KR100949012B1 - 사자발쑥 추출물을 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사자발쑥 추출물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 특히 사자발쑥 추출물 중 유파폴린(Eupafolin)을 유효성분으로 포함하여 암 질환 뿐 아니라 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 효과적인 약학 조성물에 관한 것이다.

유파폴린, 사자발쑥, 난소암, 폐암, 뇌종양, 동맥경화, 고지혈증

Description

사자발쑥 추출물을 포함하는 약학 조성물 {Composition containing Artemisia princeps}

본 발명은 사자발쑥 추출물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 사자발쑥 추출물 중 유파폴린(Eupafolin)을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라의 경우, 질병 사망원인 중 제 1위의 질병으로서 연간 약 10만 명 이상이 진단되고, 약 6만 명 이상이 사망하고 있다. 이러한 암의 유발 인자인 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다. 현재의 암의 치료법으로 외과적 수술, 방사선치료 및 약물요법의 3가지로 분류되고 있다.

초기단계의 암들은 외과적 수술로 치료가 가능하나, 암이 많이 진전되었거나 전이가 일어난 경우에는 외과적 수술만으로는 치료가 어렵고 다른 방법을 함께 사용해야 한다. 방사선 치료방법의 경우 방사선 조사로 인한 새로운 암 발병 또는 전 이의 확산시 억제에 어려움이 있어 약물치료와 병행하고 있는 실정이다. 약물요법의 경우가 방사선 치료나 외과적 수술에 비해 나은 점은 몸의 어떤 부위에 생긴 암이라도 약물이 도달할 수 있고, 전이된 암을 치료할 수 있다는 점으로 전이된 암 증상을 완화시켜 환자의 삶의 질을 개선하고 수명연장을 시켜주는 중요한 역할을 한다. 현재 임상적으로 사용되고 있는 항암제는 크게 화학요법제와 생물요법제로 분류된다.

화학요법제로는 알킬화제, 대사 길항제, 항생제, 식물유래 알칼로이드 및 호르몬제가 있으며, 생물요법제에는 면역치료제인 사이토카인 및 재조합 단일클론 항체가 있다. 화학요법제의 한 종류인 알킬화제는 DNA를 가교결합 하거나 비정상적인 염기짝짓기 등을 통하여 DNA 합성을 저해함으로써 항암작용을 나타내게 된다. 대표적인 알킬화제인 클로로암부실은 임상에서 사용되는 항암제로써 주로 난소암, 만성백혈병, 림프종에 단독화학요법으로 쓰이고 있다. 하지만 그 효과는 미미하고 약제에 대한 내성의 출현으로 인해 유지기간이 오래 지속되지 않고, 또 부작용과 독성이 너무 강하여 그 사용에 한계가 있다. 이러한 약제에 대한 내성을 극복하기 위하여 작용기전이 서로 다른 약제를 병용하여 사용하는 복합화학요법 개발이 진행되고 있다. 그 예로는 Cyclophosphamide, Adriamycin, Cisplatin을 진행성 난소암에 병용하여 사용하는 복합화학요법을 실시한 사례가 있으며, 피부암 치료에 클로로암부실을 같이 병용하여 치료한 사례도 보고된 바 있다. 최근에는 마크 등(Mark D. Wittman et al, 2001. Synthesis and Antitumor Activity of Novel Paclitaxel-Chlorambucil Hybrids. Bioorganic and Medicinal Chemistry letters, 11; 811- 814.)이 Paclitaxel과 알킬화제 항암제를 조합하여 제조한 물질의 항암 효과를 검증한 바 있다.

그러나, 현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암 세포만을 선택적으로 제거하지 못하므로, 암의 발생 후 이의 치료뿐 아니라, 암의 발생을 예방하기 위한 독성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요하다.

한편, 최근 성인병 증가와 더불어 동맥경화 등의 혈관장애 질환이 크게 증가하고 있다. 대표적인 혈관장애 질환으로서 동맥경화는 지질대사와 관련된 유전적 요인과 식습관, 흡연, 운동부족 등의 환경적 요인에 의하여 동맥이 경화되는 질환으로, 뇌동맥 또는 관상동맥에서 일어나기 쉬우며, 이로 인하여 심장질환, 뇌혈관 질환 등의 순환계 질환으로 발전하게 된다. 뇌동맥경화의 경우에는 두통, 현기증, 정신장애 등을 나타내고 뇌연화증의 원인이 되며, 관상동맥경화의 경우에는 심장부에 동통과 부정맥을 일으켜 협심증, 심근경색 등의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 또한 이로 인해 고혈압, 심장병, 뇌일혈 등이 유발되어, 동맥경화로 인한 질병이 현대 사회에 있어, 특히 50~60 대의 남성들에게 가장 큰 사망요인으로 부각되고 있다.

