＡ：コレステロールアシル転移酵素１と２に対する抑制能を測定した結果、阻害効果を示した。

前記で得たオイル分画の一部１６ｇを酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合溶媒を移動相にしてシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル ： Ｍｅｒｋ， Ａｒｔ ９３８５， カラムサイズ：φ７×４０ｃｍ）で分離した。ここで、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１、５：１、３：１、１：１（ｖ／ｖ）及び酢酸エチル１００％の移動相溶媒条件にそれぞれ１０００ｍｌずつを展開させて、１１個の分画物（分画１〜１１）に分離し、各分画物のＡＣＡＴ阻害活性を観察した。

この中で阻害活性が強い分画５（６ｇ）をｎ−ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒を移動相にしてシリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：φ４×２０ｃｍ）で分離した。ここで、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝７：１（ｖ／ｖ）の移動相溶媒条件で展開させて、それぞれ２５０ｍｌずつ７個の分画物（分画５−１〜５−７）に分離した。ＡＣＡＴ阻害活性が優れた分画５−４（１００ｍｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：φ２．５×１０ｃｍ）で分離した。ここで、クロロホルム１００％の移動相溶媒条件で展開させて、それぞれ５０ｍｌずつ４個の分画物（分画５−４−１〜５−４−４）に分離した。ここで、分画５−４−１から純粋活性物質である化学式２の化合物（２５ｍｇ）を得た。

前記で実施した一番目のカラムで得た分画１０（１．３４ｇ）は、塩化メチレン：メタノール＝５０：１（ｖ／ｖ）の移動相溶媒条件で展開させながらシリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：φ１．５×２０ｃｍ）を実施した結果、それぞれ５０ｍｌずつ１４個の分画物（分画１０−１〜１０−１４）に分離した。ここで、活性分画１０−４（１００ｍｇ）をメタノール：水＝１５：１の移動相溶媒条件で展開させながらＣ１８逆相カラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：φ１．５×１０ｃｍ）を実施した結果、それぞれ４５ｍｌずつ１１個の分画物（分画１０−４−１〜１０−４−１１）に分離し、各分画物のＡＣＡＴ阻害活性を観察した。この中で阻害活性が強い分画１０−４−５（７２ｍｇ）をｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５０：１、３０：１、１０：１、１：１（ｖ／ｖ）及び酢酸エチル１００％を移動相溶媒条件で展開させながらシリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：φ１×８ｃｍ）を実施した結果、それぞれ３０ｍｌずつ５個の分画物（１０−４−５−１〜１０−４−５−５）に分離した。分画１０−４−５−２から純粋活性物質である化学式３の化合物（７６ｍｇ）を得た。

また、一番目のカラムで得た分画１１（１４９ｍｇ）を再結晶溶媒であるｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５：１（ｖ／ｖ）を利用して化学式４の化合物（４０ｍｇ）を得た。

前記で実施した二番目のカラムで、１４個の分画の中で活性分画である分画１０−６（８５ｍｇ）をメタノール：水＝１０：１（ｖ／ｖ）を移動相溶媒に使用して、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：φ１．５×１３ｃｍ）を実施した結果、４５ｍｌずつ１２個の分画物（分画１０−６−１〜１０−６−１２）に分離し、この中で活性分画１０−６−３（４０ｍｇ）をｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１５：１、１０：１、５：１、１：１（ｖ／ｖ）及び酢酸エチル１００％を移動相溶媒条件で展開させながらシリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：φ１×７ｃｍ）で分離して、それぞれ３０ｍｌずつ５個の分画物（分画１０−６−３−１〜１０−６−３−５）に分離した。ここで、分画１０−６−３−１から純粋活性物質である化学式５の化合物（１５ｍｇ）を得た。

