KR100544349B1 - 신규한 피라졸린 유도체, 그의 제조방법 및 이를 함유하는심장순환계 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 피라졸린 유도체, 그의 제조방법 및 이를 함유하는 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 피라졸린 유도체는 저밀도 지질 단백질에 대한 항산화 활성이 우수할 뿐만 아니라 ACAT에 대한 활성을 효과적으로 억제한다.

따라서, 본 발명의 조성물은 콜레스테릴 에스테르의 합성 및 축적으로 유발되는 고지혈증 및 동맥경화증과 같은 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

신규한 피라졸린 유도체, 그의 제조방법 및 이를 함유하는 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 조성물{Novel pyrazoline derivatives, a process for the preparation thereof and composition comprising the same for prevention and treatment of cardiac circuit disease}

본 발명은 신규한 피라졸린 유도체(즉, 피라졸린계 화합물), 그의 제조방법 및 이를 함유하는 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

근래들어 동맥경화증 및 고콜레스테롤혈증 등과 같은 관상동맥성 심혈관 질환이 점차 주요한 사망 원인이 되고 있다.

심장순환계 질환의 대표적인 질환인 동맥경화증은 동맥이 비후되고 경화되어 탄력을 잃고 약해진 것으로서, 노화와 더불어 발생하는 주요 질환 중의 하나이다. 동맥경화는 뇌동맥 또는 관상동맥에서 일어나기 쉬운데, 뇌동맥경화증의 경우에는 두통, 현기증, 정신장애를 나타내고 뇌연화증의 원인이 되며, 관상동맥경화증의 경우에는 심장부에 동통과 부정맥을 일으켜 협심증, 심근경색 등의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 또한 이로 인해 고혈압, 심장병, 뇌일혈 등이 유발되어, 동맥경화 증으로 인한 질병이 현대 사회에 있어, 특히 50∼60대의 남성들에게 가장 큰 사망요인으로 부각되고 있다.

혈중 콜레스테롤 농도가 높으면 관상동맥성 심혈관 질환이 유발되기 쉬우므로, 혈중 콜레스테롤 농도를 줄이기 위해서는 콜레스테롤 및 지방의 섭취를 줄이는 식이요법을 시행하거나 지질대사와 관련된 효소를 저해함으로써 콜레스테롤의 흡수를 억제해야 한다.

따라서, 이러한 질병을 예방하려는 목적으로 종전부터 콜레스테롤 흡수의 억제와 생합성의 저해를 통한 혈장 LDL량을 감소시키려는 시도가 진행되어 왔다 (Principles in Biochemistry, lipid biosynthesis, 770-817, 3rd Edition, 2000 Worth Publishers, New York; Steinberg, N. Engl. J. Med., 1989, 320, 915-924).

최근에는 죽상경화증(atherosclerosis)의 요인으로 혈액내 LDL 산화물의 생성이 주요관심의 대상이 되고 있으며(Circulation, 1995, 91, 2488-2496; Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 1997, 17, 3338-3346), 특히 LDL의 과도산화와 구조변형을 통해 생성된 HM-LDL(highly modified LDL)의 대식세포(macrophage)로의 유입에 따른 거품세포(foam cell) 생성이 밝혀짐에 따라 LDL 퍼옥사이드의 생성요인과 제거에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다(Curr. Atheroscler. Res., 2000, 2, 363-372).

혈관벽내에 플라크(plaque) 형성과 파열은 심근경색 발병에 주요한 요인이며, 동맥경화는 혈관벽의 손상에 대한 만성 염증과정으로, 손상기작보다는 오히려 방어기작으로 제시되고 있다(Circ. Res. 2001, 89, 298-304).

아실 코에이:콜레스테롤 전이효소(acyl-CoA:cholesterol acyltransferase; ACAT)는 일반적으로 콜레스테롤을 에스테르화 하는 효소로서, 그 작용 기작은 크게 체내의 세 부위(장, 간, 그리고 혈관벽 세포)에서 일어난다.

첫째, 장에서 ACAT는 섭취된 콜레스테롤을 에스테르의 형태로 바꾸어 장내로 흡수되는 것을 촉진시킨다. 둘째, 외부로부터 흡수되거나 체내에서 생합성된 콜레스테롤은 간에서 VLDL(very low density lipoprotein)이라는 운반체안에 축적된 후 혈관을 통해 신체 각 기관으로 공급되는데, 이때 ACAT에 의하여 콜레스테롤이 콜레스테릴 에스테르 형태로 전환됨으로써 운반체 내에 콜레스테롤 축적이 가능하게 된다. 셋째, 동맥혈관벽을 이루는 세포내에서 ACAT는 콜레스테롤을 그의 에스테르 형태로 전환시켜 세포내에 콜레스테롤이 축적되는 것을 촉진시키는데, 이는 동맥경화를 일으키는 직접적인 원인이 된다.

