KR101250181B1

KR101250181B1 - 감수에서 분리된 테르페노이드 또는 이를 포함하는감수추출물을 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101250181B1
Application number: KR1020060013167A
Authority: KR
Inventors: 유제만; 임문정; 노양국; 오성준; 이현용; 장환봉; 황연하; 이정욱
Original assignee: 동화약품주식회사
Priority date: 2006-02-10
Filing date: 2006-02-10
Publication date: 2013-04-05
Also published as: KR20070081294A

Abstract

본 발명은 감수(Euphorbia kansui) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 감수(Euphorbia kansui)에서 분리되는 화학식 1로 표시되는 화합물 칸수이닌A(kansuinine A), 화학식 2로 표시되는 화합물 γ-유포르볼(γ-euphorbol)을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

<화학식 1>

<화학식 2>

골다공증, 칸수이닌 A, γ-유포르볼, 감수

Description

감수에서 분리된 테르페노이드 또는 이를 포함하는 감수추출물을 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물{composition for preventing and curing osteoporosis comprising two terpenoids, fraction or extract from Euphorbia kansui}

제 1 도는 감수 메탄올추출물을 용매분획 하는 공정을 나타낸 그림이다.

제 2 도는 화학식 1로 표시되는 칸수이닌 A의 결정된 구조를 나타낸 그림이다.

제 3 도는 화학식 1로 표시되는 칸수이닌 A의 HMBC 스펙트럼에서 얻어진 C-H 상관관계를 나타낸 그림이다.

제 4 도는 화학식 2로 표시되는 γ-유포르볼의 결정된 구조를 나타낸 그림이다.

제 5 도는 화학식 2로 표시되는 γ-유포르볼의 HMBC 스펙트럼에서 얻어진 C-H 상관관계를 나타낸 그림이다.

<화학식 1>

<화학식 2>

골다공증(Osteoporosis)은 그 자체보다는 골의 약화에 따라 용이하게 초래되 는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절 또는 척추골절 등에 의해 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없게 하고 결과적으로 노인층 사망원인의 15% 에 이르게 하여 문제가 되고 있는 질환이다.

골조직은 골아세포에 의한 형성과 파골세포에 의한 파괴 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 조직이다. 이러한 골흡수와 형성의 기전에는 아직 불명확한 점이 있으나 골다공증은 골 흡수와 골 형성간의 평형 관계가 파괴되면 골 흡수가 골 형성에 비해 항진되게 되고 골밀도 또는 골량의 감소를 일으키게 됨으로써 골강도가 유지되지 못하게 된 상태인 질환이므로, 이에 따라 골흡수 억제제의 개발이 활발하게 진행되고 있다.

골다공증(Osteoporosis)과 관련하여 과거에는 주로 골의 무기질, 즉 칼슘과 인의 대사 이상만을 중심으로 그 연구가 진행되어 왔으며, 이의 발병기전 규명에는 진전을 보지 못하였다. 그러나 최근에는 골 형성에 중요한 무기물뿐만 아니라 골 기질 단백질의 대사에 대한 연구의 중요성이 새로이 부각되고 있다.

현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 물질로는 비스포스포네이트 제제(알렌드로네이트, 에티드로네이트), 호르몬 제제(랄록시펜), 비타민 D 제제, 칼시토닌 제제, 칼슘 제제 등이 있다. 그러나 비스포스포네이트 제제는 흡수율이 떨어지며 복용방법이 까다롭고 식도염을 유발시키며, 호르몬 제제는 장기간 복용하여야 하며 장기 투여할 경우 유방암, 자궁암, 담석 및 혈전증 등의 부작용이 나타나는 것으로 알려져 있다. 또한 비타민 D 제제는 효과가 확실하지 않고, 칼시토닌 제제는 그 효과가 유의하지 못할 뿐만 아니라 고가이고 투여방법이 어려우며, 칼슘제제는 부작용은 적지만 치료보다는 예방효과에 국한되는 단점이 있다. 따라서 새로운 작용 및 골격구조를 가지면서 부작용이 적고 기존의 골다공증 치료제의 단점을 보완할 수 있는 골다공증 치료제 개발이 절실히 요구되고 있다.