２．テルペノイド系化合物の構造分析
前記１で得た化合物の構造を分析した結果、化学式２はイソピマル酸（ｉｓｏｐｉｍａｒｉｃ ａｃｉｄ）［Ｙ．−Ｈ． Ｋｕｏ ａｎｄ Ｗ．−Ｃ． Ｃｈｅｎ， Ｊ． Ｃｈｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９９年， 第４６巻， ８１９頁］、化学式３はデヒドロアビエチノール（ｄｅｈｙｄｒｏａｂｉｅｔｉｎｏｌ）［Ｈ． Ｌ． Ｚｉｅｇｌｅｒ 等．， Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ．， ２００２年， 第６８巻， ５４７頁］、化学式４はカヤジオール（ｋａｙａｄｉｏｌ）［Ｊ． Ｄ． Ｐ． Ｔｅｒｅｓａ 等．， Ａｒｇｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９７１年， 第３５巻， １０６８頁］、及び化学式５はデルタ−カジノール（δ−ｃａｄｉｎｏｌ）［Ｂμｌｌ， Ｃｈｅｍ， Ｓｏｃ， Ｊｐｎ． １９６３年， 第３７巻， １０５３頁］と確認した。

［化学式２］：イソピマル酸

１） 物性：無色プリズム、融点（Ｍ．Ｐ．）＝１８５〜１８７℃
２） 旋光度：［α］_Ｄ ^２５ ＋１０．５°（ｃ＝０．４２， ＥｔＯＨ）
３） 分子量：３０２
４） 分子式：Ｃ_２０Ｈ_３０Ｏ_２
５） ^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， ５００ＭＨｚ） δ ０．８６ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−１９）， ０．９１ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−２０）， １．１２ （ｍ， １Ｈ）， １．２７ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−１７）， １．３７ （ｍ， ２Ｈ）， １．４８ （ｍ， １Ｈ）， １．５５ （ｍ， ３Ｈ）， １．６７−２．０３ （ｍ， ９Ｈ）， ４．８７ （ｄｄ， Ｊ＝１．７， １０．８Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−１６ａｂ， Ｈ−１６ａｘ）， ４．９３ （ｄｄ， Ｊ＝０．６， １７．５Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−１６ｂａ， Ｈ−１６ｂｘ）， ５．３２ （ｄ ｌｉｋｅ， Ｊ＝４．１Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−７）， ５．８０ （ｄｄ， Ｊ＝１０．８， １７．６Ｈｚ， Ｈ−１５ａｘ， Ｈ−１５ｂｘ）， １２．１ （ｂｒｓ， １Ｈ， −ＣＯＯＨ）。
６） ^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， １２５ＭＨｚ） δ １５．３ （Ｃ−２０）， １７．１ （Ｃ−１９）， １７．９ （Ｃ−２）， ２０．０ （Ｃ−１７）， ２５．２ （Ｃ−６）， ３５．０ （Ｃ−１０）， ３６．１ （Ｃ−１２）， ３６．８ （Ｃ−３）， ３７．０ （Ｃ−１３）， ３８．８ （Ｃ−１）， ４５．０ （Ｃ−５）， ４６．１ （Ｃ−４）， ４６．３ （Ｃ−１４）， ５２．０ （Ｃ−９）， １０９．３ （Ｃ−１６）， １２１．０ （Ｃ−７）， １３５．７ （Ｃ−８）， １５０．３ （Ｃ−１５）， １８５．６ （Ｃ−１８）。
７） ＥＩＭＳ（ｒｅｌ． ｉｎｔ．） ｍ／ｚ ［Ｍ］^＋ １０５ （４０．７）， １８７ （３６．９）， ２４１ （４７．８）， ２５７ （３０．９）， ２７３ （２６．９）， ２８７ （４７．１）， ３０２ （１００．０）。