또한, ACAT 활성에 의해 거품세포가 콜레스테롤로부터 유도된 다량의 콜레스테릴 에스테르를 포함하기 때문에, 실험적, 임상적인 측면에서 대식세포와 평활근세포로부터 유도된 거품세포의 형성은 매우 중요하다. 혈관벽내의 거품세포의 증식은 ACAT 활성 증가와 직접적으로 연관되어 있기 때문에 강력한 항동맥경화제로써 ACAT 저해제의 개발은 바람직하다.

따라서, ACAT의 활성을 억제하는 약물은 첫째, 장내 콜레스테롤의 흡수를 억제하여 체내로 유입되는 콜레스테롤의 양을 감소시킬 수 있을 것이며, 둘째, 간에서 혈관내로 콜레스테롤이 방출되는 것을 억제하여 혈중 콜레스테롤 농도를 떨어뜨릴 수 있고, 셋째, 혈관벽 세포에 콜레스테롤이 축적되는 것을 방지하여 직접적으 로 동맥경화를 예방할 수 있을 것으로 기대된다.

지금까지 보고된 ACAT 활성 저해제는 쥐간 마이크로좀 ACAT 또는 쥐간 대식세포(J774) ACAT에 대한 활성 저해제이다.

사람의 ACAT는 사람 ACAT-1 및 사람 ACAT-2가 있는데, 사람 ACAT-1(50 kDa)은 성인의 간, 부신, 대식세포, 신장에서 주로 작용하며, 사람 ACAT-2(46 kDa)는 소장에서 작용한다(Rudel, L. L. et al., Curr. Opin. Lipidol 12, 121-127, 2001). 사람 ACAT 활성을 저해하는 물질은 음식으로부터 유입되는 콜레스테롤의 흡수를 억제하고, 혈관내벽에 콜레스테릴 에스테르의 축적을 억제하는 기작을 통해 고콜레스테롤증, 콜레스테롤 결석 또는 동맥경화 예방 및 치료제의 표적이 되고 있다(Buhman, K. K. et al., Nature Medicine 6, 1341-1347, 2000).

현재 고지혈증 치료제로 사용되고 있는 프로부콜(Probucol), N,N'-디페닐렌디아민(N,N'-diphenylenediamine), 페놀계 합성 항산화제인 BHA (butylatedhydroxyanisol)와 BHT(butylated hydroxy toluene)는 LDL 콜레스테롤을 감소시키고, 산화정도를 약화시키며 병변형성을 감소시켜 항산화력은 우수하나, 부작용이 많아 사용이 제한되고 있다.

따라서, 동맥경화 환자에 있어서 LDL 항산화제와 함께 지질강하제의 병행투여 요법에 대한 관심도가 높아지고 있다.

이에, 본 발명자들은 기존의 고지혈증, 동맥경화증 치료제보다 우수한 치료제를 개발하기 위하여 새로운 피라졸린 유도체를 설계 및 합성하였으며, 이러한 피라졸린 유도체에서 저밀도 지질 단백질에 대한 항산화 활성 및 ACAT 효소에 대하여 우수한 저해 활성이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 신규한 피라졸린 유도체를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 피라졸린 유도체의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 피라졸린 유도체를 함유하는 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피라졸린 유도체(즉, 피라졸린계 화합물)를 제공한다.

(R¹은 수소 원자 또는 C₁~C₄의 알킬기이고; R²는 수소 원자, C₁~C₄의 알킬기, 히드록시기, 할로겐 원자, 페닐기 또는 니트로기이며; R³는 수소 원자, C₁~C₄의 알킬기, 메톡시기, 할로겐 원자 또는 페닐기임).

본 발명의 피라졸린 유도체는 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물이 포함된다.

상기 약학적으로 허용 가능한 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레인산, 우마린산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콘산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 트리플로로아세트산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 피라졸린 유도체 중 바람직한 화합물은 구체적으로 하기와 같다.

1) 3,5-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸

2) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,5-디-이소프로필-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸

3) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,5-디메틸-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸

4) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(2,3,5-트리메틸-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸

5) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,5-디-플루오로-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸

6) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(5-메톡시-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸

7) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,4-디-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸

8) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,5-디-페닐-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸

9) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3-니트로-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸

10) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸

또한, 본 발명은 피라졸린 유도체의 제조방법을 제공하며, 하기 반응식 1로 나타낸다.

(R¹은 수소 원자 또는 C₁~C₄의 알킬기이고; R²는 수소 원자, C₁~C₄의 알킬기, 히드록시기, 할로겐 원자, 페닐기 또는 니트로기이며; R³는 수소 원자, C₁~C₄의 알킬기, 메톡시기, 할로겐 원자 또는 페닐기임)

본 발명의 피라졸린 유도체의 제조방법은

1) 수소 원자, C₁~C₄의 알킬기, 히드록시기, 메톡시기, 할로겐 원자, 페닐기 또는 니트로기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 치환된 페닐이 1,3 위치에 치환된 α,β-불포화된 프로펜온과 히드라진을 반응시켜 피라졸린 유도체를 얻는 단계; 및

2) 상기 1)단계에서 얻은 피라졸린 유도체를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법으로 정제하는 단계로 이루어진다.