따라서 새로운 작용 및 골격구조를 가지면서 독성 및 부작용이 적은 새로운 골다공증 예방 및 치료에 효과적인 신물질의 개발이 절실히 요구되고 있다. 또한 이러한 새로운 약효를 갖는 물질은 민간요법으로 예부터 적용되어온 천연물에서 발견될 가능성과 확률이 매우 높기 때문에 천연물, 특히 생약으로부터 신약을 창출하려는 시도가 활발히 진행되고 있다.

본 발명에서 사용된 감수는 식물 분류학적으로 대극과(Euphorbiaceae)에 속하는 감수(Euphorbia kansui)의 뿌리를 사용하며 형태는 염주모양의 방추형 또는 긴 타원형으로 길이 3 ~ 9cm, 지름 6 ~ 15mm 이며 간혹 가늘고 길며 구부러진 것도 있다. 바깥 면은 백색 ~ 엷은 황색이고 황색의 잔뿌리와 갈색의 코르크층이 남아 있는 것도 있다.

감수의 활성에 관해서는, 감수(추출물)에 cell-anchoring 억제, 암전이 억 제, 항알러지, 면역억제 효과가 있는 것으로 알려져 있다(일본특허공개공보 제 H08-176002호). 또한, 감수뿌리에서 분리된 유폴(euphol)에 항염증, 항암효과가 있으며(Yasukawa K et al., Inhibitory effect of euphol, a triterpene alcohol from the roots of Euphorbia kansui, on tumour promotion by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin., J Pharm Pharmacol. 2000 Jan; 52(1): 119-24), 감수에서 분리된 인게놀(ingenol)이 대식세포 Fc 수용체 발현에 자극 효과가 있으며(Matsumoto T et al., Stimulatory effects of ingenols from Euphorbia kansui on the expression of macrophage Fc receptor, Planta Med. 1992 Jun; 58(3): 255-8), 감수에서 분리된 칸수이포린 A 및 B에는 항암효과가 있는 것으로 알려져 있다(Wu TS et al., Antitumor agents, 119. Kansuiphorins A and B, two novel antileukemic diterpene esters from Euphorbia kansui., J Nat Prod. 1991 May-Jun; 54(3): 823-9).

또한, 감수에서 분리된 칸수이닌 A에는 항염증, 항암, 항HIV, 치매와 여러 말초신경장애 치료를 위한 효과가 있는 것으로 알려져 있다(일본특허공개공보 제 H15-171349호, 제 H07-165600호, 제 H07-149633호).

한편, 감수에 함유된 대표적인 성분으로는 4환성 트리테르페노이드인 유폴과 그 이성체인 티루칼롤, 알파-유포르볼, 칸수이포린, 칸수이닌, 탄닌질, 유기산 등이 분리 보고 되었는데 이들 성분에 항바이러스, 항염증, 항암, 신경성장인자 작용 효과 등 여러가지 생리활성 및 약리작용이 있음이 알려져 있으나(W.F. Zheng, Z.Cui, and Q. Zhu., Cytotoxicity and Activiral Activity of the Compounds from Euphorbia kansui., Planta Med., 64(1998): 754-756 ), 골다공증에 대하여는 아직 밝혀져 있지 않다.

본 발명의 발명자들은 감수(Euphorbia kansui)의 다양한 생리활성 연구를 수행하던 중, 감수의 용매추출물과 용매분획물에서 파골세포의 골 흡수를 강력하게 억제하는 작용이 있음을 발견하였고, 또한 일련의 용매추출법과 크로마토그래피를 이용하여 활성 분획 추적법(bioassay-directed fractionation)으로 활성물질을 추적하여, 감수에서 상기 본 발명에 따른 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물 칸수이닌 A 및 γ-유포르볼을 분리하였으며, 상기 화합물이 강력한 골흡수 억제작용을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 감수( Euphorbia kansui) 추출물의 신규의 의약적 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 감수( Euphorbia kansui)에서 분리되는 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물의 신규의 의약적 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 감수(Euphorbia kansui) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이며, 또한, 감수에서 분리되는 하기 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

<화학식 1>

<화학식 2>

본 발명은 감수(Euphorbia kansui)를 용매 추출하여 농축한 다음, 계통적 용매 분획 후 각 분획을 실리카겔과 RP-18를 이용하여 칼럼크로마토그래피를 수행하여 상기 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물을 분리 회수하는 방법을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명은 감수를 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 감수 용매 추출물을 얻는다. 이때 추출용매로서 바람직하기로는 메탄올을 사용한다.