혈관 내벽의 플라그(plaque) 형성 및 혈관파열은 심근경색 발병의 주요한 요인이며, 동맥경화의 초기 발생에 관한 가설은 혈관벽의 손상에 대한 만성 염증과정으로, 손상기작 보다는 오히려 방어기작인 '손상에 대한 반응(response-to-injury hypothesis)'으로 제시되고 있다(Nature 1993, 362, 801-809). 이는 유전적 변이, 과산화물, 고혈압, 당뇨, 혈장 호모시스테인 농도 증가 또는 미생물 감염 등의 원 인에 의하여 혈관 내피세포가 정상적인 항상성을 유지하지 못하는 기능부전 상태가 되는 것이다.

더욱 자세하게는, 상기 원인들로 인하여 혈중 저밀도 지단백질(low-density lipoprotein; LDL)이 산화, 당결합, 집적화, 당단백 결합 등을 거쳐 변형-LDL(highly modified-LDL; HM-LDL)로 변화하게 되고, 이들은 혈관 내피세포 및 평활근을 자극하고 손상을 유발한다. 이로 인하여, 내피세포의 혈관세포부착물질-1(vascular cell adhesion molecule-1; VCAM-1)의 발현 및 염증세포의 염증매개인자 방출이 촉진되면 LDL은 내피세포 아래에 유입 및 축적되고, 축적된 LDL 및 산화된 HM-LDL은 다시 대식세포, T 임파구 등의 면역세포의 유입 및 활성화를 유발하는 과정을 되풀이하여 병변의 염증반응을 촉진시키게 된다. 그 다음, 유입된 대식세포나 임파구로부터 방출된 가수분해효소, 염증매개인자, 성장인자 등의 작용으로 병반은 괴사하게 되고, 괴사된 병소 부위로 단핵구의 유입, 평활근의 이동 및 분화, 섬유성 조직의 형성 등의 반복적인 과정이 이루어진다. 상기 과정을 통해 병변 조직은 HM-LDL을 핵으로 한 괴사조직에 섬유질이 덮인 복잡한 구조의 섬유질 병변으로 발달하게 되며, 발달된 병변 조직으로부터 혈전이 생성되고 동맥이 경화되어 혈류장애 등 순환기 질환이 나타나게 되는 것이다.

LDL 산화는 죽상경화증(atherosclerosis)을 포함하는 동맥경화를 유발하는 초기 요인으로 가장 중시되고 있다(Circulation, 1995, 91, 2488-2496; Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 1997, 17, 3338-3346). 생체 내외에서 생성되는 산화적 스트레스(oxidative stress)는 혈액 내의 LDL을 산화된-LDL(oxidized- LDL)로 변형시키게 되고, 이것이 부착분자(adhesion molecule)를 통해 맥관내막(intima) 내로 유입된다. 유입된 산화된-LDL을 단핵구(monocyte)가 탐식하여 거품세포(foam cell)를 형성하면서 동맥경화 초기 병변인 지방선조(fatty streak)를 생성하게 된다. 동맥경화 초기 병변의 특징은 동맥 내피세포에서 생성되는 부착분자인 VCAM-1, ICAM-1(intracellular adhesion molecule-1) 및 MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1)이 발현된다는 것인데, 이들은 전사인자(transcription factor)인 NF-κB(nuclear factor-κB)에 의해 유도된다. 또한, NF-κB로 인하여 혈관벽 내에 플라그(plaque)의 형성 및 파열이 일어난다. NF-κB는 활성 산소종이나 사이토카인(cytokine) 등과 같은 다양한 요인에 의해 활성화되며, p50과 p65로 구성된 이형 이합체(hetero dimer)로서 많은 세포의 타겟 유전자(target gene)를 조절하는데 포함되는 전사인자이다. 활성화된 NF-κB는 IL-1, VCAM-1, ICAM-1 및 죽상동맥경화(atherosclerosis)의 진행에 관여하는 다른 인자들과 같이 특이적인 프로모터 유전자(promoter gene)에 결합하여 다양한 염증인자의 발현을 조절한다.

