KR20120006029A

KR20120006029A - 신규한 화합물 살비아놀릭산 ｌ, 이의 제조방법 및 용도

Info

Publication number: KR20120006029A
Application number: KR1020117025688A
Authority: KR
Inventors: 슈이핑 조우; 웨이 리; 위엔펑 진; 시아오후이 마; 지엔핑 한; 홍팡 쿠이; 슈에준 루오; 시아오펑 첸
Original assignee: 티안진 타슬리 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2009-03-30
Filing date: 2010-03-29
Publication date: 2012-01-17
Also published as: AU2010230770A1; RU2529491C2; CA2756823A1; HK1168584A1; US20120041062A1; RU2011139614A; JP2012522022A; EP2415749B1; SG174548A1; MY183588A; AU2010230770B2; EP2415749A4; EP2415749A1; CA2756823C; WO2010111935A1; JP5755633B2

Abstract

본 발명은 신규한 화합물 살비아놀릭산 L, 이의 제조방법, 살비아놀릭산 L을 포함하는 약학적 조성물 및 이의 심-뇌혈관 질환 치료용 약제 용도에 관한 것이다.

Description

신규한 화합물 살비아놀릭산 Ｌ, 이의 제조방법 및 용도{NEW SALVIANOLIC ACID COMPOUND L, PREPARATION METHOD AND USE THEREOF}

본 발명은 한약(TCM) 중에서, 특히, 새로운 종류의 살비아놀릭산 화합물에 관한 것이다.

단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae), 단삼의 건조된 뿌리는 맛이 쓰고, 찬 성질이 있고, 심장과 간 채널에서 활성화하여 울혈을 제거하여 통증을 막고, 혈액의 흐름을 활성화 하고, 심장을 깨끗하게 하여 불안증을 완화시킨다. 일련의 현대 약리 조사는 단삼에서 수행되었고, 이는 관상동맥(coronary artery) 확장, 미소순환(micro-circulation) 증가 및 심장 보호 효과가 있고, 혈소판 응집(platelet aggregation)의 저해 및 제거, 인체 산소결핍(anoxia) 내성을 증가시킬 수 있고, 항-간염(anti-hepatitis), 항암(anti-tumor) 및 항-바이러스(anti-virus) 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

2011년, 중국 의과 아카데미 & 페킹 유니언 의대 마테리아 메디카 기관의 L.N. Li 등은 [Bulletin of Medical Research, 2001, Vol. 30(7)]에 단삼 또는 동속식물로부터 분리된 페놀산 유도체 중 살비아놀릭산(Salvianolic Acid) A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, 리토스페르믹산(lithospermic acid), 로즈마리산(rosmarinic acid) 및 이소살비아놀릭산 C(isosalvianolic acid C) 등을 포함하는 13 종의 수용성 생리활성 물질을 발표하였다. 또한, 상기 물질의 약리활성도 밝혔다.

Rena.Kasimu 등은 [Journal of Xinjian g Medical University, 2002, Vol. 25(3)]에 살비아놀릭산 K의 화학 구조를 발표하였다.

해외 연구자들도 단삼의 수용성 생리활성 물질을 연구하였다. 1999년, 조지 워싱턴 대학교에서는 항-HIV 인테그라아제(anti-HIV integrase) 및 다른 바이러스들에 효과가 있는 13종의 살비아놀릭산 유도체를 미국 특허에 제출하여 등록되었다. 많은 연구자들은 단삼을 풍부한 잠재력이 있고, 개발 가치가 있는 약용식물 자원으로 제안했다.

본 발명의 살비아놀릭산 L은 단순히 대량 스크리닝 방법으로 단삼에서 찾은 신규한 화합물이다. 지금까지, 이 화합물과 관련되는 구조 및 약리 효과는 발표된 바 없다.

본 발명의 목적은 신규한 화합물 살비아놀릭산 L을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 살비아놀릭산 L을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 살비아놀릭산 L의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 심혈관계 질환의 치료를 위한 약제 제조용 상기 살비아놀릭산 L의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 신규한 화합물 살비아놀릭산 L을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 살비아놀릭산 L을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 살비아놀릭산 L의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 심혈관계 질환의 치료를 위한 약제 제조용 상기 살비아놀릭산 L의 용도를 제공한다.

본 발명에 의한 살비아놀릭산 L은 항-산화(anti-oxidation) 및 자유 라디칼 소거(free radical scavenging) 활성뿐만 아니라, 혈관 수축 효과를 증가, 신경 세포를 보호 및 급성 심근 경색(acute myocardial ischemia) 치료 효과가 우수하므로 항-산화용 약학적 조성물뿐만 아니라, 심혈관계 질환(cardiovascular disease) 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 상기 살비아놀릭산 L의 고분해능 질량 분석 스펙트로그램을 나타내는 도면이다.
도 2는 상기 살비아놀릭산 L의 전자 분무 이온화 질량 분석 스펙토그램을 나타내는 도면이다.
도 3은 상기 살비아놀릭산 L의 500 MHz에서, CD₃OD을 사용한 ¹H-NMR 다이아그램을 나타내는 도면이다.
도 4는 상기 살비아놀릭산 L의 125 MHz에서, CD₃OD을 사용한 ¹³C-NMR 다이아그램을 나타내는 도면이다.
도 5는 상기 살비아놀릭산 L의 125 MHz에서, CD₃OD을 사용한 DEPT 다이아그램을 나타내는 도면이다.
도 6은 상기 살비아놀릭산 L의 500 MHz에서, CD₃OD을 사용한 gCOSY 다이아그램을 나타내는 도면이다.
도 7은 상기 살비아놀릭산 L의 500 MHz에서, CD₃OD을 사용한 gHMBC 다이아그램을 나타내는 도면이다.
도 8은 상기 살비아놀릭산 L의 500 MHz에서, CD₃OD을 사용한 gHMQC 다이아그램을 나타내는 도면이다.
도 9는 자유라디칼 소거에 대한 물질의 테스트 용량을 나타내는 도면이다.
도 10은 상기 살비아놀릭산 L 및 비타민 C 사이의 줄어든 용량을 비교하는 도면이다.
도 11은 상기 살비아놀릭산 L 동결 건조된 살비아놀릭산 L 분말의 혈관수축 효과를 나타내는 도면이다.
도 12는 상기 살비아놀릭산 L 동결 건조된 살비아놀릭산 L 분말의 혈관확장 효과를 나타내는 도면이다.
도 13은 뇌하수체에 피투이트린을 처리한 후의 심전도(ECG) 도면이고, 여기서 A는 대조군 모델에서 얻은 일반적 ECG이고, B는 피투아린을 투여하고 15초 후의 대조군 모델에서 얻은 것이고, 및 C는 피투아린을 투여하고 30초 후의 대조군 모델에서 얻은 것이다.

본 발명은 하기 화학식(I)로 대표되는 신규한 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 및 가수분해용 에스테르에 관한 것이다:

I

본 발명에 따르면, 상기 페놀산의 신규한 화합물의 구조는 물리화학적 성질, 고분해능 질량분석기(QFT-ESI), 전자분무이온화 질량분석기(ESI-MS), ¹H-NMR, ¹³C-NMR, DEPT, gCOSY, gHMBC 및 gHMQC로 밝혀내었다.

본 발명의 상기 화합물은 연한 노락색 가루이다.

본 발명에 따른 상기 화합물은 FeCl₃ 발색반응 한 얇은-막 크로마토그래피(TLC)에서 양성으로 나타나고, 이는 페놀산 화합물일 것으로 추축된다.

고분해능 질량분석기(QFT-ESI)에서는 m/z 537.1034에서 유사분자 이온 피크가 나타났고, 분자량은 불포화 온도 17 오메가에서 C₂₇H₂₂O₁₂로 확인되었다.

ESI-MS에서는, 본 발명에 따른 상기 화합물의 m/z 537분자량 피크가 8″-카르복실기(-44)가 쉽게 사라질 수 있고, 첫째로 프레그먼트 이온 피크가 m/z 493에서 나타났고(살비아놀릭산 A의 분자 이온 피크로써, 구조 동일), 그 다음으로 살비아놀릭산 A의 규칙적인 프레그먼테이션에 의한 두개의 프레그먼트 이온 피크가 m/z 313, 295로 형성된다.

본 발명에 따른 상기 살비아놀릭산 A의 규칙적인 프레그먼테이션은 하기에 나타내었다:

상기 m/z 493, 313, 295의 주요 프레그먼트 이온 피크는 질량-스펙트럼에서 살비아놀릭산 A의 주요 피크인 것이 명확하게 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 화합물은 살비아놀릭산 A와 동일한 골격구조를 가진다.

¹H-NMR(수소 스펙트럼) δ5.09(1H, dd, J=8.0, 4.5 Hz)에서 산소 근처에 있는 메틸렌 수소의 1개의 신호; δ6.88(1H, d, J=8.5 Hz), δ7.25(1H, d, J=8.5 Hz), δ7.59(1H, d, J=16.0 Hz), δ6.22(1H, d, J=16.0 Hz), δ6.68(1H, s), δ6.55(2H, d, J=8.0 Hz), δ6.58(1H, d, J=2.0 Hz), δ6.69(1H, d, J=8.0 Hz), δ6.54(1H, dd, J=8.5, 2.0 Hz), δ7.92(1H, s)에서 방향족 수소의 11개의 신호; δ3.01(2H, ddd, J=14.0, 8.0, 4.5 Hz)에서 알리파틱 수소의 2개의 신호를 나타낸다.

¹³C-NMR(스펙트럼) δ39.6에서 1개의 알리파틱 탄소 신호, δ76.4에서 1개의 산소 근처에 있는 메틸렌 탄소 신호, 및 δ117.4, δ117.8, δ117.8, δ118.2, δ119.2, δ120.2, δ121.7, δ123.7, δ125.7, δ126.6, δ128.0, δ128.8, δ129.9, δ130.9, δ146.2, δ146.5, δ146.9, δ147.4, δ147.7, δ147.8, δ150.3, δ150.9에서 22개의 이중-결합 탄소 신호를 포함하는 27개의 탄소 신호를 나타낸다.

DEPT 스펙트럼은 상기 분자에서 1×CH₂, 12×CH 및 14×C를 나타내었다.

상기 ¹H-NMR 스펙트럼의 방향족 수소의 화학적 이동과 상기 ¹³C-NMR 스펙트럼에 의해 제공되는 정보와 함께 상호 결합을 고려한 결과, 본 발명의 상기 화합물이 두개의 1,3,4-삼치환된 벤젠 고리, 한 개의 1,2,3,4-사치환된 벤젠 고리, 1개의 트랜스-형 이중 결합 및 1개의 단일-치환된 이중 결합로 구성된다; 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae)로부터 분리된 살비아놀릭산 화합물의 스펙트로메트리 분광법과 모두 일치한다.

상기 결과로, 본 발명의 화합물이 페놀산 화합물과 같음을 먼저 예측할 수 있고, 구조적으로 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae)의 살비아놀릭산 화합물의 유사점을 구조적으로 나타내었다.

살비아놀릭산 A 본 발명의 화합물

관련 스펙트럼 연구와 선행 문헌을 비교한 결과, 본 발명의 화합물은 ¹H-NMR에서 살비아놀릭산 A의 트랜스 형태의 이중-결합 수소가 2쌍 나타나고, 본 발명의 화합물에서는 트랜스 형태의 이중-결합 수소가 1쌍 나타나고; 및 ¹³C-NMR에서 살비아놀릭산 A 보다 본 발명의 화합물의 카보닐 탄소 신호가 1개 더 있고, 이때, C-7″ 및 C-8″가 8 ppm 및 6 ppm으로 각각 다운필드로 이동하는 것을 제외하고는 살비아놀릭산 A와 유사한 스펙트럼의 특성이 있음을 알아내었다. 그 결과, 상기 본 발명의 화합물과 살비아놀릭산 A와 다른점은 C-7″또는 C-8″가 카보닐기로 치환된 것이다.

C-7″와 C-8″위치에 대한 치환의 추가 확인을 위해서, 본 발명의 화합물의 2D-NMR 연구를 수행하였고, 이의 HMBC 스펙트럼 결과는 H-7″와 C-9″, H-7″와 C-2″, H-7″와 C-2, 뿐만 아니라 H-7″와 C-6″사이에서 장-거리 짝지움을 나타내었다. 따라서, C-8″은 본 발명의 화합물의 카르복실산기로 치환된 것을 예상할 수 있다.

따라서, 선행문헌과 비교한 결과, 본 발명의 화합물은 “살비아놀릭산 L”로 명명된 신규한 살비아놀릭산 화합물이다.

실제로, 추출과정 동안 발생하는 본 화합물 구성 및 구조 변화에 따라 해당 변경사항은 스펙트럼 데이터에 나타나지만, 구성 및 구조 변화에 의해 생성되는 다양한 종류의 이정질체는 본 발명의 보호 범위 내에 나타날 것이다.

본 발명의 상기 살비아놀릭산 L은 일반적인 기술 지식과 선행기술에 따르면, 약학적으로 허용가능한 염 도는 용매화물의 형태로도 사용할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 살비아놀릭산 L의 약학적으로 허용가능한 염은 전통적이고 약학적으로 허용가능한 염은 종래 염 형태 제조에 의한 제조방법인 무기 또는 유기 염으로부터 제조된다. 염의 적절한 예로는 나트륨 염(sodium salt), 칼륨 염(potassium salt), 리디움 염(lithium salt), 마그네슘 염(magnesium salt), 알루미늄 염(aluminum salt), 칼슘 염(calcium salt), 아연 염(zinc salt), 또는 N,N′-디벤질 에틸렌디아민(N,N′-dibenzyl ethylenediamine), 클로로프로카인(chloroprocaine), 클로린(choline), 디에탄올아민(diethanolamine), 에틸렌디아민(ethylenediamine), N-메틸 글루코스이민(N-methyl glucoseimine), 프로카인(procaine) 및 베르베린(berberine)과의 반응으로 인한 염의 형태를 포함한다.

상기 살비아놀릭산 L은 화학식(I)으로 대표되는 살비아놀릭산 L 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 및 가수분해 가능한 에스테르를 포함하여 하기에 설명하였다.

본 발명의 상기 살비아놀릭산 L은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제를 종래 방법을 사용하여 약학적 조성물의 형태로 적절하게 투여된다.