또한, 상기 감수 추출물을 농축하여 얻은 농축액을 용매 분획한 다음 칼럼크로마토그래피를 수행하고 재결정하여 상기 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 감수 메탄올추출물 농축액을 물에 현탁하고 헥산을 첨가하여 헥산층을 제거한 다음 수층에 메틸렌클로라이드를 첨가하여 메틸렌클로라이드 분획물을 얻는다. 또한 메틸렌클로라이드 분획물에서 분리되는 수층에 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 용매 분획하여 각 용매 분획물을 얻을 수 있으나, 상기 용매 분획물 중 메틸렌클로라이드 분획물이 가장 높은 활성과 양을 차지하여 다양한 활성물질이 포함되어 있을 것으로 판단된다.

그러므로 본 발명은 메틸렌클로라이드 분획을 선택하여, 실리카겔을 이용한 칼럼크로마토그래피와 중압액체크로마토그래피(MPLC)를 반복 실시하고, 이를 다시 RP-18 오픈 칼럼크로마토그래피(Open Column Chromatography)로 분리·정제하면 고순도의 화합물 칸수이닌 A(kansuinine A) 및 γ-유포르볼(γ-euphorbol)을 얻을 수 있다.

상기와 같은 방법으로 얻은 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 감수 추출물은 각각 또는 서로 혼합한 상태로 통상의 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 배합하여 정제, 캡슐제, 트로키제, 액제 등의 경구투여용 제제; 주사용 액제 또는 주사시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는, 즉시 사용형 주사용 건조 분말 등의 주사용 제제; 에어로졸제, 액제 등의 국소투여용 제제 등의 약제학적 분야에서 통상적인 제제로 제제화 할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 담체로는 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등이 있으며; 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 및 안정화제 등이 있고; 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등이 있다. 또한, 경구 투여 시에는 약제가 위산에 의해 분해되는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나, 정제 등의 경구투여용 고형제제를 장용피로 피복시킨 제제로 제형화하여 투여할 수도 있다.

이렇게 제조된 약제학적 제제는 경구 투여하거나, 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강내 등에 비경구 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 인체 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일에 15 ~ 1500 ㎎ 정도를 투여하되 200 ~ 800 ㎎ 정도를 투여하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 감수 추출물을 단위투여형 약제로 제조할 때 각각의 단위 투여형 제제는 전술한 유효용량 범위를 고려하여 본 발명의 활성물질을 5 ~ 500 ㎎의 함량이 되도록 제조한다. 바람직하게는 감수 추출물의 경우 75 ~ 350 ㎎, 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물의 경우 50 ~ 300 ㎎을 함유하도록 제형화 하는 것이 좋다. 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나, 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있으며, 바람직하기로는 하루에 1회 내지 3회 투여할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물 칸수이닌 A(kansuinine A), γ-유포르볼(γ-euphorbol) 및 감수 추출물이 파골세포의 형성 및 분화과정에 미치는 영향을 알아보기 위하여 파골세포의 분화 억제활성시험법을 확립하여 활성평가에 사용하였다.

상기 방법으로 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물인 칸수이닌 A(kansuinine A), γ-유포르볼(γ-euphorbol), 감수 추출물 및 감수 분획물 각각의 파골세포의 분화 억제능을 평가한 결과 특히 칸수이닌 A, γ-유포르볼, 감수 메탄올추출물, 및 감수 메틸렌클로라이드분획물이 매우 우수한 활성을 나타내었다.

또한, 본 발명의 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물인 칸수이닌 A 및 γ-유포르볼은 세포독성시험 결과 안전한 물질로 판명되었다.