［化学式３］：デヒドロアビエチノール

１） 物性：粘性オイル
２） 旋光度：［α］_Ｄ ^２５ ＋５０°（ｃ＝０．２４，ＣＨＣｌ_３）
３） 分子量：２８６
４） 分子式：Ｃ_２０Ｈ_３０Ｏ
５） ^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， ３００ＭＨｚ） δ ０．９０ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−１９）， １．２２ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−２０）， １．２３ （ｔ ｌｉｋｅ， Ｊ＝３．６Ｈｚ， ６Ｈ， Ｈ−１６， １７）， １．３４−１．５０ （ｍ， ３Ｈ， Ｈ−１α， Ｈ−３）， １．６３−１．８２ （ｍ， ５Ｈ， Ｈ−２， ５， ６）， ２．２９ （ｄ ｌｉｋｅ， Ｊ＝１２．６Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−１β）， ２．７９−２．９２ （ｍ， ３Ｈ， Ｈ−７， １５）， ３．２４ （ｄ， Ｊ＝１１．１Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−１８α）， ３．４８ （ｄ， Ｊ＝１１．１Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−１８β）， ６．８９ （ｓ， １Ｈ， Ｈ−１４）， ６．９９ （ｄ， Ｊ＝８．１Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−１２）， ７．１９ （ｄ， Ｊ＝７．８Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−１１）。
６） ^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， ７５ＭＨｚ） δ １７．４ （Ｃ−１９）， １８．６ （Ｃ−２）， １８．８ （Ｃ−６）， ２４．０ （Ｃ−１６， １７）， ２５．３ （Ｃ−２０）， ３０．１ （Ｃ−７）， ３３．４ （Ｃ−１５）， ３５．１ （Ｃ−３）， ３７．３ （Ｃ−１０）， ３７．８ （Ｃ−４）， ３８．４ （Ｃ−１）， ４３．９ （Ｃ−５）， ７２．２ （Ｃ−１８）， １２３．８ （Ｃ−１２）， １２４．２ （Ｃ−１１）， １２６．８ （Ｃ−１４）， １３４．７ （Ｃ−８）， １４５．５ （Ｃ−１３）， １４７．３ （Ｃ−９）。
７） ＥＩＭＳ（ｒｅｌ． ｉｎｔ．） ｍ／ｚ ［Ｍ］^＋ １５９ （４７．５）， １７３ （６０．９）， １８５ （２７．０）， ２５３ （１００）， ２７１ （８７．２）， ２８６ （３２．６）。

［化学式４］：カヤジオール

１） 物性：無定形粉末
２） 旋光度：［α］_Ｄ ^２５ ＋１８．４°（ｃ＝０．３，ＣＨＣｌ_３）
３） 分子量：３０６
４） 分子式：Ｃ_２０Ｈ_３４Ｏ_２
５） ^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， ５００ＭＨｚ） δ ０．７２ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−２０）， ０．７５ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−１８）， １．０２ （ｄｔ， Ｊ＝４．２， １２．７Ｈｚ， １Ｈ）， １．２８ （ｍ， １Ｈ）， １．３５ （ｄｔ， Ｊ＝４．２， １２．７Ｈｚ， １Ｈ）， １．３７−１．４８ （ｍ， ４Ｈ）， １．５５−１．６５ （ｍ， ５Ｈ）， １．６７ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−１６）， １．７６−１．８４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．００ （ｄｔ， Ｊ＝４．６， １２．６Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３８ （ｍ， １Ｈ）， ３．１０ （ｄ， Ｊ＝１０．９Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−１９ａ）， ３．４２ （ｄ， Ｊ＝１０．９Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−１９ｂ）， ４．１５ （ｄ， Ｊ＝６．７Ｈｚ， ２Ｈ， Ｈ−１５）， ４．５２ （ｓ， １Ｈ， Ｈ−１７ａ）， ４．８４ （ｓ， １Ｈ， Ｈ−１７ｂ）， ５．３９ （ｔ， Ｊ＝６．６Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−１４）。
６） ^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， １２５ＭＨｚ） δ １５．０ （Ｃ−２０）， １６．４ （Ｃ−１６）， １７．６ （Ｃ−２）， １８．７ （Ｃ−１１）， ２１．８ （Ｃ−６）， ２４．２ （Ｃ−１９）， ３５．４ （Ｃ−３）， ３８．０ （Ｃ−１）， ３８．１ （Ｃ−１２）， ３８．４ （Ｃ−１０）， ３８．６ （Ｃ−７）， ３９．５ （Ｃ−４）， ４８．５ （Ｃ−５）， ５６．２ （Ｃ−９）， ５９．４ （Ｃ−１５）， ７２．０ （Ｃ−１８）， １０５．５ （Ｃ−１７）， １２３．１ （Ｃ−１４）， １４０．５ （Ｃ−１３）， １４８．３ （Ｃ−８）。