또한, 가능하다면, 본 발명에 따른 상기 살비아놀릭산 L은 원료 의약품으로써 투여될 수 있고, 바람직하게 상기 활성 조성물을 바로 약학적 제조용 물질로 사용된다. 환자에 대한 다른 성분 및 안정성의 적합성의 관점에서, 상기 담체는 약학적으로 허용가능해야 한다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 살비아놀릭산 L을 포함하고, 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 다른 치료 물질 및/또는 예방 물질의 첨가 또는 비첨가된 조성물인 살비아놀릭산 L의 약학적 제조용 물질을 제공한다. 이 조제용 물질은 경구, 비경구(주사(injection) 및 레저보-타입 정제(reservoir-type tablet)와 같은 피하 내(subcutaneously), 피부 내(intra-dermally), 척추 내(intrathecally), 레저보 타입(reservoir-type)과 같은 근육 내(intramuscularly) 및 정맥 내(intravenously) 투여), 직장(rectally) 및 설하(sublingually)와 같은 국소(topically)로 투여할 수 있다. 상기 투여 경로는 대부분 바람직하나, 환자의 질병에 따라 달라진다. 상기 약학적 제조용 물질은 단위로 제조할 수 있고, 제약업계에서 잘 알려진 어느 방법으로 제조할 수 있다. 이 모든 제조방법은 보조용 조성물 중 하나 또는 그 이상으로 구성되는 담체와 본 발명의 살비아놀릭산 L을 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 상기 조제용 물질은 하기와 같이 제조된다: 반-제품을 제조하기 위해 본 발명의 살비아놀릭산 L을 유체, 또는 분쇄된 고체 담체 또는 이의 혼합물과 균일하고 콤팩트하게 결합하였다; 필요에 따라, 다음으로 상기 반-제품 형태를 통해 제조용 물질을 설명하였다.

통상, 일련의 표준 제약 기술은 살비아놀릭산 L 및 약학적 담체를 이용한 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있다. 상기 기술은 혼합, 그래뉼, 가압을 포함한다. 종래 알려진 바와 같이, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석액의 특징 및 형태는 하기 요인에 의해 결정된다: 혼합된 활성 조성물의 양, 투여 경로 및 다른 알려진 요인. 상기 약학적으로 허용가능한 담체에 있어서, 유기 또는 무기 담체의 모든 종류이고, 이는 상기 조성물과 함께 투여될 수 있고, 예를 들어, 고체 제조용 약물로 사용되는 첨가제, 윤활제, 결합제, 붕해제 및 코팅제; 또는 착색제 및 감미료와 같은 약학적 첨가제가 있다. 상기 약학적 담체는 만니톨(mannitol) 또는 솔비톨(sorbitol)과 같은 당-알코올, 1가 알칼리 메탈의 소듐 피로설파이트(sodium pyrosulfite), 소듐 바이설파이트(sodium bisulfite), 소듐 티오설페이트(sodium thiosulfate), 시스테인(cysteine), 염산 염(hydrochloride), 티오글리콜릭 산(thioglycolic acid), 메티오닌(methionine), 비타민 C(vitamin C), 디소듐 EDTA(disodium EDTA), EDTA 칼슘소듐(EDTA calcium sodium), 카르보네이트(carbonates), 아세테이트(acetates), 포스페이트(phospate) 또는 이의 수용액, 염산(hydrochloric acid), 아세트산(acetic acid), 황산(sulfuric acid), 인산(phosphoric acid), 아미노산(amino acid), 염화 나트륨(sodium chloride), 염화 칼륨(potassium chloride), 소듐 락테이트(sodium lactate), 자일리톨(xylitol), 말토즈(maltose), 글루코즈(glucose), 프룩토즈(fructose), 덱스트란(dextran), 글라이신(glycine), 녹말(starch), 슈크로즈(sucrose), 락토즈(lactose), 만니톨(mannitol), 실리콘(silicon) 유도체, 셀룰로오스(cellulose) 및 이의 유도체, 알지네이트(alginate), 젤라틴(gelatin), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone(PVP)), 글리세롤(glycerol), 트윈-80(Tween-80), 아가(agar), 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 칼륨 바이카보네이트(calcium bicarbonate), 계면활정제(surfactant), PEG, 시클로덱스트린(cyclodextrin), β-시클로덱스트린(β-cyclodextrin), 인지질(phospholipid) 원료, 카올린(kaolin), 탈크 파우더(talc powder), 칼슘 스테아레이트(calcium stearate), 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate) 등으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

상기 약학적 조성물은 앞에서 언급한 약학적으로 허용 가능한 당의정, 필름제 피정, 장용정과같은정제; 경질캡슐 및 연질캡슐과 같은 캡슐; 내복액; 버컬정; 그래뉼; 끓는 물에 녹인 후에 먹는 그래뉼; 알약; 파우더; 페이스트; 펠렛; 현탁액; 분말; 리퀴어; 주사액; 좌제; 연고 및 플라스터와 같은 페이스트; 크림; 스프레이; 드롭스 및 팻치를 포함하는 투여 형태로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 상기 제조용 약물은 캡슐, 정제, 내복액, 그래뉼, 알약, 파우더, 펠렛 및 페이스트와 같은 경구 투여 형태; 및 주사용 파우더, 주사액 및 수액 등과 같은 주사액제이다. 더욱 바람직하게는, 상기 제조용 약물은 코팅된 정제이다.

바람직한 제조용 약물, 상기 경구 제조용 약물들은 일반적으로 사용되는 부형제, 결합제, 증량제, 희석제, 정제-압착제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 착향제 및 습윤제을 포함할 수 있고, 및 필요에 따라, 상기 정제는 코팅될 수 있다.

상기 부형제의 바람직한 예로는: 락토오즈(lactose), D-만니톨(D-mannitol), D-솔비톨(D-sorbitol), 녹말(예로, α-녹말(α-starch)), 덱스트린(dextrin), 결정형 셀룰로오스(crystalline cellulose), 저치환된 하이드록시프로필 셀룰로오스(low-substituted hydroxypropyl cellulose), 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose), 아라빅 검(arabic gum), 아밀로펙틴(amylopectin), 경질무수 규산(light anhydrous silicic acid), 합성 규산 알루미늄(aluminum silicate) 또는 마그네슘 규산 알루미늄(magnesium aluminum silicate) 등을 포함한다.

상기 윤활제의 바람직한 예로는: 마그네슘 스테아르산염(magnesium stearate), 칼슘 스테아르산염(calcium stearate), 텔컴 파우더(talcum powder) 및 실리카겔(silica gel) 등을 포함한다.

바람직하게 상기 결합제의 바람직한 예로는: α-녹말(α-starch), 수크로스(sucrose), 젤라틴(gelatin), 아라빅 검(arabic gum), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose), 결정형 셀룰로오스(crystalline cellulose), 당(sugar), D-만니톨(D-mannitol), 트레할로스(trehalose), 덱스트린(dextrin), 아밀로펙틴(amylopectin), 하이드록시프로필 셀룰로오스(hydroxypropyl cellulose), 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스(hydroxypropyl methyl cellulose), 피롤리돈(pyrrolidone) 등을 포함한다.

상기 붕해제의 바람직한 예로는: 락토오즈(lactose), 당(sugar), 녹말(starch), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 칼슘 카르복시메틸 셀룰로오스(calcium carboxymethyl cellulose), 아미노알킬소듐(aminoalkyl sodium), 소듐 카르복시메틸 녹말(sodium carboxymethyl starch), 경질무수 규산(light anhydrous silicic acid), 저치환된 하이드록시프로필 셀룰로오스(low-substituted hydroxypropyl cellulose) 등을 포함한다.

상기 코팅제의 바람직한 예로는: 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스(hydroxypropyl methyl cellulose), 하이드록시프로필 셀룰로오스(hydroxypropyl cellulose), 에틸 셀룰로오스(ethyl cellulose), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol) 등을 포함한다.

상기 착색제의 바람직한 예로는: 수용성 식용 테트라진 색소(tartrazine dye)(식용 적색 No.2 및 No.3, 식용 황색 No.4 및 No.5, 식용 청색 No.1 및 No.2와 같은 식용색소); 비수용성 레이크안료(lake colors)(예로 앞서 말한 수용성 식용 테트라진 색소의 알루미늄 염) 및 천연색소(예로 β-카로틴(β-carotene), 클로로필(chlorophyll) 및 콜커타르(colcothar) 등을 포함한다.

상기 감미제의 바람직한 예로는: 사카린 소듐(saccharin sodium), 글리시레틴산(glycyrrhetinic acid), 아스파탐(aspartame) 및 스테비오사이드(stevioside) 등을 포함한다.

종래 정제 조성물의 제조방법은 본 발명의 살비아놀릭산 L과 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 혼합하고, 그 다음 압축하거나 주조하였다.

또한, 본 발명의 상기 살비아놀릭산 L은 경구 액상 제제, 예를 들어, 수용성 또는 지용성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽, 등으로 제조할 수도 있다. 본 발명의 살비아놀릭산 L은 물 또는 다른 적절한 담체로 재혼합 된 건조산물로 제조될 수 있다. 용액 제조용 물질의 종류로는 솔비톨 시럽(sorbitol syrup), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 클루코스/시럽(glucose/syrup), 젤라틴(gelatin), 하이드록시에틸 셀룰로오스(hydroxyethyl cellulose), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 알루미늄 스테아르산염 겔(aluminum stearate gel) 또는 수소화된 식용지방과 같은 현탁화제; 레시틴(lecithin), 솔비탄 모놀레이트(sorbitan monoleate) 또는 아라빅 검(arabic gum)과 같은 에멀젼화-제; 아몬드 오일(almond oil), 분획된 코코넛 오일(coconut oil), 버터화 에스테르(butyraceous ester), 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 또는 에탄올(ethanol)과 같은 비수용성 담체(식용오일 포함); 메틸 파라벤(methyl paraben), 님파솔(methyl paraben) 및 솔빅산(sorbic acid)과 같은 종래 알려진 방부제로 첨가제를 포함한다.

비경구-투여용 제제는 수용성 및 비수용성 스테아릴 주사액을 포함하고, 선택적으로 이 제조용 약물은 항산화, 완충제, 정균제 및 등장화제(isotonic agent) 등으로 구성되고; 및 상기 비경구-투여용 제제는 수용성 및 비-수용성 스테아릴 현탁액을 포함하고, 선택적으로, 이 제제는 현탁화제 및 증점안정제(thickening agent)로 구성된다. 상기 제제는 봉인된 앰플 및 바이알(vials)과 같은 단일-투여 또는 다회-투여 용기에 저장될 수 있고, 이는 동결건조 조건 및 재-용해 전에 살균된 액체 담체, 예를 들어 주사용 증류수를 사용하여 보관될 수 있다.

직장-투여용 제제는 종래 좌제, 예를 들어, 코코아 버터, 스테아릭산 또는 다른 글리세라이드 또는 에틸렌 글라이콜을 포함하는 좌제일 수 있다.

구강 국부-투여용 제제는, 예를 들어 구강 또는 설하 제제는 트로치(troches), 여기에서 상기 활성 성분은 수크로스 및 아라빅 검과 같은 향미 염을 함유하고; 및 당의정(pastilles)을 포함하고, 여기에서 상기 활성 성분은 젤라틴 및 글리세롤과 같은 염기, 또는 수크로스 및 아라빅 검을 함유한다.

서방성 제제와 같은 레저부아-형 제제로 제조된 본 발명의 상기 살비아놀릭산 L은 체내이식(예로 피하 체내이식 또는 근육내 체내이식) 또는 근육내 주사로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 살비아놀릭산 L은 적절한 폴리머, 소수성 물질(예를 들어 허용가능한 오일 내 에멀젼), 또는 이온-교환 레진으로 제조할 수 있고, 난용성 유도체, 예를 들어 난용성 염으로 제조된다.

일반적 전문 지식과 선행기술에 따르면, 본 발명과 관련된 약물 효과는 특정 질병 또는 증상에 대한 예방 및 치료를 포함한다. 본 발명의 살비아놀릭산 L의 치료적 유효량은 질환의 특성 및 환자 각각의 조건, 또는 의사의 조언에 의해 결정된다. 일반적으로, 어른의 치료적 유효량은 하루 0.02-5000 mg의 범위이고, 바람직하게는 하루 1-1500 mg이다. 상기 설명한 바와 같이, 상기 투여량은 예를 들어, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 하루에 네 번 이상 적절한 간격으로 환자가 단일 투여 또는 다회-투여 할 수 있다. 본 발명의 상기 제제는 유효 성분 0.1-99 wt%, 바람직하게는 정제 및 캡슐용 30-95 wt%; 및 바람직하게는 액상 제제용 3-50 wt%을 포함한다.

본 발명은 하기와 같이 수행된다:

(1) 추출: 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae) 생약 또는 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae) 및 다른 생약 혼합물을 물로 추출하고, 침전물에 알코올을 첨가하고 상층액을 얻은 후, 상기 상층액을 농축하여 추출물을 얻는 단계;

(2) 분리: 상기 단계 (1)의 추출물을 물에 녹이고, 거대다공성(macroporous) 흡착 레진에 적용한 후, 물로 상기 레진을 용출시켜 용출액을 얻고, 상기 용출액을 산성화한 다음, 상기 산성화된 용출액을 다시 상기 거대다공성 흡착 레진에 적용하고, 상기 레진을 산성 수용액으로 세척하여 불순물을 제거한 후, 상기 레진을 에탄올을 용출시켜 에탄올 용출액을 얻고, 상기 에탄올 용출액을 농축하여 추출물을 얻는 단계;

(3) 정제: 상기 단계 2의 추출물을 건조 방법을 사용하는 실리카겔 컬럼에 적용하되, 클로로포름, 메탄올 및 포름산의 이동상으로 등용매 용출시키고; 상기 용출액을 모으고; TLC로 전체 용출 공정을 확인하고, 특성상 유사 용출액을 혼합하여 살비아놀릭산 L을 얻는 단계이다.

상기 단계(1)은 상기 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae) 생약 또는 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae) 및 다른 생약 혼합물을 달임용 조각으로 슬라이싱 할 수 있고, 과립 또는 분말로 빻을 수 있고, 바람직하게는 달임용 조각으로 슬라이싱 하였다. 바람직하게, 상기 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae)의 뿌리는 앞에서 언급한 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae) 생약이다. 상기 다른 생약은 선행문헌에서 알려진 한약으로, 이는 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae)과 호환 가능하고, 바람직하게, 삼칠(Radix Notoginseng), 황기(Radix Astragali) 및/또는 하수오(Radix Polygoni Multiflori)이다.