항산화제 및 유리기 소거제는 이러한 NF-κB의 활성을 저해하는 것으로 밝혀지고 있으므로 항산화제를 적절히 섭취할 경우, 생체 내(in vivo)에서 LDL의 산화를 저해하고 부착분자의 발현을 억제하며 NF-κB의 활성을 감소시켜 동맥경화를 억제할 것으로 기대되며, 이에 대한 연구들이 진행되고 있다(대한민국 공개특허 제2003-0014155호). 또한, 고지혈증이나 동맥경화 환자에 있어서 LDL 퍼옥사이드의 생성요인과 제거에 관한 연구(Curr. Atheroscler. Res., 2000, 2, 363-372)도 활발히 진행되고 있다.

현재 고지혈증 치료제로 사용되고 있는 프로부콜(Probucol), N,N'-디페닐렌디아민(N,N'-diphenylenediamine), 페놀계 합성 항산화제인 BHA(butylated hydroxyanisol) 및 BHT(butylated hydroxytoluene)는 LDL 내 콜레스테롤을 감소시키고, 산화 정도를 약화시켜 병변형성을 감소시키며, 상기 고지혈증 치료제는 항산화력은 우수하지만, 부작용이 많아 사용이 제한되고 있다.

따라서, 이러한 질병을 예방하려는 목적으로 종전부터 콜레스테롤 흡수의 억제와 생합성의 저해를 통한 혈장 LDL 양을 감소시키려는 시도가 진행되어 왔다(Principles in Biochemistry, lipid biosynthesis, 770-817, 3rd Edition, 2000 Worth Publishers, New York; Steinberg, N. Engl. J. Med., 1989, 320, 915-924). 또한, 고지혈증이나 동맥경화 환자에 있어서 LDL 항산화제와 함께 지질강하제의 병행투여 요법에 대한 관심도가 높아지고 있다.

한편 사자발쑥(Artemisia spp.)은 우리나라의 강화도 지방에는 자생되어 오던 약쑥으로서, 현재까지 사자발쑥의 항암 활성이나 항산화 활성에 대해 개시되거나 교시된 바는 없다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 난소암, 폐암 및 뇌종양의 암세포에 대한 세포독성 효과가 있는 암 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 LDL에 대한 항산화 활성이 우수한 심장순환계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유파폴린(Eupafolin)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 유파폴린은 사자발쑥으로부터 추출되며, 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 96 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

바람직하게, 상기 암 질환은 난소암, 폐암 또는 뇌종양이다.

또한 본 발명은 유파폴린을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 심장순환계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

바람직하게, 상기 심장순환계 질환은 동맥경화, 고지혈증, 뇌동맥 또는 관상동맥이다.

본 발명의 사자발쑥 추출물을 포함하는 약학 조성물은 HeLa(자궁경부암 세포), A549(폐암 세포) 및 A172(뇌종양 세포)의 암세포에 대한 증식을 억제하는 등 세포독성 효과를 가질 뿐 아니라, 항산화 활성으로 인해 LDL의 산화로 유발되는 동맥경화, 고지혈증, 뇌동맥 또는 관상동맥 등 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 사자발쑥 추출물을 포함하는 약학 조성물은 유파폴린(Eupafolin) 을 유효성분으로 포함함으로써 암 질환 및 심장순환계 질환을 예방 및 치료할 수 있다.

상기 유파폴린은 건조한 사자발쑥 전초 중량(㎏)의 약 1 내지 15배, 바람직하게는 약 5 내지 10배의 C₁ 내지 C₄의 저급알코올, 바람직하게는 메탄올에 담가 24 시간 동안 반복 정치 추출하고 여과한 후, 감압농축하고 이들을 통상의 분획 공정을 수행하여 얻을 수 있다.

구체적으로, 건조한 사자발쑥 전초 2.4 ㎏을 80% MeOH 수용액(15ℓ×2)에 24 시간 동안 담궈 실온에서 추출하였다. 상기 추출물을 여과하고, 남은 것은 동일한 방법으로 2회 더 추출하였다. 상기 얻어진 여액을 모두 합쳐 감압농축하여 MeOH 추출물을 얻었다. 이렇게 얻어진 MeOH 추출물을 에틸 아세테이트(EtOAc, 2ℓ×2)로 분배 추출하였으며, 물층은 다시 n-부탄올(n-BuOH, 2ℓ×2)로 분배 추출하였다. 각층을 감압농축하여 EtOAc 분획(SJBE), n-BuOH 분획(SJBB)과 H₂O 분획(SJBW)을 얻었다. 그 다음 상기 SJBE 분획을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(silica gel column chromatography, n-hexane:EtOAc=7:1→5:1→3:1→1:1)를 실시하여 20개의 분획물(SJBE-1~SJBE-20)을 얻었다. 이 중 SJBE-16 분획을 silica gel c.c.(CHCl₃:MeOH=30:1)로 8개의 분획을 얻었으며, SJBE-16-6 분획을 ODS c.c.(MeOH:H₂O=2:1)로 정제하여 유파폴린(eupafolin)을 분리할 수 있다.