상기 반응을 구체적으로 설명하면, 제 1단계는 수소 원자, C₁~C₄의 알킬기, 히드록시기, 메톡시기, 할로겐 원자, 페닐기 또는 니트로기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 치환된 페닐이 1,3 위치에 치환된 α,β-불포화된 프로펜온을 에탄올 또는 메탄올 용매 등에 용해시키고, 여기에 1 내지 5몰당량의 히드라진을 넣는다. 반응 혼합물을 24시간 동안 교반 또는 환류시킨 후, 반응물을 실온으로 냉각시킨다. 과량의 물로 희석시키고, 유기용매(에틸아세테이트, 디클로로메탄)로 추출한 후, 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 염수로 세척한 다음, 건조, 여과 및 농축하여 피라졸린 유도체를 얻는다.

제 2단계는 상기 1단계에서 얻은 피라졸린 유도체들을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법으로 정제하여 순수한 피라졸린 유도체를 얻는다.

본 발명의 피라졸린 유도체의 또 따른 제조방법으로는 반응물을 실온으로 냉각시키고, 에탄올 용매를 제거한 다음 과량의 1차 증류수를 가한다. 여기에 에틸아세테이트를 가한 다음 n-헥산을 가하여 여과한다. 여과된 고체를 다시 메탄올 용매에 용해한 후 1차 증류수를 천천히 가하고, 침전된 고체를 여과한 후, 공기중에서 건조하여 순수한 피라졸린 화합물을 얻는다.

또한, 본 발명은 상기 피라졸린 유도체를 함유하는 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 피라졸린 유도체는 티비에이알에스법으로 측정한 결과, IC₅₀값이 낮게 나와 저밀도 지질 단백질에 대하여 우수한 항산화 활성을 나타낸다.

또한, 본 발명의 피라졸린 유도체는 사람 ACAT-1에서 ACAT에 대한 활성을 효과적으로 억제한다.

따라서, 본 발명의 조성물은 콜레스테릴 에스테르의 합성 및 축적으로 유발되는 고지혈증 및 동맥경화증과 같은 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 피라졸린 유도체에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 피라졸린 유도체가 약 0.1~100㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5~10㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 피라졸린 유도체를 마우스에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 경구 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1g/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단된다.

본 발명의 조성물은 심장순환계 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 심장순환계 질환의 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 피라졸린 유도체를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 피라졸린 유도체를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예 방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 피라졸린 유도체는 원료에 대하여 1~20 중량%, 바람직하게는 5~10 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 3,5-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸의 제조

1) 1,3-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)프로펜온[1,3-Bis-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propenone] 19g(0.04 m㏖)을 에탄올 300㎖에 녹인 후, 히드라진(55% in water) 11.2㎖(0.12 m㏖)을 적하 깔때기(dropping funnel)에 넣고 천천히 가하였다. 반응용액을 9시간 동안 환류시킨 후, 실온으로 냉각시키고, 에탄올 용매를 제거한 다음, 물 300㎖를 넣고 30분간 교반시켰다. 에틸아세테이트 200㎖로 2번 추출하고, 황산 마그네슘(MgSO₄)으로 건조, 여과, 농축하였다.

상기에서 얻은 화합물을 실리카 겔 크로마토그래피법을 이용하여 순수한 피라졸린 화합물 10.5g(55%)을 얻었다.

2) 또 따른 방법으로는 반응물을 실온으로 냉각시키고, 에탄올 용매를 제거한 다음 과량의 1차 증류수를 가하였다. 여기에 에틸아세테이트 100㎖를 가한 다음 n-헥산 500㎖를 가하여 여과하였다. 여과된 고체를 다시 메탄올 용매에 용해한 후 1차 증류수를 천천히 가하고, 침전된 고체를 여과한 후, 공기중에서 건조하여 순수한 피라졸린 유도체 8.0g(42%)을 얻었다.

분석결과는 다음과 같다.

¹H NMR(300 ㎒, CDCl₃) δ 1.45 (s, 18H), 1.46 (s, 18H), 3.0 (dd, J = 10.5, 16.2 ㎐, 1H), 3.43 (dd, J = 10.2, 15.9 ㎐, 1H), 4.83 (t like, J = 10.5 ㎐, 1H), 5.20 (s, 1H, -OH), 5.37 (s, 1H, -OH), 5.84 (br, 1H, -NH), 7.23 (s, 2H), 7.53 (s, 2H).

¹³C NMR(75 ㎒, CDCl₃) δ 30.23, 30.27, 34.38, 34.41, 42.2, 64.9, 123.1, 123.3, 124.4, 133.1, 136.0, 136.1, 152.6, 153.3, 154.7.

실시예 2 : 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,5-디-이소프로필-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸의 제조

출발물질로 1,3-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)프로펜온 대신 1-(3,5- 디-t-부틸-4-히드록시페닐)-3-(3,5-디-이소프로필-4-히드록시페닐)프로펜온을 첨가하는 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 표제 화합물을 얻었다.