상기 단계(1)에서, 상기 물-추출은 하기와 같다: 상기 생약을 생약 부피의 4-8배 물, 바람직하게는 상기 생약 부피의 4배의 물로 1.5-3.5 시간 동안, 바람직하게는 2시간 동안 달인 후, 여과하고; 생약 잔사는 상기 생약 잔사 부피의 3-6배의 물, 바람직하게는 상기 생약 잔사 부피의 3배의 물로 달인 후, 여과하고; 및 상기 여과물을 혼합하고, 상기 여과물을 농축하여 상대밀도 1.11-1.28(80 ℃), 바람직하게는 1.2(80 ℃)의 추출물을 얻는다.

보다 쉽게 분리할 수 있게 하기 위해 상기 페놀산 물질을 염화하기 위해서, 알칼리 수용액은 바람직하게 상기 물-추출물 단계에서 사용되고, 바람직하게, 상기 알칼리는 탄산수소 나트륨(sodium bicarbonate), 탄산 나트륨(sodium carbonate), 수산화 나트륨(sodium hydroxide), 탄산수소 칼륨(potassium bicarbonate), 탄산수소 칼륨(potassium carbonate) 및 수산화 칼륨(potassium hydroxide)로 이루어지는 군으로부터 적어도 하나 선택되고, 더 바람직하게는, 탄산수소 나트륨 또는 수산화 나트륨이다. 상기 알칼리 수용액은 0.30%-0.68% 농도의 탄산수소 나트륨 수용액 또는 0.0025‰-0.004‰ 농도의 수산화 나트륨 수용액이고, 바람직하게는, 0.45% 농도의 탄산수소 나트륨 수용액이다.

상기 단계(1)에서, 상기 알코올-침전은 하기와 같다: 상기 추출물에 95% 에탄올을 첨가하여 에탄올 함량이 65%-70%(20 ℃)까지, 바람직하게는 70%까지 침전시키고, 12-36시간 동안, 바람직하게는 24시간 동안 계속 방치하고; 상기 상층액을 감압 하에서 에탄올을 회수하여 농축하고, 및 밀도 1.30-1.38(60 ℃), 바람직하게는 1.37(60 ℃)로 추출한다.

지용성 불순물을 더 제거하기 위해, 알코올-추출물은 바람직하게 물-추출 단계 전에 수행한다. 상기 알코올-추출 단계에서, 상기 생약의 부피의 5-8배의 50-95% 에탄올로 각각 1-2시간 동안 2회 추출하고, 여과하고, 상기 에탄올 추출 용액을 제거하고, 앞서 언급한 물 추출물로써 생약 잔사를 얻는다.

상기 단계(2) 에서, 상기 거대다공성 레진 컬럼은 비극성 또는 약한 극성 레진을 사용할 수 있고, 예를 들어, AB-8, HPD450, HPD700, D101, D4020 또는 X5이고, 바람직하게는 AB-8이다. 상기 생약의 무게 대 거대다공성 흡착 레진의 비율은 5:1-1:1이고, 바람직하게는 4:1이다. 상기 레진 컬럼은 상기 흡착제 부피의 8-15배, 바람직하게는 12배의 물로 세척하였고, 이로써 물 용출액을 얻었다.

염산은 pH 값이 2.2-3.5, 바람직하게는 3.0으로 조절하기 위해 물 용출액에 첨가되었다.

상기 산성 용출액은 상기 거대다공성 흡착 레진에 대한 생약의 무게비 5:1-1:1로, 바람직하게는 4:1로 상기 거대다공성 흡착 레진 컬럼에 적용되었고, 용출액이 거의 무색이 될 때까지 상기 컬럼은 pH 값이 2.2-3.5, 바람직하게는 3.0인 염산으로 세척하였다.

나아가, 3-8배의 50%-95% 에탄올, 바람직하게는 4배의 95% 에탄올을 상기 컬럼에 사용하고, 및 알코올 냄새가 없는 추출물을 얻기 위해 상기 용출액을 농축하였다.

상기 단계(3)에서, 상기 단계(2)에서 얻은 상기 농축된 추출물을 유기 용매, 바람직하게는 메탄올에 녹이고, 크로마토그래피 실리카겔과 혼합하고, 바람직하게는, 상기 추출물의 무게와 동일하게 200-300 메쉬 크로마토그래피 실리카겔과 혼합하였다. 상기 잘 혼합된 시료는 단단하게 채워진 실리카겔 컬럼에 넣고, 바람직하게는 상기 채워진 실리카겔은 200-300 메쉬의 실리카겔이고, 상기 컬럼은 클로로포름:메탄올:포름산(부피비는: 90:10:3-40:10:0.5이다)의 이동상으로 용출하였고, 바람직하게는 클로로포름:메탄올:포름산(부피비는: 85:15:3이다)이다. 상기 용출은 등용매 용출(용출액의 비율은 불변이다) 또는 기울기 용출(용출액의 비율을 시간에 따라 변화한다)로 할 수 있다. 여기에서, 상기 기울기 용출은 일반적인 종래 지식을 이용하여 기질의 극성에 따라 조절할 수 있고, 예를 들어, 상기 용출액의 극성을 서서히 증가시켰다. 상기 용출 과정을 정확하게 모니터링 하기 위해서, 클로로포름:메탄올:포름산(부피비는: 50:10:2이다)의 용매로 제조하여 TLC를 수행하였다.

상기 살비아놀릭산 L을 얻기 위해 상기 특성이 유사한 용출액을 모았다.

더 나은 분리능 향상을 위해, 분취용 액체 크로마토그래피를 분리도구로써 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 살비아놀릭산 L은 하기 분리 조건으로 제조되었다: 워터스 델타 프렙 4000(Waters Delta prep 4000) 반-분취용 액체 크로마토그래피(semi-preparative liquid chromatography), 컬럼: 아길렌트 조르벡스 XDB-C18(Agilent Zorbax XDB-C18)(21.2×150 mM，5 μM), 이동상: 아세토니트릴:0.1% 포름산 수용액(15 : 85), 유량: 20 ㎖/min, 파장검출: 280 nm.

자유라디칼 소거(scavenging free radical)를 위한 상기 살비아놀릭산 L의 용량은 비타민 D 보다 매우 우수하다(표 3, 도 9 참조). 게다가, 상기 본 발명의 살비아놀릭산 L의 저해 용량은 비타민 C보다 우수하다(도 10 참조). 본 발명의 살비아놀릭산 L은 항-산화(anti-oxidation) 및 자유 라디칼 소거(free radical scavenging) 활성을 가진다. 그 결과, 본 발명의 살비아놀릭산 L은 소거 자유 라디칼 소거 활성을 가지고 예방적 항-산화 기능 약물로 제조될 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명은 또한 심혈관계 질환(cardiovascular diseases)의 치료 약물의 제조에 있어서, 앞서 언급한 살비아놀릭산 L의 용도에 관한 것이다. 상기 심혈관계 질환(cardiovascular disease)은 저산소증-유도 혈관확장 장애(hypoxia-induced vasodilatation dysfunction), 산소 결핍(oxygen deprivation), 글루코즈 실조(glucose deprivation) 및 과-산화 상태(over-oxidation status)에 의한 체외(in vitro) 신경세포 손상(neuronal injury), 및 심근 경색증(acute myocardial ischemia)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다.

본 발명의 약력학 테스트에 나타낸 바와 같이, 상기 살비아놀릭산 L의 동결건조된 분말은 노르에피네프린(norepinephrine)의 혈관수축 곡선(vasoconstriction curve)을 오른쪽으로 움직이게 하나, 유의적인 차이는 없다. 상기 살비아놀릭산 L의 동결건조된 분말은 Ach 농도(10^-5, 10^-4, 10^-3 mol/ℓ)(P<0.05) 3중 구배 레벨의 무산소 혈관 고리에 대해서 혈관 수축 효과를 상당히 증가시켰다. 살비아놀릭산 L의 저산소증-유도 혈관확장 장애(hypoxia-caused vasodilatation dysfunction)를 개선하는 중요한 역할을 하는 것을 도면에 나타내었다(표7-8 및 도 11-12 참조).

본 발명의 살비아놀릭산 L은 허혈(ischemia)과 저산소증(hypoxia)에 의한 혈관 내피 상처(vascular endothelial injury)의 감소를 포함하고, 혈관 내피 증식(vascular endothelial hyperplasia)의 촉진, 허혈(ischemia)과 저산소증(hypoxia)에 의한 심근 세포 손상(myocardial cell injury)의 개선, 죽상동맥경화증(atherosclerosis)에 대한 저항성, 혈소판 응집(platelet aggregation) 저해 및 혈전형성(thrombogenesis)에 대한 저항성을 포함하는 광범위한 심혈관계 시스템(cardiovascular system)에 약리학적 효과가 있다.

본 발명의 약력학 테스트에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 살비아놀릭산 L은 산소 결핍(oxygen deprivation), 글루코스 결핍(glucose deprivation) 및 과산화수소(hydrogen peroxide)에 의한 체외(in vitro) 신경 세포(neural cell) 손상에 대해 상당이 세포 생존률이 증가하는 효과가 있고, 산소 결핍(oxygen deprivation), 글루코스 결핍(glucose deprivation) 및 과산화 상태(over-oxidation status )에 의한 신경 세포를 보호하는 기능이 있다(표 12-15 참조). 또한, 본 발명의 살비아놀릭산 L은 급성 심근 경색(acute myocardial ischemia) 치료 효과가 있다(표 16-17 참조).

실시예

항산화 및 자유 라디칼 소거에 대한 본 발명의 살비아놀린 산 L의 유리한 효과는 하기 구체적인 실험 데이터로 나타내었다.

본 발명에서 언급된 단위 % 및 ‰는 별도로 명시하지 않는 한, 무게비율을 나타낸다.

실시예 1 살비아놀릭산 L의 제조

달임용 조각을 추출기에 넣었다. 물(0.45% 탄산수소 나트륨을 포함)을 상기 생약의 부피의 4배를 상기 추출기에 첨가하여 2시간 동안 가열추출하고, 여과하였다. 상기 생약 잔사에 계속 생약 잔사의 3배의 물을 첨가하여 1시간 동안 가열추출하고, 여과하고, 상기 여과물을 혼합하여 상대밀도 1.2(80 ℃)의 추출물을 얻기 위해 농축하였다. 95% 에탄올을 상기 추출물에 첨가하여 상기 최종 에탄올 용량이 70%(25 ℃)로 침전될 때까지 수행하였고, 12시간 또는 그 이상 유지하였다. 상기 에탄올은 약한 압력 조건하에서 회수하여 1.37(60 ℃)의 상대밀도로 추출물을 얻었다.

앞서 얻은 추출물은 물에 녹이고, 다음으로 AB-8 거대다공성 흡착 레진 컬럼에 적용하였고, 상기 컬럼은 흡착제 부피의 12배의 물로 용출시켜 물 용출액을 얻었다. 상기 물 용출액의 pH는 pH 3.0으로 염산으로 조절하였다. 다시, 상기 산성화된 물 용출액은 AB-8 거대다공성 흡착 레진 컬럼에 적용하였다. pH값 3.0의 상기 산성 수용액은 상기 컬럼에 사용하여 용출액에 색이 거의 없을때까지 세척하였다. 나아가, 흡착제 부피에 대하여 4배 부피의 95% 에탄올은 용출하기 위해 사용하였고, 용출액을 얻고, 그 다음으로 상기 용출액을 농축하여 알코올 냄새가 없는 끈적거리는 추출물을 얻었다.

상기 결과 추출물은 메탄올에 녹이고, 200-300 메쉬 크로마토그래피 실리카겔을 첨가하여 혼합하고, 상기 크로마토그래피 실리카겔의 무게는 추출물의 무게와 동일하다. 상기 혼합 시료는 단단히 충진된 실리카겔 컬럼에 첨가하고, 상기 컬럼은 클로로포름 : 메탄올 : 포름산(부피비는: 85:15:3이다)의 이동상으로 용출하였다. TLC를 사용하여 상기 모든 용출과정을 확인하고, 상기 특성이 유사한 용출액을 모아 살비아놀릭산 L을 얻었다.

고분해능 질량 분석 크로마토그래피(QFT-ESI)를 사용하고, 유사-분자 이온 피크는 [M-H]⁺ m/z 537.1034이다.

살비아놀릭산 L의 ¹H-NMR(500 MHz, CD₃OD) 및 ¹³C-NMR(125 MHz, CD₃OD) 데이터 값(assig nment)

No.	δ_H	δc	H-H COSY	C-H COSY
1	-	128.0		H-5, H-8
2	-	128.8		H-6, H-7, H-7″
3	-	146.2		H-5
4	-	150.9		H-5, H-6
5	6.88(1H, d, J=8.5 Hz)	117.8	H-6
6	7.25(1H, d, J=8.5 Hz)	121.7	H-5	H-7
7	7.59(1H, d, J=16.0 Hz)	147.4	H-8	H-6
8	6.22(1H, d, J=16.0 Hz)	117.4	H-7
9	-	170.1		H-7, H-8
1′	-	130.9		H-2′, H-5′, H-8′, H-7′
2′	6.68(1H, s)	119.2		H-6′, H-7′
3′	-	146.9		H-5′
4′	-	147.8		H-2′, H-5′, H-6′
5′	6.55(1H, d, J=8.0 Hz)	117.8
6′	6.55(1H, d, J=8.0 Hz)	123.7		H-2′
7′	3.01(1H, ddd, J=14.0, 8.0, 4.5 Hz)	39.6	H-8	H-2′
8′	5.09(1H, dd, J=8.0, 4.5 Hz)	76.4	H-7′	H-7′
9′	-	175.11		H-7′, H-8′
1″	-	129.9		H-2″
2″	6.58(1H, d, J=2.0 Hz)	120.2		H-6″, H-7″
3″	-	147.7		H-2″, H-5″
4″	-	150.3		H-6″, H-2″
5″	6.69(1H, d, J=8.0 Hz)	118.2
6″	6.54(1H, dd, J=8.5, 2.0 Hz)	126.6		H-2″, H-7″
7″	7.92(1H, s)	146.5
8″	-	125.7		H-7″
9″	-	173.0		H-7″, H-8″

DEPT 스펙트럼은 분자 내에서 1×CH₂, 12×CH 및 14×C을 나타낸다.