이와 같은 본 발명을 다음의 실시 예에 의해 본 발명을 상세히 설명하겠는 바 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 감수 메탄올 추출물의 제조

감수( Euphorbia kansui) 5㎏을 잘게 썰어 말린 후 냉각기가 달린 추출기를 사용하여 메탄올로 5회 연속 추출하였다. 얻어진 메탄올 추출액을 여과한 후 감압 농축기를 이용하여 45℃ 이하에서 농축하여 감수 메탄올 추출물 350g을 얻었다.

< 실시예 2> 칸수이닌 A 및 γ- 유포르볼의 분리

상기 실시예 1에서 얻어진 감수(Euphorbia Kansui) 메탄올 추출물을 물에 현탁 시킨 후 현탁액을 도 1에 도시한 바와 같이 헥산을 첨가하여 헥산분획물을 제거하고 얻어진 수층에 메틸렌클로라이드를 이용하여 용매 추출하였다. 얻어진 메틸렌클로라이드 분획물을 여과하여 감압 농축한 후, 실리카겔을 사용한 칼럼크로마토그래피를 실시하여 9개로 일차 분획하였고 용출 용매는 농도 구배로 실시하였다(헥산: 메틸렌클로라이드 3 : 1 → 1 : 1 → 헥산: 에틸아세테이트 3 : 1). 이중에서 3번 분획을 중압액체크로마토그래피(Medium Pressure Liquid Chromatography, MPLC)를 사용하여 4개로 2차 분획하였다. 2차 분획으로 얻어진 분획 중 2번 분획을, RP-18 오픈 칼럼크로마토그래피(Open Column Chromatography)를 사용하여 투명한 액상의 칸수이닌 A를 20㎎ 얻었다. 또한 메틸렌클로라이드 분획 9개 중 3번 분 획을 중압액체크로마토그래피(MPLC)를 사용하여 4개로 2차 분획하였다. 2차 분획으로 얻어진 분획 중 1번 분획을, 역시 RP-18 오픈 칼럼크로마토그래피(Open Column Chromatography)를 사용하여 파우더상의 γ-유포르볼을 60㎎ 얻었다.

< 실시예 3> 칸수이닌 A 및 γ- 유포르볼의 구조 결정

상기 실시예 2에서 얻어진 칸수이닌 A와 γ-유포르볼의 구조를 핵자기공명(NMR) 분석법(¹H NMR 400 ㎒; ¹³C NMR 100 ㎒)에 의해 결정하였다.

(1) 칸수이닌 A의 구조결정

¹H NMR 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 각각 측정하였고, 각 피크의 화학적 이동값(chemical shift)을 용매인 메탄올의 화학적 이동값(3.30ppm, 48ppm)에 대한 상대값으로 나타내었다. 결과는 하기 표 1, 표 2에 나타내었다. 하기 표 1은 ¹H NMR 결과를 나타낸 것이며, 표 2는 ¹³C NMR 결과를 나타낸 것이다. 본 발명의 칸수이닌 A의 전체적인 구조는 공지의 칸수이닌 A[참고문헌: Wang LY, Wang NL, Yao XS, Miyata S, Kitanaka S., J. Nat. Prod. 2002 Sep; 65(9): 1246-51]의 분석 결과와 ¹H NMR 및 ¹³C NMR과 2차원 NMR인 ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMQC, ¹H-¹³C HMBC 실험에 의해 결정되었다.

¹³C NMR 스펙트럼을 통해서 126.4ppm ~ 131.3ppm 사이의 signal과 ¹H NMR 스펙트럼의 7 ~ 8ppm의 signal이 나오는 것으로서 방향족환이 존재하는 것을 알 수 있었는데 이 방향족환의 H-2`으로부터 카르보닐카본(δ164.0)으로 HMBC signal이 나타나는 것으로 벤조일기(benzoyl group)가 한개 존재하는 것을 확인 할 수 있었으며 HMBC 스펙트럼에서는 메틸기로부터 168ppm ~ 169ppm 사이의 에스테르기로 signal이 나오는 것으로 아세틸기 5개가 있음을 확인할 수 있었다. 또한 C-14이 4급 탄소임에도 104.8ppm의 저자장에서 peak이 나오는 것으로서 하이드록실기가 존재함을 알 수 있었다. 따라서 이러한 특징적인 구조와 기존 문헌상[참고문헌: Wang LY, Wang NL, Yao XS, Miyata S, Kitanaka S., J. Nat. Prod. 2002 Sep; 65(9): 1246-51]의 NMR 스펙트럼을 비교, 분석하여 보았을 때 이 물질이 칸수이닌 A라는 화합물임을 동정할 수 있었다.