상기와 같이 분리한 유파폴린 하기 화학식 1로 표시된다.

상기 화학식 1의 화합물(yellow amorphous powder)은 TLC에 전개시켜 관찰한 결과 UV 흡수가 뚜렷하고, 10% aq. H₂SO₄로 발색하였을 경우 노란색으로 발색된다.

또한 IR spectrum으로부터 수산기(3410 cm^－1) 및 carbonyl(1662 cm^－1)의 작용기를 갖는 것으로 확인되어 플라보노이드(flavonoid) 화합물로 추정된다. 상기 화합물의 NMR data는 eupatilin(1) 및 jaceosidin(2)과 매우 유사하지만, methoxy가 1개만 존재[δ_C 132.61, (δ_H 3.86, 3H, s)]하는 것이 다르다. 이같은 사실은 EI/MS spectrum의 [M]⁺ 이온(m/z 316)으로부터 분자량이 316으로 나타나 확인할 수 있었다. ¹H-NMR (400 MHz, C₅D₅N) spectrum에서 δ_H 7.65(1H, d, J=2.1 Hz, H-2'), 7.60(1H, dd, J=8.0, 2.1 Hz, H-6'), 7.28(1H, d, J=8.0 Hz, H-5')의 signal로부터 1,3,4-삼치환 벤젠을 확인할 수 있고, δ_H 6.59(2H, s)에서 2개의 singlet olefine methine proton signal을 확인할 수 있다. ¹³C-NMR(100 MHz, C₅D₅N) spectrum에서 15개의 탄소 signal과 한 개의 methoxy signal이 관측되어 플라보노이드(flavonoid) 화합물이라는 것을 확인하였다. C-4에서 공역화된 고리내의 ketone signal δ_c 183.88 한 개와 δ_c 166.10, δ_c 158.42, δ_c 154.34, δ_c 153.91, δ_c 150.73, δ_c 146.75, δ_c 132.61에서 산소가 결합되어 있는 7개의 aromatic quaternary carbon signal, δ_c 123.25와 δ_c 105.30에서 2개의 aromatic quaternary carbon signal, δ_c 120.16, δ_c 116.59, δ_c 113.98, δ_c 103.25, δ_c 95.13에서 5개의 aromatic methine carbon signal을 확인할 수 있었다. 이와 같은 자료들을 종합하여 상기 화학식 1의 화합물은 eupatilin(1)의 3‘-OCH₃ 와 4‘-OCH₃기가 OH로 치환된 유파폴린(eupafolin, Xiaoyi et al, 2004)으로 구조를 동정할 수 있었다.

상기 유파폴린은 암세포주인 HeLa(자궁경부암 세포), A549(폐암 세포) 및 A172(뇌종양 세포)에서의 세포 증식 억제 효과와 LDL의 산화 억제 효과를 확인함으로써 암질환 및 심장순환계 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명은 상기 추출 공정을 통해 얻어지는 유파폴린을 유효성분으로 포함하는 암 질환 및 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 유파폴린은 본 발명의 약학 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 96 중량%로 포함 되는 것이 바람직하다. 그 함량이 상기 범위내일 경우에는 난소암, 폐암, 뇌종양 등 암 질환과 동맥경화, 고지혈증, 뇌동맥, 관상동맥 등 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 있어 더욱 좋다.

상기 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

또한 상기 약학 조성물의 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타약학적 활성 화합물과 결합뿐 아니라 적당한 집합으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 약학 조성물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

[실시 예]

이하 실시 예에서 사용한 실험재료로 HeLa(인체 자궁경부암 세포주), A549(인체 폐암 세포주), A172(인체 뇌종양 세포주)는 한국 세포주 은행 (KCLB)에서 분양 받아 사용하였다. RPMI 1640 배지, fetal bovine serum(FBS), penicillin 및 streptomycin은 Life Technologies, Inc의 것을 사용하였다. 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tertazolium bromide(MTT)는 Sigma Chemical Co.의 것을 사용하였다.