［化学式５］：デルタ−カジノール

１） 物性：白色粉末、融点（Ｍ．Ｐ．）＝１３５．５〜１３６℃
２） 旋光度：［α］_Ｄ ^２５ １００°（ｃ＝０．２４，ＣＨＣｌ_３）
３） 分子量：２２２
４） 分子式：Ｃ_１５Ｈ_２６Ｏ
５） ^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， ３００ＭＨｚ） δ ０．７９ （ｄ， Ｊ＝６．９Ｈｚ， ３Ｈ， Ｈ−１２ ｏｒ Ｈ−１３）， ０．８７ （ｄ， Ｊ＝６．６Ｈｚ， ３Ｈ， Ｈ−１３ ｏｒ Ｈ−１２）， １．０９ （ｍ， １Ｈ）， １．２８ （ｍ， １Ｈ）， １．２７ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−１５）， １．４１−１．６０ （ｍ， ６Ｈ）， １．６３ （ｓ， ３Ｈ， Ｈ−１４）， １．８５−２．０１ （ｍ， ５Ｈ）， ５．５１ （ｄ ｌｉｋｅ， Ｊ＝４．２Ｈｚ， １Ｈ， Ｈ−７）。
６） ^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， ７５ＭＨｚ） δ １５．３， １８．５， ２１．５， ２１．７， ２３．６， ２６．４， ２７．９， ３１．１， ３５．３， ３６．８， ４４．１， ４５．４， ７２．５ （Ｃ−２）， １２４．６ （Ｃ−７）， １３４．３ （Ｃ−６）。

実験例１：ＴＢＡＲＳ法による榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物の抗酸化活性
本発明の榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物の低密度脂質タンパク質に対する抗酸化活性を調べるために、下記のような実験を遂行した。

Ｃｕ^２＋は、低密度脂質タンパク質の酸化を誘導（Ｃｕ^２＋ ｍｅｄｉａｔｅｄ ＬＤＬ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）すると知られている。したがって、本発明ではその時に生成された不飽和脂肪酸の酸化産物であるジアルデヒド（ｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ）をＴＢＡ（ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ）方法で測定して、榧抽出物またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物の抗酸化活性を調査した（Ａｈｎ， Ｂ． Ｔ． ｅｔ． ａｌ．， Ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｆ Ｓａｕｒｕｒｕｓ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ． Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ． ２００１年， 第６４巻， １５６２頁）。

ヒトの血漿３００ｍｌを超遠心分離器で１００，０００×ｇで２４時間遠心分離して上層に浮遊した高密度脂質タンパク質（ＶＬＤＬ）／カイロミクロン（ｃｈｙｌｏｍｉｃｒｏｎ）層を除去して残った溶液の比重を１．０６３ｇ／ｍｌに合わせた後、１００，０００×ｇで２４時間遠心分離して再び上層に浮遊した低密度脂質タンパク質２５ｍｌ（１．５〜２．５ｍｇタンパク質／ｍｌ）を分離した。

このようにして分離した低密度脂質タンパク質２０μｌ（タンパク質濃度、５０〜１００μｇ／ｍｌ）を１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）２１０μｌと混合して、前記実施例で製造した榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物の溶液をそれぞれ１０μｌずつ添加した。

榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物は、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に溶解して使用し、実験に使用する前に様々な濃度に希釈した。陰性対照群には溶媒のみを添加したものを使用し、陽性対照群にはプロブコール（ｐｒｏｂｕｃｏｌ）を添加したものを使用した。

前記溶液に０．２５ｍＭ ＣｕＳＯ_４ １０μｌを添加して３７℃で４時間反応させて、２０％トリクロロアセト酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ＴＣＡ）溶液１ｍｌを添加して反応を終わらせた。０．０５Ｎ ＮａＯＨ溶液に溶解した０．６７％ＴＢＡ溶液１ｍｌを添加して１０秒間撹拌した後、９５℃で５分間加熱して発色反応が起きるようにし、氷水で溶液を冷却した。この溶液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄み液を分離し、紫外線−可視光線分光器で５４０ｎｍでの吸光度を測定して前記発色反応で生成されたマロンジアルデヒド（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）の量を求めた。

一方、テトラメトキシプロパン（マロンアルデヒドビス（ジメチルアセタル））［ｔｅｔｒａｍｅｔｈｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ ｍａｌｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ ｂｉｓ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｌ）］の保存溶液を利用して０〜１０ｎｍｏｌマロンジアルデヒドを含むＰＢＳ標準溶液を２５０μｌずつ作った。

この標準溶液を前記のような方法で発色させて５４０ｎｍでの吸光度を測定して、マロンジアルデヒドの標準曲線を求めた。

榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物を使用した前記実験で、マロンジアルデヒドの量は、この標準曲線を利用して定量した。

結果は、表１に示した。

表１に示されたように、本発明の榧抽出物（葉、種子の熱水抽出物及びメタノール抽出物）、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物のＩＣ_５０値が低く現れ、低密度脂質タンパク質に対する抗酸化活性が優れていることが分かる。