상기와 같은 방법에 의해 얻은 화합물 칸수이닌 A의 구조를 결정하여 도 2에 도시하였으며, 이는 HMQC 및 HMBC에서 관찰된 모든 결과들과 잘 일치하였다. HMBC 스펙트럼으로부터 얻어진 C-H의 관계는 도 3에 도시하였다.

(2) γ-유포르볼의 구조 결정

¹H NMR 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 각각 측정하였고, 각 피크의 화학적 이동값(chemical shift)을 용매인 메탄올의 화학적 이동값(3.30ppm, 48ppm)에 대한 상대값으로 나타내었다. 결과는 하기 표 3, 표 4 에 나타내었다. 하기 표 3은 ¹H NMR 결과를 나타낸 것이며, 표 4는 ¹³C NMR 결과를 나타낸 것이다.

본 발명의 γ-유포르볼의 전체적인 구조는 공지의 γ-유포르볼[참고문헌: MB. Gewali et al., Phytochemistry, 29, 1625, 1990]의 분석 결과와 ¹H NMR 및 ¹³C NMR과 2차원 NMR인 ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMQC, ¹H-¹³C HMBC 실험에 의해 결정되었다.

¹H-NMR 스펙트럼에서 약 0.69ppm ~ 1.00ppm 사이의 5개의 singlet과 1개의 doublet의 형태로 메틸기가 나타나는 것을 확인 할 수 있고 1.60ppm과 1.67ppm에서 아이소펜테닐기(isopentenyl group)의 메틸기 2개를 확인 할 수 있었다. ¹³C NMR을 스펙트럼을 통해서는 14.1ppm ~ 26.5ppm 사이에서 8개의 메틸기 signal이 나오는 것으로서 ¹H-NMR 스펙트럼에 의한 결과를 확인 할 수 있었고 132ppm ~ 133ppm 사이의 signal에 의해서 C-8과 C-9이 이중결합으로 존재하는 것을 알 수 있었다. 또한 C-3(77.52ppm)의 화학적 이동값이 낮은 장에서 나타나는 것으로 하이드록실기가 붙어 있음을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 방법에 의해 얻은 화합물 γ-유포르볼의 구조를 결정하여 도 4에 도시하였으며, 이는 HMQC 및 HMBC에서 관찰된 모든 결과들과 잘 일치하였다. HMBC 스펙트럼으로부터 얻어진 C-H의 관계는 도 5에 도시하였다.

따라서 이러한 특징적인 구조와 기존 문헌상[참고문헌: MB. Gewali et al., Phytochemistry, 29, 1625, 1990]의 NMR 스펙트럼을 비교, 분석하여 보았을 때 이 물질이 γ-유포르볼이라는 화합물임을 동정할 수 있다.

<실험예 1> 파골세포 분화 억제(Anti-Osteoclastgenesis)효과의 측정

본 발명의 감수 메탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 분획물 및 이로부터 분리한 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물의 파골세포의 형성 및 분화과정에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 이들을 조골세포와의 공존배양을 통해 평가하였다.

1-1 : 세포의 준비

가 : 골수세포의 준비

6~8주령 된 수컷 ddY 마우스로부터 무균적으로 경골을 적출하고, 적출한 경골로부터 주사기(21G, 녹십자)를 이용하여 골수세포를 회수하며, α-MEM 배지(Gibco BRL사, 탄산수소나트륨 2.0g/ℓ, 스트렙토마이신 100㎎/ℓ, 페니실린 100,000unit/㎖을 첨가한 후 여과 멸균함) 5㎖에 상기 골수세포를 현탁하고 이를 모아 600 xg에서 5분간 원심분리를 하여 수거하였다. 골수세포내의 적혈구를 제거하기 위해 트리스 염산액 (0.83% NH₄Cl, pH 7.5) 3㎖을 첨가하여 잘 흔든 후, 원심분리를 통해 회수한 골수세포의 유핵 세포수를 확인하고, 공존배양을 위해 바로 사용하였다.