실시예 2 살비아놀릭산 L의 제조방법

단삼과 전칠삼 달임용 조각을 추출기에 넣었다. 물(0.45% 탄산수소 나트륨을 포함)을 상기 생약의 부피의 6배를 상기 추출기에 첨가하여 3시간 동안 가열추출하고, 여과하였다. 상기 생약 잔사에 계속 생약 잔사의 2배의 물을 첨가하여 2시간 동안 가열추출하고, 여과하고, 상기 여과물을 혼합하여 상대밀도 1.25(80 ℃)의 추출물을 얻기 위해 농축하였다. 95% 에탄올을 상기 추출물에 첨가하여 상기 최종 에탄올 용량이 68%(25 ℃)로 침전될 때까지 수행하였고, 12시간 또는 그 이상 유지하였다. 상기 에탄올은 약한 압력 조건하에서 회수하여 1.32(60 ℃)의 상대밀도로 추출물을 얻었다.

앞서 얻은 추출물은 물에 녹이고, 다음으로 AB-8 거대다공성 흡착 레진 컬럼에 적용하였고, 상기 컬럼은 흡착제 부피의 12배의 물로 용출시켜 물 용출액을 얻었다. 상기 물 용출액의 pH는 pH 2.5로 염산으로 조절하였다. 다시, 상기 산성화된 물 용출액은 AB-8 거대다공성 흡착 레진 컬럼에 적용하였다. pH값 3.0의 상기 산성 수용액은 상기 컬럼에 사용하여 용출액에 색이 거의 없을때까지 세척하였다. 나아가, 흡착제 부피에 대하여 5배 부피의 95% 에탄올은 용출하기 위해 사용하였고, 용출액을 얻고, 그 다음으로 상기 용출액을 농축하여 알코올 냄새가 없는 끈적거리는 추출물을 얻었다.

고분해능 질량 분석 크로마토그래피(QFT-ESI)를 사용하고, 유사-분자 이온 피크는 [M-H]⁺ m/z 537.1027이다.

살비아놀릭산 L의 ¹H(500 MHz, CD₃OD) 및 ¹³C-NMR(125 MHz, CD₃OD) 데이터 값(assig nment)

No.	δ_H	δc	H-H COSY	C-H COSY
1	-	128.0		H-5, H-8
2	-	128.8		H-6, H-7, H-7″
3	-	146.2		H-5
4	-	150.9		H-5, H-6
5	6.88(1H, d, J=8.5 Hz)	117.8	H-6
6	7.24(1H, d, J=8.5 Hz)	121.8	H-5	H-7
7	7.58(1H, d, J=16.0 Hz)	147.4	H-8	H-6
8	6.20(1H, d, J=16.0 Hz)	117.4	H-7
9	-	170.1		H-7, H-8
1'	-	130.9		H-2', H-5', H-8', H-7'
2'	6.68(1H, s)	119.1		H-6', H-7'
3'	-	146.9		H-5'
4'	-	147.8		H-2', H-5', H-6'
5'	6.54(1H, d, J=8.0 Hz)	117.8
6'	6.54(1H, d, J=8.0 Hz)	123.7		H-2'
7'	2.97(1H, ddd, J=14.0, 8.0, 4.0 Hz)	39.6	H-8	H-2'
8'	5.05(1H, dd, J=8.0, 4.0 Hz)	76.4	H-7'	H-7'
9'	-	175.2		H-7', H-8'
1″	-	129.8		H-2″
2″	6.56(1H, s)	120.1		H-6″, H-7″
3″	-	147.7		H-2″, H-5″
4″	-	150.3		H-6″, H-2″
5″	6.67(1H, d, J=8.5 Hz)	118.2
6″	6.48(1H, d, J=8.5 Hz)	126.7		H-2″, H-7″
7″	7.90(1H, s)	146.5
8″	-	125.7		H-7″
9″	-	173.0		H-7″, H-8″

실시예 3 살비아놀릭산 L의 제조방법

단삼 달임용 조각을 추출기에 넣었다. 상기 생약의 부피의 6배의 85% 에탄올을 상기 추출기에 첨가하여 2시간 동안 2회 가열추출하고, 여과하였다. 상기 에탄올-추출물 용액을 제거하였다.

생약 잔사는 물(0.45% 탄산수소 나트륨을 포함)을 상기 생약 잔사의 부피의 4배로 가열추출하고, 여과하고, 상기 생약 잔사에 상기 생약 잔사의 부피의 3배의 물로 1시간 동안 계속 가열추출하고, 여과하였다. 상기 여과물을 혼합하여 상대밀도 1.2(80 ℃)의 추출물을 얻기 위해 농축하였다. 95% 에탄올을 상기 추출물에 첨가하여 상기 최종 에탄올 용량이 70%(25 ℃)로 침전될 때까지 수행하였고, 12시간 또는 그 이상 유지하였다. 상기 에탄올은 약한 압력 조건하에서 회수하여 1.37(60 ℃)의 상대밀도로 추출물을 얻었다.

실시예 4 상기 살비아놀릭산 L의 정제 제제

제제:

살비아놀릭산 L 100 g

미정질 셀룰로즈 50 g

락토즈 50 g

녹말 51 g

소듐 카르복시메틸 녹말 12 g

5% PVP 무수 에탄올 적당량

마그네슘 스테아레이트 3 g

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

상기 제제는 1000정제로 제조되었다.

제조방법:

1. 과립화

상기 살비아놀릭산 L 및 상기 제제에 기재되어있는 다른 보조제는 100-메쉬 체(sieve)를 통해 각각 분리하였다. 상기 제제 복용량에 따르면, 상기 살비아놀릭산 L, 미정질 셀룰로즈, 녹말 및 소듐 카르복시메틸 녹말은 동등하게 점점 증가하는 방법으로 잘 혼합하였다. 5% PVP 무수 에탄올 적당량은 연질 재료를 제조하기 위해 사용되었고, 14-메쉬 체로 알갱이를 만들었고, 1시간 동안 50-60℃에서 건조하였다. 상기 제제 복용량에 따른 마그네슘 스테아레이트는 14-메쉬 작은체로 과립체가 첨가되었다.

2. 정제 방법

상기 결과 과립은 특정 다이아몬드-모양 금형(punch die)으로 눌러 정제를 제조하였다.

실시예 5 상기 살비아놀릭산 L의 캡슐제제

제제:

살비아놀릭산 L 100 g

녹말 200 g

소듐 카르복시메틸 녹말 12 g

5% PVP 무수 에탄올 적당량

마그네슘 스테아레이트 3 g

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

상기 제제는 1000캡슐로 제조되었다.

제조방법:

1. 과립화

상기 살비아놀릭산 L 및 상기 제제에 기재되어있는 다른 보조제는 100-메쉬 체(sieve)를 통해 각각 분리하였다. 상기 제제 복용량에 따르면, 상기 살비아놀릭산 L, 미정질 셀룰로즈, 녹말 및 소듐 카르복시메틸 녹말은 동등하게 점점 증가하는 방법으로 잘 혼합하였다. 5% PVP 무수 에탄올 적당량은 연질 재료를 제조하기 위해 사용되었고, 14-메쉬 체로 알갱이를 만들었고, 1시간 동안 50-60 ℃에서 건조하였다. 상기 제제 복용량에 따른 마그네슘 스테아레이트는 14-메쉬 작은체로 과립체가 첨가되었다.

2. 피막형성

상기 결과 과립을 캡슐에 채웠다.

실시예 6 살비아놀릭산 L의 주사 제제

제제

살비아놀릭산 L 100 g

만니톨 100 g

주사용 증류수 2500 ㎖이상

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

상기 제제는 1000유닛으로 제조되었다.

제조방법:

상기 살비아놀릭산 L을 균일하게 교반되는 주사용 증류수 1000 ㎖에 녹였다. 주사용 증류수 500 ㎖로 상기 만니톨을 녹이고, 앞서 언급한 살비아놀릭산 L 용액에 첨가하여, 균일하게 교반하고, 활성탄 0.5 g을 첨가하고, 20분 동안 항온으로 교반하고 여과하였다. 상기 여과물의 pH는 4.5-5.0으로 조절하고, 2500 ㎖의 주사용 증류수로 희석하고, 멸균 여과하고, 별도 포장하고, 동결 건조하여 완성품을 얻었다.

실시예 7 살비아놀릭산 L 동결건조 파우더 제제

제제

살비아놀릭산 L 100 g

만니톨 100 g

주사용 증류수 2000 ㎖

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

상기 제제는 1000유닛으로 제조되었다.

제조방법:

상기 살비아놀릭산 L 및 만니톨을 무게를 재고 교반되는 주사용 증류수 1500 ㎖로 녹이고, 여기에 20분 동안 교반하여 탈색하기위해 활성탄 0.5.g을 첨가하고, 상기 탄소를 제거하기 위해 상기 용액을 마이크로보이드 여과 필름(0.45 μM)을 통과시켜 여과하고, 주사용 증류수 2000 ㎖ 이상으로 희석하였다. 상기 결과 용액은 멸균 여과하여, 별도 포장하고, 동결 건조하여 완성품을 얻었다.

약물학적 실시예

약물학적 실시예 1 살비아놀릭산 L의 자유 라디칼 - 트래핑 ( trapping ) 반응

자유 라디칼은 높은 활성 물질의 한 종류로 여겨진다. 그것들은 세포의 대사과정 동안 성공적으로 생산되어질 수 있다. 그들의 직접적 또는 간접적 산화 효과로 인하여, 상기 자유 라디칼은 생리학적 및 병리학적 과정에 광범위하게 관여하는 것으로 보여진다. 자유 라디칼이 과다한 양으로 존재할 때, 항상 자유 라디칼은 인체 내에서 핵산, 단백질, 당류 및 지질 등과 같은, 고분자를 산화에 의해 공격한다. 산화, 가교 및 절단에 의한 이러한 물질 변성이 만들어 짐에 의해, 상기 자유 라디칼은 세포 구조 및 기능에 손상을 야기하여, 그 결과 조직 파괴 및 인체의 퇴행성 변형을 일으킨다. 다수의 연구에서 보는 바와 같이, 상기 자유 라디칼은 많은 질병의 병리학적 과정에 기여하고, 그러므로, 심혈관 질병, 다수의 암, 노인성 백내장 및 황반 변성, 및 다수의 염증 및 다양한 종류의 신경성 질병과 같은 많은 질병을 유도한다.

화학 구조 분석은 상기 살비아놀릭산 화합물이 그 항산화 활성에 구조적 기반을 갖는, 페놀릭 하이드록실 기의 공여체임을 나타낸다. 본 연구에서, 1,1-디페닐-2-피크릴-하이드라질(DPPH) 자유 라디칼 소거 반응 모델은 살비아놀릭산 L의 자유 라디칼 소거 활성을 관찰하기 위해 이용되었다.

1. 시약 및 기구

상기 95% 이상의 순도를 갖는 살비아놀릭산 L은 천진 타슬리 그룹 아카데미(Tianjin Tasly Group Academy)로부터 제공받았으며, 실시예 1의 방법에 따라 준비되었다.

비타민 C 및 DPPH는 SIGMA Inc.에서 구입하였다.

자외선 분광광도계(Ultraviolet spectrophotometer, UV_1800)는 Beijing Rayleigh Analytical Instrument Co., Ltd.에서 구입하였다.

2. 실험 방법

전체 반응 부피는 2 ㎖이다. 80% 메탄올(v/v)내 다양한 농도의 샘플 용액 1 ㎖을 100 μM DPPH 메탄올 용액에 첨가하고, 어두운 곳에서 25 ℃, 20분 동안 반응하여 용액을 균등하게 혼합하였다. 반응 용액의 흡광도는 517 nm에서 측정하였다.

본 연구에서, 비타민 C는 양성 대조군으로 간주되었다. 자유라디칼 소거율은 하기 수학식에 따라 계산되었다:

여기서, 상기 A_샘플은 실험된 샘플의 흡광도를 의미하고, A_대조군은 무처리군(blank)을 의미한다.

3. 실험 결과

표 3 및 도 9는 다양한 농도에서 살비아놀릭산 L 및 비타민 C의 DPPH 자유 라디칼 소거율을 나타낸다. 상기 살비아놀릭산 L은 비타민 C에 비해 매우 높은 자유 라디칼 소거율을 가진다.

다양한 농도에서 살비아놀릭산 L 및 비타민 C 간 DPPH 자유 라디칼 소거율의 비교

샘플(μg/㎖)	0.314	0.625	1.25	2.5	5
살비아놀릭산 L	5.41±0.74	12.95±2.42	25.21±1.82	44.19±3.70	83.17±4.12
비타민 C	3.42±0.42	7.06±1.88	13.82±1.83	29.39±5.92	55.34±7.21

약물학적 실시예 2 살비아놀릭 산 L의 환원능의 측정

예방적 항산화를 위한 어느 정도의 잠재성은 약물의 환원능에 의해 표시되어진다. 본 연구에서는 본 발명의 살비아놀릭 산 L의 환원능을 측정하였다.

1. 시약 및 기구

상기 95% 이상의 순도를 갖는 살비아놀릭 산 L은 천진 타슬리 그룹 아카데미(Tianjin Tasly Group Academy)로부터 제공받았으며, 실시예 1의 방법에 따라 준비되었다.

분석적으로 순수한 페르시안화 칼륨(potassium ferricyanide)은 천진 No.1 화학 시약 공장(from Tianjin No.1 Chemical Reagent Factory)에서 구입하였다.

분석적으로 순수한 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid)은 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.에서 구입하였다.

분석적으로 순수한 염화제이철(ferric chloride)은 Tianjin Fengchuan Chemical Reagent Science and Technology Co., Ltd.에서 구입하였다.

비타민 C 는 SIGMA Inc.에서 구입하였다.

자외선 분광광도계(Ultraviolet spectrophotometer, UV-1800)는 Beijing Rayleigh Analytical Instrument Co., Ltd.에서 구입하였다.

냉동 원심분리기(Z323K)는 HEMMLE, 독일에서 구입하였다.

2. 실험 방법

다양한 농도의 살비아놀릭 산 L을 포함한 0.5 ml의 200 mM 인산화 완충용액(pH 6.8) 및 1.0% 페르시안화 칼륨 용액을 각각 빨아들이고 20분 동안 항온 수조(50 ℃)에서 열을 가한 후 얼음에 냉각하였다. 0.5 ml의 트라이클로로아세트산 (10%)을 첨가하고 1000g/분에서 10분 동안 원심분리하였다. 그 결과 얻어진 상등액 1.0 ml을 1 ml의 증류수 및 0.2 ml의 염화제이철 용액(0.1%)에 첨가하고, 10분 동안 정치시킨 다음, 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 동안, 블랭크(blank) 실험을 수행하였다. 비타민 C는 강력한 환원 물질로, 본 연구에서 양성 대조군으로 이용되었다. 샘플의 환원능은 실험한 샘플의 흡광도에서 블랭크(blank) 대조군의 흡광도를 빼서 나타내었다. 그러므로, 가장 높은 흡광도는 가장 강한 환원능을 의미한다.