¹H NMR(300 ㎒, CDCl₃) δ 1.25 (d, J = 6.6 ㎐, 3H), 1.27 (d, J = 6.6 ㎐, 3H), 1.46 (s, 18H), 2.99 (dd, J = 10.2, 16.5 ㎐, 1H), 3.14 (m, 1H), 3.44 (dd, J = 10.8, 16.5 ㎐, 1H), 4.83 (t like, J = 10.5 ㎐, 1H), 5.36 (s, 1H, -OH), 7.10 (s, 2H), 7.52 (s, 2H).

¹³C NMR(75 ㎒, CDCl₃) δ 22.6, 22.7, 27.4, 30.2, 34.4, 64.6, 121.8, 123.1, 124.4, 134.0, 134.6, 136.0, 149.5, 152.7, 154.7.

실시예 3 : 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,5-디메틸-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸의 제조

출발물질로 1,3-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)프로펜온 대신 1-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)-3-(3,5-디메틸-4-히드록시페닐)프로펜온을 첨가하는 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 표제 화합물을 얻었다.

¹H NMR(300 ㎒, CDCl₃) δ 1.46 (s, 18H), 2.23 (s, 6H), 3.02 (dd, J = 8.7, 16.8 ㎐, 1H), 3.42 (dd, J = 10.8, 16.2 ㎐ 1H), 4.77 (dd, J = 8.4, 10.2 ㎐, 1H), 5.29 (s, 1H, -OH), 5.38 (s, 1H, -OH), 5.38 (br, 1H, -NH), 6.98 (s, 2H), 7.53 (s, 2H).

¹³C NMR(75 ㎒, CDCl₃) δ 15.9, 30.2, 34.4, 41.9, 63.5, 123.2, 123.4, 124.3, 126.5, 134.8, 135.9, 151.7, 152.4, 154.7.

실시예 4 : 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(2,3,5-트리메틸-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸의 제조

출발물질로 1,3-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)프로펜온 대신 1-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)-3-(2,3,5-트리메틸-4-히드록시페닐)프로펜온을 첨가하는 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 표제 화합물을 얻었다.

¹H NMR(300 ㎒, CDCl₃) δ 1.45 (s, 18H), 2.21 (s, 6H), 2.26 (s, 3H), 2.88 (dd, J = 8.4, 15.6 ㎐, 1H), 3.45 (dd, J = 10.2, 15.9 ㎐, 1H), 5.10 (dd, J = 10.2, 10.8 ㎐, 1H), 5.36 (s, 1H), 5.78 (br, 1H, -NH), 7.13 (s, 1H), 7.51 (s, 2H).

¹³C NMR(75 ㎒, CDCl₃) δ 12.2, 15.3, 15.9, 30.2, 34.4, 40.9, 60.6, 120.3, 122.5, 123.1, 124.4, 125.0, 132.3, 132.7, 135.9, 151.1, 152.0, 154.7.

실시예 5 : 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,5-디-플루오로-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸의 제조

출발물질로 1,3-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)프로펜온 대신 1-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)-3-(3,5-디-플루오로-4-히드록시페닐)프로펜온을 첨가하는 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 표제 화합물을 얻었다.

¹H NMR(300 ㎒, CDCl₃) δ 1.45 (s, 18H), 2.98 (dd, J = 8.7, 16.5 ㎐, 1H), 3.48 (dd, J = 10.2, 16.2 ㎐, 1H), 4.80 (t like, J = 9.6 ㎐, 1H), 5.42 (s, 1H, -OH), 6.93 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 7.51 (s, 2H).

실시예 6 : 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(5-메톡시-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸의 제조

출발물질로 1,3-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)프로펜온 대신 1-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)-3-(5-메톡시-4-히드록시페닐)프로펜온을 첨가하는 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 표제 화합물을 얻었다.

¹H NMR(300 ㎒, CDCl₃) δ 1.46 (s, 18H), 3.18 (dd, J = 8.1, 15.9 ㎐, 1H), 3.43 (dd, J = 11.1, 16.5 ㎐ 1H), 3.87 (s, 3H), 4.79 (dd, J = 10.2, 10.5 ㎐, 1H), 5.37 (br, 1H, -OH), 6.78 - 6.95 (m, 3H), 7.51 (s, 2H).

¹³C NMR(75 ㎒, CDCl₃) δ 30.2, 34.4, 41.7, 56.0, 63.5, 110.7, 112.5, 117.7, 123.2, 124.2, 136.0, 136.6, 145.9, 146.1, 152.3, 154.8.

실시예 7 : 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,4-디히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸의 제조

출발물질로 1,3-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)프로펜온 대신 1-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)-3-(3,4-디히드록시페닐)프로펜온을 첨가하는 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 표제 화합물을 얻었다.