나 : 골아세포의 준비

1 내지 2일령 된 신생 ICR 마우스로부터 전구골과 두정골을 무균적으로 적출하여 인산염완충용액(PBS)으로 씻어준 후, 혼합효소용액(0.2% 콜라게네이즈와 0.1% 디스파제)에 연속적으로 6회 처리하고 조골세포의 특성을 지닌 세포들이 많이 존재하는 3 내지 6회군의 세포를 집중적으로 수집하여 배양액(serum free α-MEM)으로 세척하였다. 세척된 세포들을 10% FBS가 포함된 α-MEM에서 2일 정도 배양한 후 1차 계대 배양하여 모은 세포들을 실험에 사용하였고, 회수한 세포들을 1×10⁶ 세포/㎖의 농도가 되도록 희석하여 -70℃에서 보관하였다.

1-2 : 파골세포의 분화정도 측정

가 : 시료의 준비

본 발명의 감수 메탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 분획물 및 이로부터 분리한 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물은 적절한 용매에 용해하여 각 원하는 농도로 희석하였고, 세포배양액에 들어가는 최종 시료의 부피는 1:1000으로 하였다.

나 : 공존배양을 통한 시료와의 반응

파골세포의 분화를 위해 상기 1-1항에서 준비한 골수세포와 골아세포를 공존배양하였다. FBS가 포함된 α-MEM 배지를 사용하여 96 웰 플레이트에 골수세포 (25,000 cells/㎠)와 골아세포(10,000 cells/㎠)를 분주하여 넣은 후, 실험하고자 하는 시료들을 넣어 7일간 배양하였다. 배양하는 동안 덱사메타손(dexamethasone, 10^-7M)과 비타민 D₃(10^-8M)와 같은 분화인자를 배양 첫날부터 복합 투여하였으며, 2 내지 3일간마다 상기 시료와 분화인자가 혼합된 새로운 배지로 교환하였다. 이때 시료를 넣지 않은 대조군을 같이 실험하였다.

다 : 파골세포의 분화정도 평가

1) TRAP(Tartaric Acid Resistance Alkaline Phosphatase) 염색액의 조제

TRAP 염색액에 양성반응을 가진 파골세포의 특성을 이용하여 성숙한 파골세포를 측정하는 마커(marker)로서 TRAP를 이용하였다.

TRAP 염색액의 조제는 기질 나프톨 AS-MS 포스페이트(sigma N-4875) 5㎎ 및 색소(Fast Red Violet LB salt) 25㎎을 N,N-디메틸포름아마이드(약 0.5㎖)에 녹였다. 50mM 타르타르산을 포함한 0.1N NaHCO₃ 완충액 50㎖(pH 5.0)를 첨가한 후 냉장보관하며 염색액으로 이용하였다.

2) 염색법에 의한 평가

7일간 배양한 세포로부터 배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한 후 10% 포르말린을 포함한 PBS에 세포를 2 내지 5분간 고정하였다. 에탄올과 아세톤의 혼합액(1/1)에 약 1분간 재차 고정한 후 건조하였다. TRAP 염색액을 15분간 처리 후 수세건조하고 현미경하에서 TRAP-양성반응을 보이며 6개 이상의 핵을 가진 파골세포만을 관찰하여 그 수를 세었다.

라. 결과

감수 메탄올 추출물, 감수 메틸렌클로라이드 분획 및 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물의 10^-6g/ml 농도에서의 파골세포 분화 억제 활성을 평가한 결과를 다음 표 5와 표 6에 나타내었다.

표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 감수 메탄올추출물은 control에 비해 약 81%의 활성을 나타내었고, 메틸렌클로라이드 분획물은 65.4% 활성을 각각 나타내어 감수 메탄올 추출물 및 메틸렌클로라이드 분획물에서 파골세포 분화억제 활성을 갖고 있음을 확인할 수 있다.