3. 실험 결과

도 10에서 보는 바와 같이, 두 물질은 농도 의존적인 흡광도를 갖고, 살비아놀릭산 L의 환원능은 비타민 C보다 훨씬 강하다.

하기 약물학적 실시예 3-5에서 이용된 No.1 추출물 및 No.2 추출물의 준비 및 성분 측정.

실험에 이용된 모든 물질은 천진 타슬리 그룹 아카데미 TCM 기관(Tianjin Tasly Group Academy TCM Institute)에서 제공받았다. No.1 추출물의 양은 6.825g의 비정제 약물/No.1 추출물 g이고, No.2 추출물은 양은 4.162g의 비정제 약물/No.2 추출물 g이다.

준비 과정

No.1 추출물의 준비 과정:

89.8 wt% 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae, 중국명: 단센(Danshen)) 및 9.6 wt% 삼칠(Radix notoginseng, 중국명: 산키(Sanqi)) 혼합물은 물(0.45% 탄산수소 나트륨 포함)로 두 번: 물로 2시간 동안 5번 및 물로 1시간 동안 4번 연달아 추출하였다. 95% 에탄올(v/v)은 환류의 수단으로써 물-추출물 용액을 농축하기 위해 사용되었다. 상기 에탄올-침전은 최종 에탄올 함량이 에탄올-추출물 용액의 70%가 될 때까지 수행하였다. 하룻밤동안 정치한 후, 상등액을 얻고 농축하여 No.1 추출물을 얻었다.

No2. 추출물의 준비 과정:

89.8 wt% 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae, 중국명: 단센(Danshen)) 및 9.6 wt% 삼칠(Radix notoginseng, 중국명: 산키(Sanqi)) 혼합물은 물로 두 번: 물로 2시간 동안 5번 및 물로 1시간 동안 4번 연달아 추출하였다. 95% 에탄올(v/v)은 환류의 수단으로써 물-추출물 용액을 농축하기 위해 사용되었고, 상기 에탄올-침전은 최종 에탄올 함량이 에탄올-추출물 용액의 70%가 될 때까지 수행하였다. 하룻밤동안 정치한 후, 상등액을 얻고 농축하여 No.2 추출물을 얻었다. 살비아놀릭 산 L은 본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 준비하였다.

검출 방법:

분석 조건은 하기와 같다: 물 2695 HPLC, Agilent Zorbax SB-C18 (4.6mm×250mm, 5μm) 크로마토그래피 컬럼, 0.02% 인산 수용액은 이동상 A로 이용하였고, 0.02% 인산이 포함된 80% 아세토니트릴 용액은 이동상 B로 이용하였고, 기울기 용리(gradient elution)는 하기 표 4에 따라 수행하였으며, 유속은 1ml/분, 검출 파장은 280nm, 컬럼 온도는 30℃이고, 측정 시간은 50분이었다.

시간(분)	이동상A	이동상 B
0	90	10
8	78	22
15	74	26
35	61	39
40	90	10
50	90	10

No.1 및 No.2 추출물의 각 성분의 함량은 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다.

No.1 추출물에서 각 성분의 함량

성분	함량(%)	비고
프로토카테츄익알데하이드(Protocatechuic aldehyde)	0.33	가장 높은 피크(peak)
단삼수(Danshensu)	0.30
살비아놀릭산 A	0.17
살비아놀릭산 B	0.30-0.76
살비아놀릭산 L	0.43-0.49

No.2 추출물에서 각 성분의 함량

성분	함량(%)	비고
프로토카테츄익알데하이드(Protocatechuic aldehyde)	0.14
단삼수(Danshensu)	0.10
살비아놀릭산 A	0.12
살비아놀릭산 B	3.5
살비아놀릭산 L	0

약물학적 실시예 3 분리된 랫트 ( rat ) 흉부 대동맥에서 살비아놀릭산 L 동결건조 분말의 효과

실험 재료

1. 실험 재료 및 시약: 살비아놀릭산 L 동결건조 분말은 천진 타슬리 그룹 아카데미 TCM 기관(Tianjin Tasly Group Academy TCM Institute)에서 제공받았다. 노리피네프린 씨트레이드(Norepinephrine Citrate, NA) 및 아세틸콜린(acetylcholine, ACH)은 Sigma Inc.에서 제조번호 1377511 44908131을 구입하였다. 크레브스 용액(Kreb 용액)을 준비하기 위한 원재료들은 염화 칼륨(potassium chloride), 염화 나트륨(sodium chloride), 인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate), 탄산수소 나트륨(sodium bicarbonate), 황산 마그네슘(magnesium sulfate), 글루코스(glucose) 및 염화 칼슘(calcium chloride)을 포함한다.

2. 주요 기구: MedLab^® 분리 조직 트로프(trough) 및 Medlab-U/8C 수집 시스템은 난징(Nanjing) 메데스(Medease) 과학 및 기술 Co., Ltd.에서 제공되었다. 다른 장치들은 장력 변환기(tension transducer), 디지털로 조절되는 슈퍼 자동 온도 조절 수조 SC-15, 분석용 저울, 정수기, 및 산소 용기를 포함한다.

3. 실험 동물: SD 랫트(rat), 적절한 체중의 수컷 또는 암컷은 SCXX(Jing) 인증 번호 2007-0001의 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.에서 제공받았다. 모든 랫트는 12시간동안 조명을 비추는, 20-25 ℃ 상온의 방에서 랫트 특이식(Beijing Keaoxieli Diet Co., Ltd.에서 제공) 및 동물의 탭 워터(tap water)를 먹였다.

실험 방법

1. 투여량의 고안

살비아놀릭산 L 동결건조 분말의 양은 다른 살비아놀릭산의 약물학적 실험에 기초하여 정하였다. 본 연구에서, 상기 양은 0.1 mg/㎖이다.

크래브스 용액(Kreb 용액)(mol/ℓ): NaCl(120), NaHCO₃(25), KH₂PO₄(1.2), MgSO₄(1.2), KCl(4.5), CaCl₂(1.25), C₆H₁₂O₆(글루코스 11.1)

KCl： 100 ㎕의KCl 용액(3 mol/ℓ)을 각각의 시간에 첨가하였다(최종 농도 60 mMol/ℓ).

NA: 10^-4 mol/ℓ(최종 농도 10^-6 mol/ℓ)로 총 4번의 구배로 희석되었다.

ACH: 10^-3 mol/ℓ(최종 농도 10^-5 mol/ℓ)는 총 4번의 구배로 희석되었다.

2. 그룹화(Grouping)

자유식이 주어진 랫트를 각각의 날에 약물의 준비에 따라 그룹(group)에 무작위로 놔두었다. 그것은 각 그룹이 8 마리의 랫트로 이루어져 있고, 각 랫트로부터 4 개의 혈관 고리 결과를 이용할 수 있게 한다. 본 연구에서, 상기 랫트를 3개의 그룹으로 나뉘었다: 정상 그룹, 저산소증 모델그룹 및 살비아놀릭산 L+ 저산소증 모델 그룹.

3. 실험 방법

자유식이 주어진 SD 랫트를 각각의 날에 약물의 준비에 따라 그룹에 무작위로 놔두었고, 각 그룹에는 8마리의 랫트가 있다. 상기 랫트는 경추 탈골로 희생시키고, 흉대동맥을 얻기 위해 흉부를 재빨리 열었다. 0 ℃에서 상기 흉대동맥을 산소가 취입된 크래브스 용액내에 놓고, 연결 조직을 제거하고, 흉대동맥을 약 2 mM 지름을 가진 혈관 고리내에 넣은 다음, 상기 혈관 고리를 37 ℃ 항온의 분리된 수조 트로프(trough) 내에서 조심스럽게 마운트(mount)하였다. 산소는 장력 변환기 및 다채널 생리적 리코더가 연결된 트로프를 통해 불어넣어졌다. 기본 장력은 2 g이고, 상기 혈관 고리는 45min^-1h에서 평형을 유지하고, 상기 크래브스 용액은 15분 간격으로 교체되었다. 평형시킨 후, 상기 혈관 고리는 20분 동안 염화 칼륨 용액으로 전처리한 다음, 용리하였다. 15분 동안 평형시킨후, 상기 혈관 고리는 생리학적으로 혈관 수축의 최대 수치에 도달하기 위해 염화 칼륨 용액으로 한번 더 전처리하였다. 다음으로, NA는 혈관수축을 측정하기 위하여 다양한 그레디언트 수준(10^-7, 10^-6, 10^-5, 10^-4 mol/ℓ)의 빛을 첨가하였다. 피크 수치에 도달했을 때, 상기 수치는 플래토 상(plateau phase)에서 안정화되었다. 다음으로, ACH는 혈관확장을 관찰하기 위해 다양한 그레디언트 수준(10^-5, 10^-4, 10^-3, 10^-2 mol/ℓ)의 빛을 첨가하였다. NA 및 ACH를 첨가하는 과정 동안에, 상기 크래브스 용액은 교체될 수 없다.

상기 저산소증 모델 그룹에서, 산소의 공급은 염화 칼륨 용액에 의한 두 번의 전 처리 후에 20분 동안 부유하였다. 그 동안, 동량의 살비아놀릭산 L 동결건조 분말 또는 크래브스 용액을 혼합하여 첨가하고, 이후 다양한 그레디언트 수준의 빛에서 NA및 ACH를 첨가하였다. 상기 크래브스 용액은 저산소증이 시작으로부터ACH의 최종 농도 그레디언트의 첨가의 마지막까지 교체될 수 없다. 상기 결과는 t-test를 이용하여 통계학적으로 분석하였다.

실험 결과

1. 혈관수축 효과

결과에 나타낸 바와 같이, 상기 살비아놀릭산 L 동결건조 분말은 본 실험 조건 하의 정상군에서 혈관수축 효과는 중요하지 않으나, 이는 분명 혈관-장력 커브가 오른쪽으로 이동하였다. 데이터는 표 7에 나타내었다.

혈관 고리 수축 데이터

Group	투여량 (mg/㎖)	NA(mol/ℓ)
Group	투여량 (mg/㎖)	10^-7	10^-6	10^-5	10^-4
정상군		0.13±0.22	0.53±0.49	1.02±0.59	1.27±0.62
저산소증 모델군		-0.01±0.05	0.23±0.41	1.12±0.31	1.37±0.31
저산소증+살비아놀릭산 군	0.1	-0.02±0.06	0.30±0.33	0.84±0.38	1.05±0.48

*: 정상군에 비해, 유의성 있는 차이를 나타내었고(P<0.05), #: 모델군에 비해, 유의성 있는 차이를 나타내었다(P<0.05). 상기 살비아놀릭산 L 동결건조 분말의 혈관수축 효과는 도 11에 나타내었다.

2. 혈관 확장 효과

정상군과 비교한 결과에 나타난 바와 같이, 혈관 확장은 본 실험 조건 하의 저산소증 모델군의 4번의 ACH 변화 정도에서 확연히 약해졌고(P<0.01), 상기 살비아놀릭산 L 처리군과 정상군에서는 유의한 차이는 없었다. 저산소증 모델군과 비교한 결과, 살비아놀릭산 L 처리군의 혈관확장은 3번의 ACH 변화 정도에서 확연히 강해졌다(P<0.05). 상기 살비아놀릭산 L 처리군은 저산소증-유도된 혈관 확장 장애를 매우 증가할 수 있음을 제안하였다. 데이터는 하기 표 8에 나타내었다.

Group	투여량 (mg/㎖)	ACH(mol/ℓ)
Group	투여량 (mg/㎖)	10^-5	10^-4	10^-3	10^-2
정상군		-0.09±0.13	-0.71±0.47	-0.92±0.51	-1.09±0.49
저산소증 모델군		0.06±0.07^**	0.04±0.07^***	-0.03±0.09^***	-0.30±0.37^***
저산소증+살비아놀릭산 처리군	0.1	-0.09±0.18^#	-0.33±0.50^#	-0.47±0.60^#	-0.67±0.69

**: 정상군에 비해, 유의성 있는 차이를 나타내었고(P<0.01);

***: 정상군에 비해, 유의성 있는 차이를 나타내었고(P<0.001);

#: 모델군에 비해, 유의성 있는 차이를 나타내었다(P<0.05).

상기 살비아놀릭산 L 동결건조 분말의 혈관확장 효과는 도 12에 나타내었다.

실험 결과:

상기 살비아놀릭산 L 동결건조 분말은 NA의 혈관수축커브를 오른쪽으로 움직이는 효과가 있고, 유의성 있는 차이는 없는 것으로 관찰되었다. 20분 동안의 저산소증이 모델군에서 ACH 때문에 발생된 혈관고리의 구배 확장을 크게 감소하는 원인일 수 있고, 이완 기능장애의 발생을 초래한다. 상기와는 반대로 상기 살비아놀릭산 L 동결건조 분말은 ACH(10^-5, 10^-4, 10^-3 mol/ℓ) 3중 구배 레벨의 무산소 혈관 고리의 확장에서 상당한 개선 효과를 나타내는 것으로 나타났다(P<0.05). 상기 살비아놀릭산 L은 저산소증에 의한 혈관 확장 기능장애를 크게 증가시키는 효과가 있는 것으로 확인되었다.

주의사항에 대한 고찰:

1. 상기 크래브스 용액 제조 시, 탁도를 위해 다른 기질이 모두 첨가될때까지 칼슘 클로라이드 및 글루코즈는 첨가되지 않는다. 상기 크래브스 용액은 면상침전을 막기 위하여 오랜시간 동안 상온에 보관하지 않는다. 마지막으로, 사이 크래브스 용액은 필요할 때 제조하였다.

2. 상기 심장-대동맥은 가능한 얼음조에서 꺼냈고; 기구에 의한 혈관고리의 상처를 줄이고; 상기 심장-대동맥은 혈관 활성 축소 저해 목적을 위한 혈관궁을 충분히 제거해야한다.

3. 산소는 가능한한 작은 방울의 형태로 제거하고, 혈압 변화에 영향을 줄 수 있는 큰 크기 방울은 데이터에서 제거하였다.

약물학적 실시예 4 살비아놀릭산 L 동결건조 분말 및 그 추출물의 체외 상에서의 신경세포의 보호 효과

실험재료

1. 주요 기기 : Antai Cleaning Equipment Inc에서 생산한 슈퍼클린벤치, 독일 Heraeus에서 구매한 항온 CO₂ 배양기, 미국 BIO-RAD Inc에서 구매한 ELISA 리더기, Jiangsu Guangming Experimental Apparatus Manufacturer로부터 구매한 평판 혼합기, 일본 OLPYMPUS로부터 구매한 도립형 생물 현미경.