したがって、本発明による榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物は、低密度脂質タンパク質が酸化して誘発されることが知られた高脂血症及び動脈硬化症のような心臓循環系疾患の予防または治療に有用に使用することができる。

実験例２：本発明の榧抽出物またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物のＡＣＡＴ活性に及ぼす影響
本発明の榧抽出物またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物のＡＣＡＴ活性に及ぼす影響を調べるために、下記のような実験を遂行した。

１．ＡＣＡＴ酵素源の製造
ヒトＡＣＡＴ−１及びＡＣＡＴ−２の活性に及ぼす影響を調べるために、バキュロウイルス発現体剤を利用してヒトＡＣＡＴ−１とＡＣＡＴ−２タンパク質を得た。

ヒトの肝臓ｃＤＮＡライブラリースクリーニング（ｌｉｂｒａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を通じて得られたｈＡＣＡＴ−１とｈＡＣＡＴ−２のｃＤＮＡをバキュロウイルス伝達ベクターに挿入して、昆虫細胞であるｓｆ９細胞に導入してウイルスを製造した。その後、プラク精製（ｐｌａｑｕｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法でｈＡＣＡＴ−１とｈＡＣＡＴ−２の組換えウイルスを分離した後、３回の増幅過程を経てバイラルストック（ｖｉｒａｌ ｓｔｏｃｋ）のタイター（ｔｉｔｅｒ）を高めた。タンパク質発現効率が良いＨｉ５昆虫細胞に組換えウイルスを感染多重度（Ｍｕｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が１になるように感染させた後、２７℃で一日の間振蕩培養した。

培養されたｈＡＣＡＴ−１とｈＡＣＡＴ−２は、それぞれ過剰発現しているＨｉ５細胞からミクロゾーム分画を分離するために、５００×ｇで１５分間遠心分離して細胞を集めて保存緩衝液（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ ｂｕｆｆｅｒ）で急冷凍急解凍方法で細胞を壊した後、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。

得られたミクロゾーム分画は、タンパク質濃度が８ｍｇ／ｍｌになるように保存緩衝液に懸濁して使用前まで低温冷凍機に保管した。

２．ＡＣＡＴ活性測定
アセトンに１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したコレステロール溶液６．６７μｌを、アセトン中の１０％トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）ＷＲ−１３３９（Ｓｉｇｍａ社）６μｌと混合して、窒素ガスを使用してアセトンを蒸発させて除去した。得られた混合物に蒸留水を加えてコレステロールの濃度が３０ｍｇ／ｍｌになるように調節した。

１０μｌのコレステロール水溶液に、１０μｌの１Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７．４）、５μｌの０．６ｍＭ牛血清アルブミン（ＢＳＡ；ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、前記１で得た１０μｌのミクロゾーム溶液、１０μｌの試料（榧抽出物またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物）及び４５μｌの蒸留水を加えた（総９０μｌ）。混合物を３７℃水浴で３０分間予備反応させた。

１０μｌの（１−^１４Ｃ）オレイル−ＣｏＡ溶液（０．０５μＣｉ，最終濃度：１０μＭ）を予備反応させた混合物に加えて、生成された混合物を３７℃水浴で３０分間反応させた。そこに５００μｌのイソプロパノール：ヘプタン混合物（４：１（ｖ／ｖ））、３００μｌのヘプタン及び２００μｌの０．１Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７．４）を加えて、混合物をボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）で激しく混合した後、常温で２分間放置した。

生成された２００μｌの上層液をシンチレーション瓶に入れて、シンチレーション液（Ｌｕｍａｃ）４ｍｌを加えた。この混合物の放射線量は、１４５０マイクロベータ液体シンチレーション計数器（１４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ ｌｉｑｕｉｄ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｅｒ， Ｗａｌｌａｃｏｙ， Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定した。

ＡＣＡＴ活性は、測定された放射線量から時間当りの放射線量を計算して１分間にタンパク質１ｍｇ当たりに合成されたコレステリルオレエート（ピコモル）（ピコモル／分／ｍｇタンパク質）で計算した。

結果は、表２に示した。

表２に示されたように、本発明の榧抽出物（葉、種子の熱水抽出物及びメタノール抽出物）、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物は、ｈＡＣＡＴ−１及びｈＡＣＡＴ−２でアシル−ＣｏＡ：コレステロール転移酵素に対する阻害活性が非常に優れていることが分かる。