표 6에 나타낸 바와 같이, 본원발명에 따른 감수에서 분리된 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물 칸수이닌 A 및 γ-유포르볼은 10^-6g/ml의 농도에서 Control에 비해 45.89%, 59.54%의 매우 높은 파골세포 분화 억제 활성이 있다.

이와 같이 본 발명은 감수 추출물과 상기 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물인 칸수이닌 A 및 γ-유포르볼은 모두 파골세포 분화 억제 활성이 우수하여 골다공증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있음을 알 수 있다.

<실험예 2> 세포독성 실험

본 발명의 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물이 독성이 있는지를 in vitro 에서 확인하기 위하여 다음과 같이 세포독성 실험을 하였다.

1. 실험재료 및 방법

실험을 위하여 먼저 골수세포, 골아세포(hFOB1.19) 및 두개관세포(Calvaria)를 준비하였다.

96웰 플레이트에 하나의 웰 당 5000개의 세포 (골수세포의 경우에는 10⁵개의 세포)를 넣고, 여기에 칸수이닌 A 및 γ-유포르볼을 해당 농도 (10^-5, 10^-6 및 10^-7g/㎖) 처리하여 37℃, 5% CO₂조건 하에서 배양하였다. 3일간 배양 후 MTT 용액 (2 ㎎/㎖) 25㎕를 넣고 4시간 더 배양하였다. 4시간 후 배지와 MTT 용액 혼합액을 버리고, (골수세포의 경우 원심분리 하여 세포를 플레이트에 고정시킨 후) DMSO 100㎕를 넣어 발색시킨 후 540㎚의 파장에서 흡광도 차이를 측정하였으며 control군과 비교하여 상대적인 생존률(%)을 계산하고 그 결과를 표 7에 나타내었다.

2. 실험결과

각 세포들의 생존율을 관찰한 결과 대조군에 비해 의미있는 생존율의 감소는 관찰할 수 없었으며 특히 약물의 농도가 10^-6g/㎖에서는 101.7~116.1%로서 생존율의 감소가 전혀 나타나지 않았으므로, 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물은 안전하여 세포독성을 나타내지 않는 것으로 판단된다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 감수( Euphorbia kansui) 추출물이 골 흡수억제능이 우수하므로 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있으며, 또한 감수에서 분리한 화학식 1과 2로 표시되는 화합물인 칸수이닌 A, γ-유포르볼도 골 흡수억제능이 우수하므로 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물.

<화학식 1>

<화학식 2>
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물이 감수(Euphorbia kansui)에서 단리된 것임을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약 학 조성물.
감수(Euphorbia kansui) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물.
감수(Euphorbia kansui)를 메탄올을 추출용매로 하여 추출, 농축시키는 단계;

농축된 추출물을 물로 현탁시킨 후 헥산을 첨가하여 헥산층을 분리시키는 단계;

헥산층을 분리하고 얻어진 수층에 메틸렌클로라이드를 첨가하여 메틸렌클로라이드 분획물을 수득하는 단계; 및

수득된 메틸렌클로라이드 분획물을 크로마토그래피를 이용하여 하기 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물을 분리 정제하는 방법.

<화학식 1>

<화학식 2>
제 4 항에 있어서, 크로마토그래피에 의한 분리는 메틸렌클로라이드 분획물을 실리카겔을 사용한 칼럼크로마토그래피를 이용하여 1차 분획물을 수득하는 단계;

얻어진 1차 분획물을 중압액체크로마토그래피(Medium Pressure Liquid Chromatography, MPLC)를 사용하여 2차 분획물을 수득하는 단계; 및

2차 분획물을 칼럼크로마토그래피를 사용하여 분리함을 특징으로 하는 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물을 분리 정제하는 방법.
제 5 항에 있어서, 실리카겔을 사용한 칼럼크로마토그래피를 이용하여 1차 분획은 용출 용매를 헥산: 메틸렌클로라이드 3 : 1 → 1 : 1 → 헥산: 에틸아세테이트 3 : 1의 농도 구배로 용출시킴을 특징으로 하는 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물을 분리 정제하는 방법.