¹H NMR(300 ㎒, CDCl₃) δ 1.39 (s, 18H), 2.74 (dd, J = 9.9, 15.9 ㎐, 1H), 3.31 (dd, J = 10.5, 16.2 ㎐, 1H), 4.59 (t like, J = 10.2 ㎐, 1H), 6.59 (dd, J = 1.8, 8.1 ㎐, 1H), 6.66 (d, J = 8.1 ㎐, 1H), 6.76 (d, J = 1.8 ㎐, 1H), 7.08 (br, 1H, -NH), 7.11 (s, 1H, -OH), 7.38 (s, 2H), 7.39 (s, 2H), 8.74 (s, 1H, -OH), 8.85 (s, 1H, -OH).

¹³C NMR(75 ㎒, CDCl₃) δ 30.2, 34.5, 41.0, 63.2, 113.7, 115.3, 117.4, 122.0, 124.9, 134.3, 139.0, 144.3, 145.2, 149.5, 154.3.

실시예 8 : 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,5-디페닐-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸의 제조

출발물질로 1,3-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)프로펜온 대신 1-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)-3-(3,5-디페닐-4-히드록시페닐)프로펜온을 첨가하는 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 표제 화합물을 얻었다.

¹H NMR(300 ㎒, CDCl₃) δ 4.46 (s, 18H), 3.11 (dd, J = 9.0, 15.9 ㎐, 1H), 3.50 (dd, J = 10.2, 16.5 ㎐, 1H), 4.93 (t like, J = 9.9 ㎐, 1H), 5.37 (s, 1H, -OH), 5.40 (br, 1H, -NH), 7.32 - 7.57 (m, 14H).

실시예 9 : 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3-니트로-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸의 제조

출발물질로 1,3-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)프로펜온 대신 1-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)-3-(3-니트로-4-히드록시페닐)프로펜온을 첨가하는 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 표제 화합물을 얻었다.

¹H NMR(300 ㎒, CDCl₃) δ 1.46 (s, 18H), 2.96 (dd, J = 9.9, 15.9 ㎐, 1H), 3.52 (dd, J = 10.5, 15.9 ㎐, 1H), 4.91 (t like, J = 9.6 ㎐, 1H), 5.40 (s, 1H, -OH), 7.16 (d, J = 8.7 ㎐, 1H), 7.51 (s, 2H), 7.69 (d, J = 8.4 ㎐, 2H), 8.13 (d, J = 1.2 ㎐, 1H), 10.56 (br, 1H, -OH).

¹³C NMR(75 ㎒, CDCl₃) δ 30.2, 34.4, 41.9, 62.9, 120.6, 122.9, 123.2, 123.7, 135.4, 135.9, 136.1, 152.3, 154.5, 155.0.

실시예 10 : 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸의 제조

출발물질로 1,3-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)프로펜온 대신 1-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시페닐)-3-(4-히드록시페닐)프로펜온을 첨가하는 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 표제 화합물을 얻었다.

¹H NMR(300 ㎒, CDCl₃) δ 1.39 (s, 18H), 3.04 (dd, J = 7.8, 15.9 ㎐, 1H), 3.45 (dd, J = 10.2, 16.5 ㎐, 1H), 4.82 (dd, J = 10.5, 10.2 ㎐, 1H), 5.39 (br, 1H, -OH), 6.79 (d, J = 8.4 ㎐, 2H), 7.21 (d, J = 8.7 ㎐, 2H), 7.52 (s, 2H).

¹³C NMR(75 ㎒, CDCl₃) δ 30.2, 34.4, 41.7, 63.4, 115.7, 123.3, 123.9, 127.6, 135.0, 136.0, 152.9, 154.9, 155.5.

실험예 1 : TBARS법에 의한 피라졸린 유도체의 항산화 활성

본 발명의 피라졸린 유도체의 저밀도 지질 단백질에 대한 항산화 활성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

Cu²⁺은 저밀도 지질 단백질의 산화를 유도(Cu²⁺ mediated LDL-oxidation)하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 이 때 생성된 불포화 지방산의 산화산물인 디알데하이드(dialdehyde)를 TBA(thiobarbituric acid) 방법으로 측정하여, 피라졸린 유도체의 항산화 활성을 조사하였다(Packer, L. Ed. (1994) Methods in Enzymology Vol. 234, Oxygen radicals in biological systems Part D. Academic press, San Diego).

사람의 혈장 300㎖를 초원심분리기로 100,000 × g에서 24시간 동안 원심분리하여 상층에 부유된 고밀도 지질단백질(VLDL)/킬로마이크론(chylomicron)층을 제거하고 나머지 용액의 비중을 1.063 g/㎖로 맞춘 후, 100,000 × g에서 24시간 동안 원심분리하여 다시 상층에 부유된 저밀도 지질 단백질 25㎖(1.5~2.5 ㎎ 단백질/㎖)를 분리하였다.

이렇게 분리한 저밀도 지질 단백질 20㎕(단백질 농도, 50-100 ㎍/㎖)를 10 mM 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS) 210㎕와 혼합하고, 상기 실시예 1~10에서 제조한 피라졸린 유도체의 용액을 각각 10㎕씩 첨가하였다.