2. 주요 시약 : GIBCO로부터 공급된 DMEM 고-글루코즈 배지 및 DMEM 무글루코즈 배지, SIGMA로부터 구매한 트립신, PAA로부터 구매한 소태아혈청, SIGMA로부터 구매한 MTT와 DMSO, Nanjing Jiangchen g Bioengineering Institute로부터 구매한 LDH 시험 키트.

3. 일회용 자재 : CORNING로부터 공급된 96-웰 세공 배양 플레이트

4. 세포주 : PC12

실험 방법:

1. MTT 법

① MTT을 96-웰 세공판의 각 웰에 20 ㎕ 씩 넣고, 배양기에서 4시간동안 반응시킨다.

② 상층액은 버리고, 이어서 150 ㎕의 DMSO를 각 웰에 넣고 평판교반기에서 10분간 교반한다.

③ 세포생존률을 계산하기 위해 각 웰의 흡광도를 ELISA 리더기에서 570 nm의 파장으로 측정하였다.

2. LDH 활성도의 측정

측정은 Nanjing Jiangchen g Bioengineering Institute.로부터 공급된 LDH 시험 키트의 사양에 따른다. 세부 단계를 표 9에 나타내었다.

LDH 활성의 확인을 위한 세부 단계

	무처리(B)	표준 용액 (S)	테스트된 시료(U)	대조시료(C)
초순수 (ultrapure water) (㎕)	2.5+5	2.5		2.5
표준용액 (㎕)		5
시료(㎕)			5	5
매트릭스액 (Matrix fluid)(㎕)	12.5	12.5	12.5	12.5
조효소 (㎕)			2.5
37 ℃에서 15분간 배양된 혼합웰
2,4-디니트로페닐하이드라진	12.5	12.5	12.5	12.5
37 ℃에서 15분간 배양된 혼합웰
0.4 mM NaOH	125	125	125	125
실온에서 3-4분간 배양하고 440 nm에서 흡광도 측정

여기서, ODU은 시험 샘플의 흡광도, ODC는 대조군 샘플의 흡광도, ODB는 공액의 흡광도, ODS는 표준액의 흡광도, CS는 2 mMol/ℓ 의 표준농도, N은 측정전 샘플의 여러 희석 횟수를 나타낸다.

실험 결과:

1. 과산화수소-손상된 모델 제조

(1) 좋은 조건상의 지수적 생장기의 PCl2 세포는 PBS로 두번 세척하고, 37 ℃에서 약 1분 동안 0.25% 트립신 소화 용액을 바로 첨가하여 소화를 수행하였다. 이 반응은 배양 배지가 포함되어 있는 혈청의 첨가에 의해 종결되고, 원심분리하고, 재부유시키고, 그 다음 계산된 세포를 2×104^-4×10⁴ 세포/㎖의 세포농도의 현탁액을 준비하였다.

(2) 상기 세포 현탁액은 각 웰(n=3)당 180 ㎕의 96-웰 마이크로플레이트에 접종하고, 37 ℃ 항온 CO₂ 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다.

(3) 분류 및 처리: 무처리군(PBS), 용매 대조군(DMSO), 모델군(H₂O₂) 및 양성 대조군(에다라본)의 4개의 군으로 분리하였다.

무처리군: PBS만 첨가.

용매 대조군: 0.1% DMSO 첨가.

모델군: 과산화수소(H₂O₂)의 농도는 각각 0.25 mM, 0.5 mM 및 1 mM이고, 반응시간은 1시간 이다.

양성 대조군: 에다라본(2 μg/㎖)은 양성 약물로써 첨가하고, 6시간 동안 전처리하여 0.5 mM 과산화수소를 첨가하여 1시간 동안 손상을 주고 갓 제조된 DMEM+10%FBS 배양 배지로 웰 당 200 ㎕로 옮겼다.

(4) 상기 세포활성은 MTT 법으로 측정하였다.

과산화수소-손상된 모델 제조

Group	최종 농도	생존률(%)
무처리군	0	100±5.65
용매 대조군	0.1% DMSO	93.45±5.21
모델군	0.25 mM H₂O₂	7.65
	0.5 mM H₂O₂	40.31±4.63 ^##
	1 mM H₂O₂	34.36±6.15 ^##
양성 대조군	2 μg/㎖(에다라본)	53.54±3.66 ^*

*: 0.5 mM H₂O₂(P<0.05)의 모델군과 비교, ##: 용매 대조군(P<0.01)과 비교.

표 10에 나타낸 바와 같이, 0.5 mM H₂O₂을 1시간 동안 처리한 후, PC12 세포 생존률은 40%이고, 저해율은 60%이다. 상기 과산화수소-손상된 모델은 0.5 mM H₂O₂을 1시간 동안 처리된 PC12 세포이다.

2． 산소-글루코스 실조(OGD) 모델의 제조

(1) 좋은 조건 상의 지수적 생장기의 PCl2 세포는 PBS로 두번 세척하고, 37 ℃에서 약 1분 동안 0.25% 트립신 소화 용액을 바로 첨가하여 소화를 수행하였다. 이 반응은 배양 배지가 포함되어 있는 혈청의 첨가에 의해 종결되고, 원심분리하고, 재부유시키고, 그 다음 계산된 세포를 2×104^-4×10⁴ 세포/㎖의 세포농도의 현탁액을 준비하였다.

(3) 분류 및 처리: 무처리군 무처리군(정상산소상태+0.1% DMSO), 모델군(OGD+0.1% DMSO, 산소-글루코스 실조) 및 양성 대조군(에다라본)의 3개의 군으로 분리하였다.

모델군: 배양 마이크로플레이트의 세포는 무글루코즈 DMEM 배지로 세포배양하고, 저산소 환경으로 옮기고, O₂%가 최소 2.6 일 때, 기록시간 0.5시간 동안 시작하고, 그 다음 일반 배양기에서 형질전환하였다. 상기 측정은 배양 후 수행하였다.

양성 대조군: 에다라본(2 μg/㎖)은 양성 약물로써 첨가하였다. 상기 약물을 첨가하고 6시간 동안 전처리하고, 그 다음 웰 당 180 ㎕로 무글루코즈 배지로 옮겼다. 상기 약물을 다시 첨가하고, 저산소 환경으로 옮기고, O₂%가 최소 2.6 일 때, 기록시간 0.5시간 동안 시작하고, 그 다음 일반 배양기에서 형질전환하였다. 상기 측정은 배양 후 수행하였다.

(4) 상기 세포활성은 MTT 법으로 측정하였다.

산소-글루코스 실조 모델의 제조

그룹	최종 농도	생존률(%)
무처리군	0.1% DMSO	100±6.66
모델군	0.1% DMSO	42.59±3.06^##
양성 대조군	2 μg/㎖(에다라본)	48.50±1.81^*

*: P<0.05, 모델군과 비교; ##: P<0.01, 무처리군과 비교.

표 11에 나타낸 바와 같이, 산소-글루코스 실조-손상된 PC12 세포의 생존률은 42%이고 저해율은 58%이다. 따라서, 상기 본 실험의 산소-글루코스 실조 모델은 무글루코즈 DMEM 배지에서 배양세포로 선택되고, 저산소 환경으로 옮겨 O2%가 최소 2.6 일 때, 기록시간 0.5시간 동안 시작하고, 그 다음 일반 배양기에서 형질전환하였다. 상기 측정은 배양 후 수행하였다.

3. H₂O₂-손상된 PC12 세포의 세포 생존률에 대한 약물 효과

(3) 분류 및 처리: 무처리군(PBS), 용매 대조군(DMSO 또는 에틸아세테이트), 모델군(H₂O₂), 양성 대조군(에다라본) 및 약물 처리군의 5개의 군으로 분리하였다.

양성 대조군: 에다라본(2 μg/㎖)은 양성 약물로써 첨가하고, 6시간 동안 전처리하여 0.5 mM 과산화수소를 첨가하여 1시간 동안 손상을 주고 갓 제조된 DMEM+10%FBS 배양 배지로 옮겼다.

약물 처리군: 배양 마이크로플레이트의 세포는 무글루코즈 DMEM 배지로 세포배양하고, 각 농도의 각각 테스트된 약물을 먼처 첨가하고, 웰 당 20 ㎕으로 6 시간동안 전처리하고, 1시간 동안 손상을 주고 0.5 mM H₂O₂가 첨가되었고, 갓 제조된 DMEM+10%FBS 배양 배지로 옮겼다.

(4) LDH 활성 측정을 위해 상기 상층액을 웰 당 20 ㎕ 모았다.

(5) 세포 마이크로플레이트의 상기 세포의 활성은 MTT법에 의해 측정하였다.

H₂O₂-손상된 PC12 세포의 세포 생존률에 대한 약물 효과

그룹	최종 농도	생존률(%)
용매 대조군 (DMSO)	0.1% DMSO	100±0.66
	0.01% DMSO	100±0.48
	0.001% DMSO	100±0.4
용매 대조군 (EtOAc)	0.1% EtOAc	100±0.86
	0.01% EtOAc	100±1.38
	0.001% EtOAc	100±0.96
모델군 (0.5 mMH₂O₂+DMSO)	0.5 mM H₂O₂+0.1% DMSO	47.32±1.15^##
	0.5 mM H₂O₂+0.01% DMSO	43.65±3.0 ^##
	0.5 mM H₂O₂+0.001% DMSO	40.67±3.61^##
모델군 (0.5 mMH₂O₂+EtOAc)	0.5 mM H₂O₂+0.1%EtOAc	38.45±2.15^##
	0.5 mM H₂O₂+0.01%EtOAc	39.28±1.75^##
	0.5 mM H₂O₂+0.001%EtOAc	39.65±1.84 ^##
양성 대조군(에다라본)	2 μg/㎖	58.18±2.64 ^**
	0.2 μg/㎖	44.2±6.11
	0.02 μg/㎖	47.6±2 ^*
약물 처리군 (No.1 살비아놀릭산 L의 추출물)	2 μg/㎖	50.65±5.65
	0.2 μg/㎖	44.75±4.56
	0.02 μg/㎖	43.2±1.6
약물 처리군 (No.2 살비아놀릭산 L 추출물)	2 μg/㎖	40.09±2.39
	0.2 μg/㎖	43.23±5.72
	0.02 μg/㎖	44.67±6.42
약물 처리군 (노란빛 분말: 살비아놀릭산 L)	2 μg/㎖	48.34±0.25
	0.2 μg/㎖	44.89±0.48
	0.02 μg/㎖	47.2±0.8^*

*: P<0.05, 모델군(0.5 mM H₂O2+DMSO)과 비교;

**: P<0.01, 모델군(0.5 mM H₂O₂+DMSO)과 비교;

##: P<0.01, 용매 대조군(DMSO)과 비교.

약물 농도는 각각 DMSO 0.1%, 0.01% 및 0.001%로 준비하고, 농도에 해당하는 용매대조군과 비교하였다. 여기에서 상기 약물 처리군은 모델군(0.5 mM H₂O₂+EtOAc)과 비교하였고, 상기 모델군(H₂O₂+EtOAc)은 용매대조군(EtOAc)과 비교하였다.

H₂O₂-손상된 PC12 세포의 LDH 활성에 대한 약물 효과

그룹	최종 농도	LDH 활성(U/ℓ)
용매 대조군 (DMSO)	0.1% DMSO	325.71±11.42
	0.01% DMSO	348.5±16.33
	0.001% DMSO	374.16±3.81
용매 대조군 (EtOAc)	0.1% EtOAc	313.9±16.33
	0.01% EtOAc	329.97±16.34
	0.001% EtOAc	342.29±30.13
모델군 (0.5 mMH₂O₂+DMSO)	0.5 mM H₂O₂+0.1% DMSO	608.5±16.33 ^##
	0.5 mM H₂O₂+0.01% DMSO	599.55±0 ^##
	0.5 mM H₂O₂+0.001% DMSO	617.45±16.33^##
모델군 (0.5 mMH₂O₂+EtOAc)	0.5 mM H₂O₂+0.1%EtOAc	596.95±33.08^##
	0.5 mM H₂O₂+0.01%EtOAc	590.74±31.43^##
	0.5 mM H₂O₂+0.001%EtOAc	610.81±11.55 ^##
양성 대조군 (에다라본)	2 μg/㎖	523.49±5.17 ^**
	0.2 μg/㎖	568.23±11.55 ^**
	0.02 μg/㎖	532.44±11.55^**
약물 처리군 (No.1 살비아놀릭산 L 추출물)	2 μg/㎖	465.32±32.68 ^*
	0.2 μg/㎖	416.11±63.91 ^**
	0.02 μg/㎖	483.22±21.92 ^**
약물 처리군 (No.2 살비아놀릭산 L 추출물)	2 μg/㎖	487.70±11.55 ^**
	0.2 μg/㎖	407.16±34.66 ^**
	0.02 μg/㎖	559.28±27.82
약물 처리군 (노랑빛 분말: 살비아놀릭산 L 추출물)	2 μg/㎖	487.70±72.51
	0.2 μg/㎖	474.27±71.96 ^*
	0.02 μg/㎖	550.336±25.83

*: P<0.05, 모델군(0.5 mM H₂O₂+DMSO)과 비교;

**: P<0.01, 모델군(0.5 mM H₂O₂+DMSO)과 비교;

##: P<0.01, 용매 대조군(DMSO)과 비교.

여기에서, 상기 약물 처리군은 상기 모델군(0.5 mM H₂O₂+EtOAc)과 비교하였고, 상기 모델군(H₂O₂+EtOAc)은 용매 대조군(EtOAc)과 비교하였다.

4. 산소-글루코스 실조의 PC12 세포의 생존률에 대한 약물 효과

(3) 분류 및 처리: 무처리군(정상산소상태+0.1% DMSO), 모델군(OGD+DMSO, 산소-글루코스 실조), 양성 대조군(에다라본) 및 약물 처리군 무처리군(PBS)의 4개의 군으로 분리하였다.

모델군: 배양 마이크로플레이트의 세포는 무글루코즈 DMEM 배지로 세포배양하고, 저산소 환경으로 옮기고, O₂%가 최소 2.6 일 때, 기록시간 0.5시간 동안 시작하고, 그 다음 일반 배양기에서 밤샘 배양하여 형질전환하였다.