실시예 1. 유파폴린의 추출

건조한 사자발쑥 전초 2.4 ㎏을 80% MeOH 수용액(15ℓ×2)에 24 시간 동안 담궈 실온에서 추출하였다. 상기 추출물을 여과하고, 남은 것은 동일한 방법으로 2회 더 추출하였다. 이렇게 얻어진 여액을 모두 합쳐 감압농축하여 MeOH 추출물을 얻었다. 상기 얻어진 MeOH 추출물을 에틸아세테이트(EtOAc, 2ℓ×2)로 분배 추출하였으며, 물층은 다시 n-butanol(n-BuOH, 2ℓ×2)로 분배 추출하였다. 각층을 감압농축하여, EtOAc 분획(SJBE), n-BuOH 분획(SJBB)과 H₂O 분획(SJBW)을 얻었다.

상기 SJBE 분획으로부터 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(n-hexane:EtOAc=7:1→5:1→3:1→1:1)를 실시하여 20개의 분획물(SJBE-1~SJBE-20)을 얻었다. 그 중 SJBE-16 분획을 silica gel c.c.(CHCl₃:MeOH=30:1)로 8개의 분획을 얻었으며, 이 중 SJBE-16-6 분획을 ODS c.c.(MeOH:H₂O=2:1)로 정제하여 하기 화학식 1로 표시되는 유파폴린을 분리하였다.

[화학식 1]

유파폴린(eupafolin): yellow amorphous powder(CHCl₃-MeOH); m.p. 272-274 ℃; IR(KBr, cm^-1): 3410, 1662; EI/MS m/z(70 eV): 316[M]^＋, 301, 298, 273, 167; ¹H-NMR(400 MHz, C₅D₅N_, δ): 7.31(1H, s, H-2'), 7.30(1H, d, J=8.0 Hz, H-6'), 6.85(1H, d, J=8.0 Hz, H-5'), 6.46(2H, s, H-3, 8), 3.86(3H, s, OCH₃). ¹³C-NMR(100 MHz, C₅D₅N_, δ): 183.88(C-4), 166.10(C-2), 158.42(C-9), 154.34(C-5), 153.91(C-7), 150.73(C-4'), 146.75(C-3'), 132.61(C-6), 123.46(C-1'), 120.16(C-6'), 116.59(C-5'), 113.98(C-2'), 105.59(C-10), 103.25(C-3), 95.13(C-8), 60.91(OCH₃).

실시예 2. 유파폴린의 암세포주에 대한 세포독성 측정

상기 실시예 1에서 추출한 유파폴린의 세포 독성효과를 확인하기 위하여, 다음와 같은 실험을 수행하였다.

먼저 암세포주인 A549(인체 폐암 세포주), HeLa(인체 자궁경부암 세포주), A172(인체 뇌종양 세포주)를 10% FBS, 페니실린(100 유니트/㎖), 스트렙토마이신 설페이트(100㎍/㎖)가 포함된 RPMI 배지에서 37℃, 5% 이산화탄소의 습기 있는 환경에서 배양하였다. 각 암세포들은 원심분리 및 스크래퍼로 수집하여 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지 100 ㎕를 포함하는 96 웰 플레이트에 1×10⁵/웰을 넣었다. 유파폴린은 디메틸설폭사이드(DMSO) 용매에 용해시켰으며, 모든 시험에서 DMSO의 농도는 0.1 %를 초과하지 않도록 하였다. 하룻밤 경과 후, 시료를 첨가하고 플레이트는 48 시간 동안 배양하였다. 그 다음 세포들을 한차례 세척한 후, 5 ㎎/㎖의 MTT를 함유하는 FBS 없는 배지 50 ㎕를 첨가하였으며, 37 ℃에서 4 시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 세포내에서 형성된 포마잔 블루(formazan blue)를 100 ㎕의 DMSO에 녹인 후, 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 암세포 증식억제효과를 IC₅₀ 값으로 구하였다. IC₅₀은 화합물을 처리하지 않았을 때에 비하여 세포의 숫자가 50% 감소효과를 나타내는 농도(IC₅₀)를 의미한다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었으며, 하기 표 1의 값은 3회 평균값이다.

구분	HeLa	A549	A172
IC50 (㎍/㎖)	69.91	103.96	71.95

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 사자발쑥으로부터 추출한 유파폴린은 HeLa 세포, A549 세포, A172 세포에 대하여 IC₅₀가 각각 69.91 ㎛, 103.96 ㎛, 71.95 ㎛로 암세포의 성장을 억제함을 확인할 수 있었으며, 이로부터 본 발명의 약학 조성물은 난소암, 폐암 및 뇌종양에 효과적임을 알 수 있었다.