피라졸린 유도체는 DMSO(dimethylsulfoxide)에 녹여 사용하였으며, 실험에 사용하기 전에 여러 농도로 희석하였다. 음성 대조군으로는 용매만을 첨가한 것을 사용하였으며, 양성 대조군으로는 프로부콜(probucol)을 첨가한 것을 사용하였다.

상기 용액에 0.25mM CuSO₄ 10㎕를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시키고, 20% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA) 용액 1㎖를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 0.05N NaOH 용액에 녹인 0.67% TBA 용액 1㎖를 첨가하고 10초간 교반시킨 후 95℃에서 5분동안 가열하여 발색 반응이 일어나도록 하고 얼음물로 용액을 냉각하였다. 이 용액을 3000 rpm에서 5분동안 원심분리하여 상등액을 분리하였으며, 자외선-가시광선 분광기로 540㎚에서의 흡광도를 측정하여 상기 발색 반응으로 생성된 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA)의 양을 구하였다.

한편, 테트라메톡시프로판(말론알데하이드 비스(디메틸아세탈)) [tetramethoxypropane malonaldehyde bis(dimethylacetal)]의 저장용액을 이용하여 0~10 n㏖ 말론디알데하이드를 포함하는 PBS 표준용액을 250㎕씩 만들었다.

이 표준용액을 상기와 같은 방법으로 발색시켜 540㎚에서의 흡광도를 측정하고, 말론디알데하이드의 표준곡선을 구하였다.

피라졸린 유도체를 사용한 상기 실험에서 말론디알데하이드의 양은 이 표준곡선을 이용하여 정량하였다.

결과는 표 1에 나타내었다.

피라졸린 유도체의 저밀도 지질 단백질에 대한 항산화 활성

화합물		IC50(μM)
	R1=수소, R2=R3=t-부틸	0.1
	R1=수소, R2=R3=이소프로필	0.7
	R1=수소, R2=R3=메틸	0.2
	R1=R2=R3=메틸	0.6
	R1=수소, R2=R3=플루오로	0.2
	R1=R2=수소, R3=메톡시	0.1
	R1=R3=수소, R2=히드록시	0.3
	R1=수소, R2=R3=페닐	0.6
	R1=R3=수소, R2=니트로	0.3
	R1=R2=R3=수소	0.2
양성대조군	프로부콜	0.6

표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 피라졸린 유도체들의 IC₅₀값이 낮게 나 와 저밀도 지질 단백질에 대한 항산화 활성이 우수함을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 의한 피라졸린 유도체는 저밀도 지질 단백질이 산화되어 유발되는 것으로 알려진 고지혈증 및 동맥경화증과 같은 심장순환계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

실험예 2 : 본 발명의 피라졸린 유도체의 ACAT 활성에 미치는 영향

본 발명의 피라졸린 유도체의 ACAT 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1. ACAT 효소원의 제조

1) 쥐간 ACAT

ACAT 효소원으로 흰 쥐(male Sprague-Dawley 150~200g)의 간을 적출하였다. 1g의 간을 5㎖의 균질화 용액(0.1 M KH₂PO₄, pH 7.4, 0.1mM EDTA 및 10mM β-머캅토에탄올)에 균질화하였다. 이 균질액을 4℃에서 3,000 × g로 10분 동안 원심분리하고, 얻어진 상층액을 4℃에서 15,000 × g로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 상층액을 초원심분리 튜브(Beckman)에 넣고, 4℃에서 100,000 × g로 1시간 동안 원심분리하여 마이크로좀 펠렛을 얻은 후, 이를 3㎖의 균질화 용액에 현탁시키고 4℃에서 100,000 × g로 1시간 동안 원심분리하였다. 얻어진 펠렛을 1㎖의 균질화 용액에 현탁시켰다. 얻어진 현탁액중의 단백질 농도를 로우리(Lowry) 등의 방법으로 측정하고, 단백질 농도를 4 내지 8 ㎎/㎖로 조절하였다. 얻어진 현탁액을 저온냉동기(deep freezer; Forma Scientific Inc.)에 보관하였다.

2) 사람 ACAT-1 및 사람 ACAT-2

사람 ACAT-1 및 ACAT-2의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 베큘로바이러스 발현체제를 이용하여 사람 ACAT-1과 ACAT-2 단백질을 얻었다.

사람 간 cDNA library screening을 통하여 얻어진 hACAT-1과 hACAT-2의 cDNA를 베큘로바이러스 전달 벡터에 삽입하고, 곤충세포인 sf9 세포에 도입하여 바이러스를 제조하였다. 그 후, 플라크 정제(plaque purification) 방법으로 hACAT-1과 hACAT-2의 재조합 바이러스를 분리한 후 3 차례의 증폭과정을 거쳐 viral stock의 titer를 높였다. 단백질 발현효율이 좋은 Hi5 곤충세포에 재조합 바이러스를 감염다중도(Mutiplicity of Infection)가 1이 되도록 감염시킨 후 27℃에서 하루 동안 진탕배양하였다.