양성 대조군: 에다라본(2 μg/㎖)은 양성 약물로써 첨가하였다. 상기 약물을 첨가하고 6시간 동안 전처리하고, 그 다음 상기 배양 배지는 웰 당 180 ㎕로 무글루코즈 배지로 옮겼다. 상기 약물을 다시 첨가하고, 저산소 환경으로 옮기고, O₂%가 최소 2.6 일 때, 기록시간 0.5시간 동안 시작하고, 그 다음 일반 배양기에서 밤샘 배양하여 형질전환하였다.

약물 처리군: 상기 각 농도의 약물을 첨가하고 6시간 동안 전처리하고, 상기 배양 배지는 웰 당 180 ㎕의 무글루코즈 DMEM 배지로 옮겼다. 상기 약물을 다시 첨가하고, 저산소 환경으로 옮기고, O₂%가 최소 2.6 일 때, 기록시간 0.5시간 동안 시작하고, 그 다음 일반 배양기에서 밤샘 배양하여 형질전환하였다.

(4) 상층액을 웰 당 20 ㎕ 모아, LDH 활성 측정에 사용하였다.

(5) 상기 세포의 활성은 MTT법에 의해 측정하였다.

산소-글루코스 실조의 PC12 세포의 세포 생존률에 대한 약물의 효과

Group	최종 농도	생존률(%)
무처리군 (정상산소상태+DMSO)	0.1% DMSO	100±0.27
	0.01% DMSO	100±0.68
	0.001% DMSO	100±0.77
무처리군 (정상산소상태+EtOAc)	0.1% EtOAc	100±1.07
	0.01% EtOAc	100±0.45
	0.001% EtOAc	100±1.02
모델군 (OGD+ EtOAc)	0.1% EtOAc	29.19±1.65 ^##
	0.01% EtOAc	30.15±1.47 ^##
	0.001% EtOAc	31.26±2.08 ^##
모델군 (OGD+DMSO)	0.1% DMSO	26.65±1.17 ^##
	0.01% DMSO	31.75±0.77 ^##
	0.001% DMSO	38.54±1.75 ^##
양성 대조군 (OGD+에다라본)	2 μg/㎖	39.99±0.55 ^**
	0.2 μg/㎖	36.37±2.52^*
	0.02 μg/㎖	44.75±1.02^**
처리군 (No.1 살비아놀릭산 L 추출물)	2 μg/㎖	42.35±1.75 ^**
	0.2 μg/㎖	40.13±0.34 ^**
	0.02 μg/㎖	34.33±0.9
처리군 (No.2 살비아놀릭산 L 추출물)	2 μg/㎖	40.58±2.79 ^*
	0.2 μg/㎖	46.6±2.42 ^**
	0.02 μg/㎖	46.83±1.5 ^**
처리군 (노랑빛 분말: 살비아놀릭산 L)	2 μg/㎖	35.96±1.44
	0.2 μg/㎖	36.68±2.72^*
	0.02 μg/㎖	47.74±1.72 ^**

*: P<0.05, 모델군(OGD+DMSO)과 비교; **: P<0.01, 모델군(OGD+DMSO)과 비교; ##: P<0.01, 무처리군(정상산소상태+DMSO)과 비교. 여기에서, 상기 약물 처리군은 무처리군(OGD+EtOAc)과 비교하였고, 모델군(OGD+EtOAc)은 무처리군(정상산소상태+DMSO)과 비교하였다.

(6) LDH 활성

산소-글루코스 실조(OGD) PC12 세포의 LDH 활성에 대한 약물의 효과

Group	최종 농도	LDH 활성(U/ℓ)
무처리군 (정상산소상태+DMSO)	0.1% DMSO	21.08±5.17
	0.01% DMSO	24.01±7.31
	0.001% DMSO	22.01±11.55
무처리군 (정상산소상태+EtOAc)	0.1% EtOAc	23.96±10.33
	0.01% EtOAc	20.78±5.17
	0.001% EtOAc	22.37±7.31
모델군 (OGD+ EtOAc)	0.1% EtOAc	46.35±11.55^##
	0.01% EtOAc	42.39±5.17 ^##
	0.001% EtOAc	58.92±10.33^##
모델군 (OGD+DMSO)	0.1% DMSO	49.22±5.17^##
	0.01% DMSO	40.27±5.17^##
	0.001% DMSO	62.64±14.61^##
양성 대조군(OGD+에다라본)	2 μg/㎖	31.32±5.17 ^**
	0.2 μg/㎖	22.37±5.17 ^**
	0.02 μg/㎖	40.27±5.17^*
약물 처리군 (No.1 extract of the 살비아놀릭산 L)	2 μg/㎖	31.32±5.17 ^**
	0.2 μg/㎖	44.74±10.33
	0.02 μg/㎖	80.54±30.13
약물 처리군 (No.2 extract of the 살비아놀릭산 L)	2 μg/㎖	102.91±25.83
	0.2 μg/㎖	31.32±5.17^*
	0.02 μg/㎖	67.11±5.17
약물 처리군 (노랑빛 파우더: the 살비아놀릭산 L)	2 μg/㎖	40.27±5.17^*
	0.2 μg/㎖	31.32±11.55
	0.02 μg/㎖	53.69±29.23

*: P<0.05, 모델군과 비교(OGD+DMSO); **: P<0.01, 모델군과 비교(OGD+DMSO); ##: P<0.01, 무처리군과 비교(정상산소상태+ DMSO).

여기에서, 상기 약물 처리군은 무처리군(OGD+EtOAc)과 비교하였고, 모델군(OGD+EtOAc)은 무처리군(정상산소상태+EtOAc)과 비교하였다.

결론

실험 결과: 0.02 μg/㎖ 투여량의 살비아놀릭산 L 동결건조 분말을 처리하였을 때, 상기 H₂O₂-손상된 PC12 세포의 세포 생존률은 47%(P<0.05)이고; 0.2 μg/㎖ 투여시, LDH 활성은 474(P<0.05)이다. 0.02, 0.2 및 2 μg/㎖의 투여량의 No.1 살비아놀릭산 L 추출물에 대해서는, LDH 활성이 각각 483(P<0.01), 416(P<0.01) 및 465(P<0.05)이고; 0.2 및 2 μg/㎖의 투여량의 No.2 살비아놀릭산 L 추출물에서 LDH 활성은 각각 407(P<0.01) 및 488(P<0.01)이고, 모델군과 비교하여 이는 둘다 LDH 활성 저해 효과가 있다. 0.02 and 0.2 μg/㎖ 투여량의 살비아놀릭산 L 동결건조 분말을 처리하였을 때, 상기 OGD 세포의 생존률은 각각 48%(P<0.01) 및 37%(P<0.05)이다. 0.2 및 2 μg/㎖의 투여량의 No.1 살비아놀릭산 L 추출물에 대해서는, 생존률이 각각 40%(P<0.01) and 42%(P<0.01)이고, 0.02, 0.2 및 2 μg/㎖의 투여량의 No.2 살비아놀릭산 L 추출물에서 생존률은 각각 47%(P<0.01), 47%(P<0.01) and 41%(P<0.05)이다. 0.2 μg/㎖ 투여량의 살비아놀릭산 L 동결건조 분말을 처리하였을 때, 상기 LDH 활성은 40(P<0.05)이다. 게다가, 2 μg/㎖의 투여량의 No.1 살비아놀릭산 L 추출물에 대해서는, LDH 활성은 31(P<0.01)이고, 0.2 μg/㎖의 투여량의 No.2 살비아놀릭산 L 추출물에서 LDH 활성은 31(P<0.05)이다.

상기 실험에서 나타난 바와 같이, 상기 살비아놀릭산 L 동결건조 분말은 OGD 또한 H₂O₂에 의한 체외 신경세포 손상에 대해 상당히 증가하는 효과뿐만 아니라, 세포의 생존률도 증가하였다. 따라서, 살비아놀릭산 L은 산소 결핍, 글루코스 결핍 및 과산화의 조건에서 신경세포를 보호하는 기능이 있는 것을 확인하였다.

약물학적 실시예 5 심근경색증 랫트 실험에서 살비아놀릭산 L 동결건조 분말 및 추출물의 보호 효과

실험 재료:

1. 시험 재료 및 시약: 피투이트린(Pit) 주사는 Nanjing Xinbai Pharmaceutical사의 제조 번호 070302로 생산되었다. 식염수는 Tianjin Tian’an Pharmaceutical 사의 제조번호 200605241, 사양: 500 ㎖/병으로 생산되었다.

2. 주요 장치: MedLab^® 8-채널 생리적 레코더(biophysiological recorder)는 난징(Nanjing) 메데스(Medease) 과학 및 기술 Co., Ltd.에서 생산되었다.

3. 동물: SD 랫트(rat), 적절한 체중의 수컷 또는 암컷은 SCXX(Jing) 인증 번호 2007-0001의 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.에서 제공받았다. 모든 랫트는 12시간동안 조명을 비추는, 20-25 ℃ 상온의 방에서 랫트 특이식(Beijing Keaoxieli Diet Co., Ltd.에서 제공) 및 동물의 탭 워터(tap water)를 먹였다.

실험 방법

1. 투여량의 고안

No.1 추출물의 양은 6.825 g의 생약/No.1 추출물 g이고, No.2 추출물은 양은 4.162 g의 생약/No.2 추출물 g이다. No.1 및 No.2 추출물 둘 다 모두에서, 고농도와 저농도의 두 그룹이 있다: 각각 1.086 g 생약/k g 및 0.543 g 생약/kg. 생약의 양 변환에 따라, 고농도 No. 1추출물에서 살비아놀릭산 L 동결건조 분말의 투여량은 4.67 mg/kg이고, 저농도 그룹에서는 2.33 mg/kg이다. 살비아놀릭산 L이 No.2 추출물에서는 발견되지 않았다.

살비아놀릭산 L 동결건조 분말의 투여량은 10.0 mg/k g 및 5.0 mg/kg이다.

2. 그룹화

2.1 동물의 스크리닝

공식적인 실험을 하기 전에, 랫트는 미동맥을 통해 피투이트린(Pit)(1U/kg)을 주사하였다. J 포인트 상승 및 T 파 이상을 관찰하기 위해 정상적 ECG 와 주사 5분 후 ECG를 측정하였다. 주사전에 비정상 ECG를 갖거나 또는 Pit에 무감각한 동물은 제외되었다.

2.2 동물의 그룹화

바람직한 랫트들을 7 개의 그룹으로 나누었다 : ① 모델 대조군 그룹, ② 단삼(Danshen)의 No.1 추출물 저농도 그룹(A 그룹), ③ 단삼(Danshen)의 No.1 추출물 고농도 그룹(B 그룹), ④ 단삼(Danshen)의 No.2 추출물 저농도 그룹(C 그룹), ⑤ 단삼(Danshen)의 No.2 추출물 고농도 그룹(D 그룹), ⑥ 살비아놀릭산 L 동결건조 분말 저농도 그룹(E 그룹), 및 ⑦ 살비아놀릭산 L 동결건조 분말 고농도 그룹(F 그룹).

3. 실험 방법

SD 랫트는, 각 그룹당 8 마리 동물로 절반은 수컷이고 절반은 암컷으로 그룹을 무작위로 나누었다. 처리군의 랫트는 당일에 다양한 샘플의 수성 서스펜션(suspension)으로 흠뻑 적신 반면, 모델 대조군 그룹의 랫트는 동일한 양의 식염수로 흠뻑 적셨다. 모든 동물에는 7일 동안 연속적으로 투여하였다. 마지막 투여 후 40분에, 랫트를 마취시키고, 리드(lead) II 정상 ECG를 측정하기 위해 장치와 연결하였다. 피투이트린(Pit)는 약 10초 내에 미동맥을 통해 1U/k g 체중의 투여량으로 일정한 속도로 주사되었다. 투여 후, 0초, 5초, 10초, 15초, 30초, 45초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분 및 15분에 ECG 변화를 측정하였다. J 포인트 및 T 파의 변화를 분석하기 위하여 각 그룹에서 Pit 주사 전후간 차이뿐 아니라, 처리군과 모델 대조군 그룹간 차이를 비교하였으며, 결과는 t-test로 분석하였다.

실험 결과

1. J 포인트에서의 효과

결과에서 보는 바와 같이, 모델 대조군 그룹과 비교하여, 피투이트린 유발 심근경색증에서 15초, 30초 및 45초에서, F 그룹(살비아놀릭산 L 동결건조 분말 고농도 그룹)의 ECG J 포인트의 증가 정도가 작았고, 그 차이는 본 실험 조건하에서 통계적으로 유의하였다(P<0.05). 모델 대조군 그룹과 비교하여, B 그룹(단삼의 No.1 추출물 고농도 그룹)의 ECG J 포인트의 증가 정도는 15초에서 적었으며, 그 차이가 통계적으로 유의하였다(P<0.05). 하지만, 모델 대조군 그룹과 비교하여, 다른 그룹들은 각 시간-지점에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 결과는 표 16에서 보여준다.