したがって、本発明による榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物は、コレステリルエステルの合成及び蓄積により誘発される高脂血症及び動脈硬化症のような心臓循環系疾患の予防または治療に有用に使用することができる。

実験例３：本発明の榧抽出物による血中コレステロール降下効果
本発明の榧抽出物の血中コレステロール降下効果を調べるために、下記のような実験を遂行した。

６週齢の特定病原体不在（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｆｒｅｅ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのオス３０匹を温度２２±３℃、湿度５５±１０％、照明１２Ｌ／１２Ｄの動物室内で飼育した。マウスは、実験に使用する前１週間程度順化させた。７週齢（体重：２０〜２２ｇ）になった時、乱塊法（ｒａｍｄｏｍｉｚｅｄ ｂｌｏｃｋ ｄｅｓｉｇｎ）によって５群に分けた。１群のマウスには高コレステロール／高脂肪食餌（ＣＲＦ−１；ＡＩＮ−７６ 実験動物用正常食餌に１．２５％コレステロールと１５％脂肪を含んだ食餌，Ｏｒｉｅｎｔ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， 日本）を、２群のマウスには高コレステロール／高脂肪食餌に１％榧の葉メタノール抽出物（または１％榧の葉熱水抽出物）を含んだ食餌を、３群のマウスには高コレステロール／高脂肪食餌に０．１％プロブコールを含んだ食餌をそれぞれ摂取させた。すべての食餌群のマウスに１０日間、該当食餌を水と一緒に自由に摂取できるようにし、食餌摂取量を毎日記録して５日間隔で体重を測定した。動物飼育が終わった後、飼育日誌の資料を分析した結果、食餌摂取量と体重増加においては３群の間に有意的な差がなく、正常な成長を見せた。

動物実験を始めてから１０日後、３群すべてのマウスを致死させた後、血液を分析した。

致死させたマウスのレトロ−オルビタルシヌス（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｓｉｎｕｓ）でヘパリン処理された毛細管で血液を採取して、この血液を８，０００×ｇで１０分間遠心分離して上層部の血漿を分離して超低温冷凍庫に保管してから血液分析に使用した。

総コレステロール（ＴＣ）の含量は、各実験群の血清から血液化学分析機（ＣＩＢＡ Ｃｏｒｎｉｎｇ ５５０ Ｅｘｐｒｅｓｓ，米国）を使用して直接測定した。また、ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ）の場合は、各実験群の血清にデキストランスルファートと硫酸マグネシウムを添加してＬＤＬとＶＬＤＬを沈澱させた後、上層液内のＨＤＬを測定する方法（文献［(1)Ｓｔｅｉｎ Ｅ．Ａ．，等，： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ−ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． １９７８年，第２４巻，１１１２−１１１５頁；(2)Ｆｉｎｌｅｙ Ｐ．Ｒ．，等，： Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ： ｕｓｅ ｏｆ Ｍｇ^２＋／ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｉｎ ｉｔｓ ｅｎｚｙｍｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．， １９７８年，第２４巻，９３１−９３３頁；(3)Ｗａｒｎｉｃｋ Ｇ．Ｒ．，等 ： Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ−Ｍｇ^２＋ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． １９８２年，第２８巻，１３７９−１３８８頁］参照）を応用して作られたＨＤＬ測定用試薬（Ｃｈｉｒｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏ．， 米国）を各実験群の血漿と１：１０の割合で混合して２０〜２５℃培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で５分間反応させた後、８，０００×ｇで１０分間遠心分離して得られた上層液を血液化学分析機に移して測定した。コンピューター統計プログラム（マイクロソフトエクセル、バージョン７．０）を使用してそれぞれのマウスから得られた血液分析値の実験群間の有意差を分析及び検定（ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔ）した。

測定されたすべてコレステロール及びＨＤＬ−コレステロールの濃度を表３及び表４に示した。

表３に示されたように、本発明の榧の葉メタノール抽出物投与群では対照群に比べて血中総コレステロールの量が２８．１％減少した。一方、陽性対照群であるプロブコールは対照群に比べて総コレステロールの量が１４．５％減少した。

また表４に示されたように、本発明の榧の葉熱水抽出物投与群では対照群に比べて血中総コレステロールの量が１１．７％減少した。一方、陽性対照群であるプロブコールは対照群に比べて総コレステロールの量が１１．５％減少した。