배양된 hACAT-1과 hACAT-2는 각각 과량 발현된 Hi5 세포들로부터 마이크로좀 분획을 분리하기 위하여, 500 × g에서 15분간 원심분리하여 세포들을 모으고 저장완충액(hypotonic buffer)에서 급냉동 급해동 방법으로 세포를 깬 후 100,000× g에서 한 시간 동안 초원심분리하였다.

얻어진 마이크로좀 분획들은 단백질 농도가 8㎎/㎖이 되도록 저장완충액으로 현탁하여 사용 전까지 저온냉동기에 보관하였다.

2. ACAT 활성 측정

아세톤에 1㎎/㎖의 농도로 용해된 콜레스테롤 용액 6.67㎕를, 아세톤중의 10% 트리톤(triton) WR-1339(Sigma Co.) 6㎕와 혼합하고, 질소가스를 이용하여 아세톤을 증발시켜 제거하였다. 얻어진 혼합물에 증류수를 가하여 콜레스테롤의 농도가 30㎎/㎖가 되도록 조절하였다.

10㎕의 콜레스테롤 수용액에, 10㎕의 1M KH₂PO₄(pH 7.4), 5㎕의 0.6mM 소혈청알부민(BSA; bovine serum albumin), 상기 1에서 얻은 10㎕의 마이크로좀 용액, 10㎕의 시료(피라졸린 유도체) 및 45㎕의 증류수를 가하였다(총 90㎕). 혼합물을 37℃ 수욕에서 30분 동안 예비 반응시켰다.

10㎕의 (1-¹⁴C)올레일-CoA 용액(0.05 μCi, 최종 농도 : 10 μM)을 예비 반응된 혼합물에 가하고, 생성된 혼합물을 37℃ 수욕에서 30분동안 반응시켰다. 여기에 500㎕의 이소프로판올:헵탄 혼합물(4:1(v/v)), 300㎕의 헵탄 및 200㎕의 0.1 M KH₂PO₄(pH 7.4)을 가하고, 혼합물을 볼텍스(vortex)로 격렬하게 혼합한 후, 상온에서 2분동안 방치하였다.

생성된 200㎕의 상층액을 신틸레이션 병에 넣고, 신틸레이션 액(Lumac) 4㎖을 가하였다. 이 혼합물의 방사선량은 1450 마이크로베타 액체 신틸레이션 계수기 (1450 Microbeta liquid scintillation counter, Wallacoy, Finland)로 측정하였다.

ACAT 활성은 측정된 방사선량으로부터 시간당 방사선량을 계산하여 1분동안 단백질 1㎎ 당 합성된 콜레스테릴 올레이트 피코몰(피코몰/분/㎎ 단백질)로 계산하였다.

결과는 표 2에 나타내었다.

피라졸린 유도체의 ACAT에 대한 저해 활성

화합물		IC50(μM)
		쥐간 ACAT	hACAT-1	hACAT-2
	R1=수소, R2=R3=t-부틸	87.1	12.8	14.7
	R1=수소, R2=R3=이소프로필	3.7	20.5	11.1
	R1=수소, R2=R3=메틸	23.9	12.8	19.9
	R1=R2=R3=메틸	53.2	27.0	31.5
	R1=수소, R2=R3=플루오로	121.4	35.6	164.3
	R1=R2=수소, R3=메톡시	92.5	32.1	64.5
	R1=R3=수소, R2=히드록시	100.7	112.5	170.2
	R1=수소, R2=R3=페닐	84.0	23.3	127.4
	R1=R3=수소, R2=니트로	169.9	65.4	125.8
	R1=R2=R3=수소	66.2	32.4	68.5

표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 피라졸린 유도체들은 사람 ACAT-1에서 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대한 저해 활성이 매우 우수함을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 의한 피라졸린 유도체들은 콜레스테릴 에스테르의 합성 및 축적으로 유발되는 고지혈증 및 동맥경화증과 같은 심장순환계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

실험예 3 : 마우스에 대한 경구투여 급성 독성실험

본 발명에 따른 피라졸린 유도체의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

4주령의 특정 병원체 부재(specific pathogens free) ICR 마우스로서 암컷 12 마리와 숫컷 12마리(암수 각각 3마리/용량군)를 온도 22±3℃, 습도 55±10%, 조명 12L/12D의 동물실내에서 사육하였다. 마우스는 실험에 사용되기 전 1주일 정도 순화시켰다. 실험동물용 사료((주)제일제당, 마우스 및 랫트용) 및 음수는 멸균한 후 공급하였으며 자유섭취시켰다.

상기 실시예 1에서 제조한 3,5-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸을 0.5% 트윈 80을 용매로 하여 50mg/㎖ 농도로 조제한 후, 마우스 체중 20g 당 0.04㎖(100mg/kg), 0.2㎖(500mg/kg), 0.4㎖(1,000mg/kg)씩 경구투여하였다. 시료는 단회 경구 투여하였으며, 투여 후 7일 동안 다음과 같이 부작용 또는 치사 여부를 관찰하였다. 즉, 투여당일은 투여 후 1시간, 4시간, 8시간, 12시간 뒤에, 그리고 투여 익일부터 7일째까지는 매일 오전, 오후 1회 이상씩 일반증상의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였다.