심근경색증의 ECG J 포인트에서 다양한 추출물 투여 그룹의 효과

그룹

시간 지점

정상

0초

15초

30초

45초

1분

2분

3분

4분

5분

10분

15분

모델

-0.059
±0.083

-0.029
±0.070

0.020
±0.059

-0.028
±0.070

-0.031
±0.100

-0.004
±0.055

-0.040
±0.059

-0.114
±0.079

-0.132
±0.070

-0.072
±0.061

-0.033
±0.043

-0.040
±0.075

A 그룹

-0.075
±0.096

0.039
±0.074

0.046
±0.060

0.008
±0.073

-0.009
±0.099

0.004
±0.090

0.002
±0.098

0.005
±0.079*

0.013
±0.087*

-0.003
±0.082

-0.0006
±0.102

0.014
±0.119

B 그룹

-0.045
±0.061

-0.051
±0.077

-0.067
±0.093*

-0.041
±0.077

-0.018
±0.072

0.013
±0.076

-0.036
±0.074

-0.040
±0.054

-0.042
±0.060*

-0.033
±0.066

-0.086
±0.117

-0.085
±0.102

C 그룹

-0.036
±0.064

-0.060
±0.087

-0.020
±0.096

-0.057
±0.112

-0.020
±0.101

-0.027
±0.084

-0.016
±0.052

0.001
±0.054*

-0.021
±0.077*

-0.030
±0.090

-0.005
±0.109

-0.020
±0.106

D 그룹

0.003
±0.076

0.069
±0.070*

0.060
±0.075

0.017
±0.098

0.080
±0.077*

0.106
±0.070*

0.035
±0.133

-0.020
±0.223

0.077
±0.041*

0.069
±0.032*

0.088
±0.085*

0.027
±0.111

E 그룹

-0.032
±0.046

-0.040
±0.057

-0.023
±0.076

-0.051
±0.092

-0.030
±0.081

-0.026
±0.074

-0.019
±0.062

0.003
±0.079

-0.018
±0.107

-0.023
±0.087

-0.015
±0.108

-0.018
±0.098

F 그룹

-0.024
±0.056

-0.038
±0.047

-0.070
±0.045*

-0.068
±0.028*

-0.049
±0.010*

-0.006
±0.087

-0.032
±0.153

-0.087
±0.093

-0.079
±0.076

-0.069
±0.081

-0.088
±0.088

-0.027
±0.120

*: 모델 대조군 그룹과 비교하여, 유의한 차이가 있음(P<0.05)

2. T 파에서의 효과

결과에서 보는 바와 같이, 모델 대조군 그룹과 비교하여, 15초 및 30초에서 F 그룹(살비아놀릭산 L 동결건조 분말 고농도 그룹)의 ECG T 파의 증가 정도가 적었고, 그 차이는 본 실험 조건하에서 통계적으로 유의하였다(P<0.05). 유사하게, 모델 대조군 그룹과 비교하여, B 그룹(단삼의 No.1 추출물 고농도 그룹)의 ECG T 파의 증가 정도는 15초에서 적었으며, 그 차이가 통계적으로 유의하였다(P<0.05). 하지만, 모델 대조군 그룹과 비교하여, 다른 그룹들은 각 시간-지점에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 결과는 표 17에서 보여준다.

심근경색증의 ECG T 파에서 다양한 추출물 투여 그룹의 효과

그룹

시간 지점

정상

0초

15초

30초

45초

1분

2분

3분

4분

5분

10분

15분

모델

0.095
±0.092

0.150
±0.078

0.260
±0.082

0.120
±0.099

0.089
±0.118

0.161
±0.016

0.120
±0.105

0.043
±0.161

0.057
±0.196

0.124
±0.158

0.151
±0.097

0.121
±0.160

A 그룹

0.163
±0.091

0.416
±0.368

0.247
±0.072

0.199
±0.069

0.170
±0.116

0.202
±0.063

0.208
±0.086

0.222
±0.053*

0.160
±0.100

0.208
±0.064

0.164
±0.146

0.135
±0.176

B 그룹

0.156
±0.090

0.171
±0.143

0.165
±0.064*

0.104
±0.163

0.121
±0.117

0.148
±0.065

0.167
±0.053

0.151
±0.065

0.105
±0.082

0.161
±0.075

0.114
±0.132

0.075
±0.160

C 그룹

0.122
±0.131

0.121
±0.167

0.257
±0.246

0.229
±0.098

0.244
±0.073*

0.247
±0.086*

0.226
±0.085*

0.188
±0.066*

0.176
±0.141

0.164
±0.143

0.177
±0.063

0.170
±0.129

D 그룹

0.177
±0.101

0.258
±0.079*

0.287
±0.076

0.249
±0.068*

0.354
±0.222*

0.290
±0.105*

0.192
±0.213

0.126
±0.279

0.235
±0.043

0.233
±0.033

0.205
±0.070

0.189
±0.185

E 그룹

0.102
±0.103

0.130
±0.201

0.207
±0.136

0.194
±0.159

0.187
±0.173

0.139
±0.186

0.142
±0.185

0.121
±0.166

0.116
±0.119

0.204
±0.243

0.197
±0.163

0.181
±0.121

F 그룹

0.097
±0.141

0.124
±0.179

0.151
±0.096*

0.094
±0.084*

0.142
±0.102

0.139
±0.175

0.130
±0.201

0.096
±0.179

0.137
±0.143

0.163
±0.133

0.185
±0.107

0.195
±0.235

*: 모델 대조군 그룹과 비교하여, 유의한 차이가 있음(P<0.05)

결론:

모델 대조군 그룹과 비교하여, F 그룹(살비아놀릭산 L 동결건조 분말 고농도 그룹)의 ECG J 포인트 및 T 파의 증가 정도는 15초 및 30초에서 적었고, 그 차이는 통계적으로 유의하였다(P<0.05).

모델 대조군 그룹과 비교하여, 15초에서 J 포인트 및 T 파 둘 다 B 그룹(단삼의 No. 1 추출물 고농도 그룹)에서 유의하게 감소하였다(P<0.05).

모델 대조군 그룹과 비교하여, 다른 그룹은 각 시간-지점에서 J 포인트 및 T 파의 유의적 감소가 나타나지 않았다.

결과에서 보는 바과 같이, 본 연구하에서, 살비아놀릭산 L 동결건조 분말(10 mg/kg) 및 살비아놀릭산 L 4.67 mg/k g 농도를 포함한 No.1 추출물이 항-급성 심근경색 효과를 갖지만, 살비아놀릭산 L을 포함하지 않는 No.2 추출물의 실험 투여량하에서는 항-급성 심근경색 효과가 관찰되지 않았다.

주의사항에 대한 고찰:

1. J 포인트의 정의: QRS 파군 및 ST의 끝부분의 결합 부위를 나누었다.

2. 피투이트린의 관상동맥혈관에 대한 수축효과에 의해 정상 쥐에 피투이트린을 정맥주사하여 심근경색증을 유도할 수 있어, ECG 내 J 포인트와 T 파 둘 다 확실히 상승하였다. 약물 처리군의 J 포인트의 이동은 상당히 돌아오고 및 T 파는 상기 실험 약물을 투여한 후 정상 수준으로 천천히 증가하였고, 이는 관상동맥 혈관 내 피투이트린의 수축 효과에 의해 유도된 심근경색증에 대해 길항효과가 있는 약물임을 제안하였다. 상기 치료효과를 가지는 약물은 1단계 기형(0-45초 내 피투이트린에 의한 유도) 이든지 Ⅱ단계 기형(45초-15분 내 피투이트린에 의한 유도)이든지 간에 보통 항-심근허혈 효과가 있다고 여겨진다.

3. 실험하는 동안, 동일 배치 수의 상기 피투이트린은 실험 결과에서 약물 효능 단위의 효과를 방지하는 데 사용될 수 있다. 피투이트린은 약제내성 방지를 위해 2시간 이상 간격으로 주사해야한다. 바람직하게는, 선택된 동물에 매일 사용하였다.

Claims

하기 화학식(I)로 표시되는 신규 화합물 살비아놀릭산 L, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 및 가수분해 가능한 에스테르:

화학식(I)
(1) 추출: 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae) 생약 또는 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae) 및 다른 생약 혼합물을 물로 추출하고, 침전물에 알코올을 첨가하고 상층액을 얻은 후, 상기 상층액을 농축하여 추출물을 얻는 단계;
(2) 분리: 상기 단계(1)의 추출물을 물에 녹이고, 거대다공성(macroporous) 흡착 레진에 적용한 후, 물로 상기 레진을 용출시켜 용출액을 얻고, 상기 용출액을 산성화한 다음, 상기 산성화된 용출액을 다시 상기 거대다공성 흡착 레진에 적용하고, 상기 레진을 산성 수용액으로 세척하여 불순물을 제거한 후, 상기 레진을 에탄올을 용출시켜 에탄올 용출액을 얻고, 상기 에탄올 용출액을 농축하여 추출물을 얻는 단계;
(3) 정제: 상기 단계 2의 추출물을 클로로포름, 메탄올 및 포름산의 이동상으로 등용매 용출하는 건조 방법을 이용한 실리카겔 컬럼에 적용하고; 상기 용출액을 모으고; TLC로 모든 용출액을 확인하고, 특성상 유사 용출액을 혼합하여 살비아놀릭산 L을 얻는 단계;를 포함하는 제1항의 살비아놀릭산 L의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 단계(1)에서, 상기 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae) 생약 또는 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae) 및 다른 생약의 혼합물을 달임용 조각으로 슬라이싱하고; 상기 물-추출물은 상기 생약 부피의 4-8배의 물로 1.5-3.5 시간 동안 상기 생약을 달이고, 여과한 후; 생약 잔사 부피의 3-6배의 물로 생약 잔사를 1-3시간 동안 달이고 여과한 다음; 여액을 모은 후, 상기 여액을 농축하여 상대 밀도 1.11-1.28(80 ℃)의 추출물을 얻고; 상기 알코올-침전물은 95% 에탄올을 상기 추출물에 첨가하여 에탄올 함량이 65%-70%가 될 때 까지 침전시키고, 12-36시간 동안 방치한 다음, 감압하에 에탄올을 회수하여 상층액을 농축하고, 상대 밀도 1.30-1.38(60 ℃)의 추출물을 얻고;
상기 단계(2)에서, 상기 단계 (1)의 최종 추출물을 거대다공성 흡착 레진 컬럼에 적용하되, 상기 거대다공성 흡착 레진에 대한 생약의 무게비는 5:1-1:1이고, 상기 레진 컬럼은 충전 부피(bed volume) 8-15배의 물로 세척하여 물 용출액을 얻고, 상기 물 용출액에 염산을 첨가하여 pH 값을 2.2-3.5로 조절하고; 상기 산성 용출액을 거대다공성 흡착 레진에 대한 생약의 무게 비가 5:1-1:1인 거대다공성 흡착 레진 컬럼에 다시 적용하고, 상기 컬럼은 용출액이 거의 무색이 될 때까지 pH 값이 2.2-3.5의 염산으로 세척하고; 충전 부피의 3-8 배의 50%-95% 에탄올을 상기 컬럼 세척에 사용하고, 상기 용출액을 농축하여 알코올 냄새가 없는 추출물을 얻고; 상기 거대다공성 흡착 레진은 AB-8, HPD450, HPD700, D101, D4020 또는 X5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나의 거대다공성 흡착 레진이고;
상기 단계 (3)에서, 상기 단계 (2)에서 농축하여 얻은 추출물을 유기 용매에 녹이고, 크로마토그래피 실리카겔과 혼합하고, 잘 혼합된 상기 시료를 공고하게 충진된 실리카겔 컬럼에 위치시킨 다음, 상기 컬럼을 클로로포름:메탄올:포름산의 부피 비가 90:10:3-40:10:0.5인 이동상으로 용출시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 단계(1)에서, 상기 물-추출물은 상기 생약은 생약의 부피의 4배의 물로 2시간 동안 달이고 여과한 후; 생약 잔사는 생약 잔사 부피의 3배의 물로 1시간 동안 달이고, 여과한 다음; 여액을 모은 후, 상기 추출물을 1.2의 상대 밀도로 농축하여 얻고; 상기 알코올-침전물은 상기 추출물은 95% 에탄올을 첨가하여 에탄올 함량이 70% 될 때까지 침전시키고, 24시간 동안 방치한 다음, 감압 하에서 에탄올을 회수하여 상층액을 농축하고, 상대 밀도 1.37의 추출물을 얻고;
상기 단계 (2)에서, 상기 단계 (1)의 최종 추출물을 거대다공성 흡착 레진 컬럼에 적용하되, 상기 거대다공성 흡착 레진에 대한 생약의 무게 비는 4:1이고, 상기 레진 컬럼은 충전 부피(bed volume) 12배의 물로 세척하여 물 용출액을 얻고, 상기 물 용출액에 염산을 첨가하여 pH 값을 3.0로 조절하고; 상기 산성 용출액을 거대다공성 흡착 레진에 대한 생약의 무게비가 4:1인 거대다공성 흡착 레진 컬럼에 다시 적용하고, 상기 컬럼은 용출액이 거의 무색이 될 때까지 pH 값이 3.0인 염산으로 세척하고; 충전 부피의 4배의 50%-95% 에탄올을 상기 컬럼 세척에 사용하고, 상기 용출액을 농축하여 알코올 냄새가 없는 추출물을 얻고; 상기 거대다공성 흡착 레진은 AB-8이고;
상기 단계 (3)에서, 상기 단계 (2)에서 농축하여 얻은 추출물을 유기 용매에 녹이고, 200-300 메쉬의 크로마토그래피 실리카겔과 혼합하고, 잘 혼합된 상기 시료를 공고하게 충진된 200-300 메쉬의 실리카겔 컬럼에 위치시킨 다음, 상기 컬럼을 클로로포름:메탄올:포름산의 부피 비가 50:10:2인 이동상으로 용출시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 알칼리 수용액은 상기 단계(1)의 물 추출물에 사용되고, 상기 알칼리는 탄산수소 나트륨(sodium bicarbonate), 탄산 나트륨(sodium carbonate), 수산화 나트륨(sodium hydroxide), 탄산수소 칼륨(potassium bicarbonate), 탄산수소 칼륨(potassium carbonate) 및 수산화 칼륨(potassium hydroxide)으로 이루어지는 군으로부터 적어도 하나 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 알칼리 수용액은 탄산수소 나트륨(sodium bicarbonate) 수용액 또는 수산화 나트륨(sodium hydroxide) 수용액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 알칼리 수용액은 0.30%-0.68% 농도의 탄산수소 나트륨(sodium bicarbonate) 수용액 또는 0.0025‰-0.004‰ 농도의 수산화 나트륨(sodium hydroxide) 수용액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 알칼리 수용액은 0.45% 농도의 탄산수소 나트(sodium bicarbonate)륨 수용액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계(1)은 물-추출 전에 알코올-추출을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 알코올-추출은 상기 생약의 부피의 5-8배의 50-95% 에탄올로 2회 달이되, 각각 1-2시간 동안 달이고, 여과하고, 상기 에탄올 추출 용액을 제거하고, 물로 상기 생약 잔사를 추출하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항의 살비아놀릭산 L 및 이의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
심혈관계 질환(cardiovascular disease) 치료용 약물의 제조에 있어서, 제1항의 살비아놀릭산 L의 용도.
제12항에 있어서, 상기 심혈관계 질환(cardiovascular disease)은 저산소증-유도 혈관확장 장애(hypoxia-induced vasodilatation dysfunction), 산소 결핍(oxygen deprivation), 글루코즈 실조(glucose deprivation) 및 과-산화 상태(over-oxidation status)에 의한 체외(in vitro) 신경세포 손상(neuronal injury), 및 심근 경색증(acute myocardial ischemia)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 살비아놀릭산 L의 용도.
자유라디칼 소거 활성을 갖는 약물의 제조에 있어서, 제1항의 살비아놀릭산 L의 용도.
예방적 항-산화작용 활성을 갖는 약물의 제조에 있어서, 제1항의 살비아놀릭산 L의 용도.