しかし、榧抽出物と陽性対照群であるプロブコールの血中ＨＤＬの量は対照群と類似で、相対的に血中ＬＤＬの量を減少させることが分かる。

したがって、本発明の榧抽出物は、血清ＬＤＬを減少させると同時に血中コレステロールを下げることにより、心臓循環系疾患の予防または治療に有用に使用することができる。

実験例４：マウスに対する経口投与急性毒性実験
本発明による榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物の急性毒性を調べるために、下記のような実験を遂行した。

４週齢の特定病原体不在（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｆｒｅｅ）ＩＣＲマウスのメス１２匹とオス１２匹（オスとメスそれぞれ３匹／用量群）を温度２２±３℃、湿度５５±１０％、照明１２Ｌ／１２Ｄの動物室内で飼育した。マウスは実験に使用する前１週間程度順化させた。実験動物用飼料（（株）第一製糖、マウス及びラット用）及び飲水は滅菌後、供給して自由摂取させた。

前記実施例で製造した榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物を０．５％Ｔｗｅｅｎ８０を溶媒にして５０ｍｇ／ｍｌ濃度で調剤した後、マウス体重２０ｇ当たり０．０４ｍｌ（１００ｍｇ／ｋｇ）、０．２ｍｌ（５００ｍｇ／ｋｇ）、０．４ｍｌ（１，０００ｍｇ／ｋｇ）ずつ経口投与した。試料は、単回経口投与して投与後７日間、次のように副作用または致死の有無を観察した。すなわち、投与当日は投与後１時間、４時間、８時間、１２時間後に、そして投与翌日から７日目までは、毎日午前、午後１回以上ずつ一般症状の変化及び死亡動物の有無を観察した。

また、投与７日目に動物を致死させて解剖した後、肉眼で内部臓器を検査した。投与当日から１日間隔で体重の変化を測定して榧抽出物またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物による動物の体重減少現象を観察した。

試験結果、試験物質を投与したすべてのマウスで特記に値する臨床症状はなく、斃死したマウスもなかった。また、体重変化、血液検査、血液生化学検査、剖検所見等でも毒性変化は観察されなかった。

したがって、本発明による榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物は、すべてのマウスで１，０００ｍｇ／ｋｇまで毒性変化を現わさなかったので、経口投与最小致死量（ＬＤ_５０）が少なくとも１，０００ｍｇ／ｋｇ以上の安全な物質であると判断された。

下記には、本発明の組成物のための製剤例を例示する。
製剤例１：製薬製剤の製造
本発明による榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物の中から選択して製薬製剤を製造した。

１．散剤の製造
化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物 ２ｇ
乳糖 １ｇ
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。

２．錠剤の製造
化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物 １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。

３．カプセル剤の製造
化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物 １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。

４．注射液剤の製造
化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物 １０μｇ／ｍｌ
希釈した塩酸ＢＰ ｐＨ３．５になるまで
注射用塩化ナトリウムＢＰ 最大１ｍｌ
適当な容積の注射用塩化ナトリウムＢＰの中に化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物を溶解させて、生成された溶液のｐＨを希釈した塩酸ＢＰを使ってｐＨ３．５に調節して、注射用塩化ナトリウムＢＰを使って容積を調節して充分に混合した。溶液を透明ガラスからなる５ｍｌタイプＩアンプルの中に充填して、ガラスを融解させることにより気密封入し、１２０℃で１５分以上オートクレーブして殺菌して注射液剤を製造した。

製剤例２：食品の製造
本発明による榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物の中から選択して食品等を次のように製造した。

１．料理用味付けタレの製造
化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物０．２〜１０重量％で健康増進用料理用味付けタレを製造した。

２．トマトケチャップ及びソースの製造
化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物０．２〜１．０重量％をトマトケチャップまたはソースに添加して、健康増進用トマトケチャップまたはソースを製造した。

３．小麦粉食品の製造
化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物０．１〜５．０重量％を小麦粉に添加して、この混合物を利用してパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造して、健康増進用食品を製造した。

４．スープ及び肉汁（ｇｒａｖｉｅｓ）の製造
化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物０．１〜１．０重量％をスープ及び肉汁に添加して、健康増進用肉加工製品、麺類のスープ及び肉汁を製造した。