실시예 3. 유파폴린의 LDL 산화 억제능 측정

(LDL 분리)

LDL은 표준 방법을 약간 변형하여 분리하였다. 먼저, 대한적십자혈액원을 통해 건강한 정상인 지원자로부터 전혈을 채취하였다. 상기 혈액을 4 ℃에서 3000 분당회전(revolution per minute; rpm)으로 30 분간 원심분리하여 혈장을 얻은 후, 지단백질(lipoprotein)의 변성을 방지하기 위해 EDTA(0.1%), NaN₃(0.05%), PMSF(0.015%)를 첨가하여 20 시간 동안 베크만 T8-M 초원심분리기에서 43800 rpm(100000 g)으로 원심분리하였다. 상층에 부유된 킬로마이크론(chylomicron)과 VLDL(very low-density lipoprotein)을 제거하고, 나머지 용액을 수집한 후, NaBr 용액을 이용하여 용액의 비중을 1.063 g/㎖로 조정하였다. 이후, 4 ℃에서 20 시간 동안 43800 rpm으로 원심분리하여 상층 부분에 있는 LDL(1.006<d<1.063 g/㎖)을 분리하였으며, 이를 10 mM의 PBS(pH 7.4)를 이용하여 4 ℃에서 투석하였다. 투석된 LDL을 4 ℃에서 저장한 후 4 주 이내에 사용하였다. LDL의 순도는 아가로즈 젤 전기영동과 SDS-PAGE로 확인하였고(Chapman MJ, et al., J. Lipid Res. 22: 339-358, 1981), LDL 단백질의 함량은 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 하여 정량하였다(Mahley, RW, et al., J. Lipid Res. 1984; 25: 1277-1294).

(TBARS(thiobarbituric acid-reactive substances) 측정)

상기와 같이 분리한 LDL 20 ㎕(단백질 농도, 50~100 ㎍/㎖)을 10 mM 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS) 210 ㎕와 혼합하고, 상기 실시예 1에서 제조한 유파폴린을 각각 10 ㎕씩 첨가하였다. 이때, 유파폴린은 DMSO(dimethylsulfoxide)에 녹여 사용하였으며, 실험에 사용하기 전에 여러 농도로 희석하였다. 또한, 음성 대조군으로는 용매만을 첨가한 것을 사용하였다.

상기 용액에 0.25 mM의 황산구리 10 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 4 시간 동안 반응시키고, 20% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA) 용액 1 ㎖를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 0.05 N의 수산화나트륨 용액에 녹인 0.67% TBA 용액 1 ㎖를 첨가하고 10 초간 교반시킨 후 95 ℃에서 5 분 동안 가열하여 발색반응이 일어나도록 하고 얼음물로 용액을 냉각하였다. 이 용액을 3000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 상등액을 분리하였으며, 자외선-가시광선 분광기로 540 ㎚에서의 흡광도를 측정하여 상기 발색 반응으로 생성된 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA)의 양을 구하였다.

테트라메톡시프로판(말론알데히드비스(디메틸아세탈))(tetramethoxy- propane(malonaldehyde bis(dimethylacetal))의 저장용액을 이용하여, 말론디알데히드를 인산완충용액으로 0~10 n㏖로 희석하여 표준물질을 250 ㎕씩 만들었다. 이 표준물질을 상기와 같은 방법으로 발색시켜 540 ㎚에서의 흡광도를 측정하고, 말론디알데히드의 표준곡선을 구하였다. 상기 실험에서 말론디알데히드의 양은 이 표준곡선을 이용하여 정량하고, 그 결과를 도 1 및 하기 표 2에 나타내었다.

구분	LDL 산화 억제율 (%, 40 ㎍/㎖)
유파폴린	95.9±1.3 (IC50 = 13.9±0.1 ㎍/㎖)

도 1 및 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 사자발쑥으로부터 추출한 유파폴린은 LDL에 대한 항산화 활성이 우수함을 확인할 수 있었으며, 이같은 결과로부터 본 발명의 약학 조성물은 동맥경화, 고지혈증, 뇌동맥, 관상동맥 등 심장순환계 질환에 효과적으로 이용될 수 있음을 예측할 수 있었다.

도 1은 본 발명의 일실시 예에 따라 추출한 유파폴린의 LDL 산화 억제율을 나타낸 그래프이다.

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5. 유파폴린(Eupafolin)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 동맥경화 또는 고지혈증 예방 및 치료용 약학 조성물.
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