또한, 투여 7일째에 동물을 치사시켜 해부한 후 육안으로 내부 장기를 검사하였다. 투여당일부터 1일 간격으로 체중의 변화를 측정하여 피라졸린 유도체에 의한 동물의 체중 감소 현상을 관찰하였다.

시험 결과, 시험물질을 투여한 모든 마우스에서 특기할 만한 임상증상은 없었고 폐사된 마우스도 없었으며, 또한 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

따라서, 본 발명에 따른 3,5-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸은 모든 마우스에서 1,000mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)이 1,000mg/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1 : 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

피라졸린 유도체 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

피라졸린 유도체 100㎎

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

피라졸린 유도체 100㎎

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 주사액제의 제조

피라졸린 유도체 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1㎖

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 피라졸린 유도체를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명유리로된 5㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

제제예 2 : 식품의 제조

피라졸린 유도체를 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

피라졸린 유도체 0.2 ~ 10 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

피라졸린 유도체 0.2 ~ 1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

피라졸린 유도체 0.1 ~ 5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

피라졸린 유도체 0.1 ~ 1.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

피라졸린 유도체 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품(dairy products)의 제조

피라졸린 유도체 0.1 ~ 1.0 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

7. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다.

피라졸린 유도체를 진공 농축기에서 감압·농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 벤질리딘티아졸리딘디온 유도체 화합물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30중량%, 율무 15중량%, 보리 20중량%),

종실류(들깨 7중량%, 검정콩 8중량%, 검정깨 7중량%),

피라졸린 유도체의 건조분말(1 중량%),

영지(0.5중량%),

지황(0.5중량%)

제제예 3 : 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 카라멜 0.005~0.02%, 비타민 C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79~94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82% 주입하여 피라졸린 유도체를 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 피라졸린 유도체를 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채쥬스의 제조

피라졸린 유도체 0.5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

4. 과일쥬스의 제조

피라졸린 유도체 0.1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

본 발명의 피라졸린 유도체는 저밀도 지질 단백질에 대한 항산화 활성이 우수할 뿐만 아니라 ACAT에 대한 활성을 효과적으로 억제한다.

따라서, 본 발명의 조성물은 콜레스테릴 에스테르의 합성 및 축적으로 유발되는 고지혈증 및 동맥경화증과 같은 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (8)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 피라졸린계 화합물:

   <화학식 1>

   

   (R¹은 수소 원자 또는 C₁~C₄의 알킬기이고; R²는 수소 원자, C₁~C₄의 알킬기, 히드록시기, 할로겐 원자, 페닐기 또는 니트로기이며; R³는 수소 원자, C₁~C₄의 알킬기, 메톡시기, 할로겐 원자 또는 페닐기임).
2. 제 1항에 있어서, 상기 R¹은 수소 원자이며, R² 및 R³는 각각 메틸기, 이소프로필기 또는 t-부틸기인 것을 특징으로 하는 피라졸린계 화합물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 1의 피라졸린계 화합물은

   1) 3,5-비스-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸,

   2) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,5-디-이소프로필-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸,

   3) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,5-디메틸-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸,

   4) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(2,3,5-트리메틸-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸,

   5) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,5-디-플루오로-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸,

   6) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(5-메톡시-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸,

   7) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,4-디-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸,

   8) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3,5-디-페닐-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸,

   9) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(3-니트로-4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸 및

   10) 3-(3,5-디-t-부틸-4-히드록시)페닐-5-(4-히드록시)페닐-4,5-디히드로-1H-피라졸로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 피라졸린계 화합물.
4. 1) 수소 원자, C₁~C₄의 알킬기, 히드록시기, 메톡시기, 할로겐 원자, 페닐기 및 니트로기로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기로 치환된 페닐이 1,3 위치에 치환된 α,β-불포화된 프로펜온과 히드라진을 반응시켜 피라졸린계 화합물을 얻는 단계; 및

   2) 상기 1)단계에서 얻은 피라졸린계 화합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법으로 정제하는 단계로 이루어지는

   하기 반응식 1로 표시되는 제 1항의 피라졸린계 화합물의 제조방법:

   <반응식 1>

   

   (R¹은 수소 원자 또는 C₁~C₄의 알킬기이고; R²는 수소 원자, C₁~C₄의 알킬기, 히드록시기, 할로겐 원자, 페닐기 또는 니트로기이며; R³는 수소 원자, C₁~C₄의 알킬기, 메톡시기, 할로겐 원자 또는 페닐기임).
5. 제 1항의 피라졸린계 화합물을 함유하는 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 심장순환계 질환은 고지혈증 또는 동맥경화증인 것을 특징으로 하는 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
7. 삭제
8. 삭제