５．牛ひき肉（ｇｒｏｕｎｄ ｂｅｅｆ）の製造
化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物１０重量％を牛ひき肉に添加して、健康増進用牛ひき肉を製造した。

６．乳製品（ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の製造
化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物０．１〜１．０重量％を牛乳に添加して、前記牛乳を利用してバター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。

７．禅食の製造
玄米、麦、もち米、鳩麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。

黒豆、黒ごま、えごまも公知の方法で蒸して乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。

化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物を真空濃縮機で減圧濃縮して、噴霧、熱風乾燥器で乾燥して得た乾燥物を粉砕機で粒度６０メッシュに粉砕して乾燥粉末を得た。

前記で製造した穀物類、種実類及び化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物の乾燥粉末を次の比率で配合して製造した。

穀物類（玄米３０重量％、鳩麦１５重量％、麦２０重量％）
種実類（えごま７重量％、黒豆８重量％、黒ごま７重量％）
化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物の乾燥粉末（１重量％）
霊芝（０．５重量％）
地黄（０．５重量％）

製剤例３：飲料の製造
本発明による榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物の中から選択して飲料を製造した。

１．炭酸飲料の製造
砂糖５〜１０％、クエン酸０．０５〜０．３％、カラメル０．００５〜０．０２％、ビタミンＣ０．１〜１％の添加物を混合して、そこに７９〜９４％の蒸留水を混ぜてシロップを作り、前記シロップを８５〜９８℃で２０〜１８０秒間殺菌して冷却水と１：４の割合で混合した後、炭酸ガスを０．５〜０．８２％注入して化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物を含む炭酸飲料を製造した。

２．健康飲料の製造
液状果糖（０．５％）、オリゴ糖（２％）、砂糖（２％）、食塩（０．５％）、水（７５％）のような副材料と化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物を均質に配合して瞬間殺菌をした後、それをガラス瓶、ペットボトル等の小容器に包装して健康飲料を製造した。

３．野菜ジュースの製造
化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物０．５ｇをトマトまたはにんじんジュース１，０００ｍｌに加えて、健康増進用野菜ジュースを製造した。

４．果物ジュースの製造
化学式１のアビエタンジテルペノイド系化合物０．１ｇをりんごまたはぶどうジュース１，０００ｍｌに加えて、健康増進用果物ジュースを製造した。

本発明の新規なアビエタンジテルペノイド系化合物、及び榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物は、低密度脂質タンパク質に対する抗酸化活性が優秀なだけでなく、ＡＣＡＴに対する活性を効果的に抑制する。また、本発明の榧抽出物は、血清ＬＤＬを減少させると同時に血中コレステロールを下げる効果がある。

したがって、本発明の組成物は、コレステリルエステルの合成及び蓄積により誘発される高脂血症及び動脈硬化症のような心臓循環系疾患の予防及び治療に有用に使用することができる。

Claims (8)

1. 下記化学式１で表されるアビエタンジテルペノイド系化合物。
   

   

   （式中、Ｒは、ジメトキシメチルである。）
2. 榧抽出物を有効成分とする心臓循環系疾患の予防及び治療用組成物。
3. 前記榧抽出物が、榧の葉、枝または種子の中から選択して抽出したものであることを特徴とする、請求項２に記載の心臓循環系疾患の予防及び治療用組成物。
4. 前記榧抽出物が、水、アルコールまたはその混合溶液により抽出したものであることを特徴とする、請求項２に記載の心臓循環系疾患の予防及び治療用組成物。
5. 前記アルコールが、メタノール、エチルアルコール及びブタノールの中から選択されたことを特徴とする、請求項４に記載の心臓循環系疾患の予防及び治療用組成物。
6. 下記化学式１ないし化学式５の化合物の中からいずれか一つの化合物を有効成分とする心臓循環系疾患の予防及び治療用組成物。
   

   

   （式中、Ｒはメチル、ヒドロキシメチル、アルデヒド、メチルエステルまたはジメトキシメチルである。）
   

   

   

   

   
7. 前記化学式１ないし化学式５の化合物が、榧から抽出分離精製して得たものであることを特徴とする、請求項６に記載の心臓循環系疾患の予防及び治療用組成物。
8. 前記心臓循環系疾患が、高脂血症または動脈硬化症であることを特徴とする、請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の心臓循環系疾患の予防及び治療用組成物。