KR20100124359A

KR20100124359A - 수련 추출분획물에서 분리한 제라닌을 유효성분으로 함유하는 방사선 방호용 조성물

Info

Publication number: KR20100124359A
Application number: KR1020090043313A
Authority: KR
Inventors: 지영흔; 이남호; 신태균; 현진원; 박재우; 박은진; 김민주
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2009-05-19
Filing date: 2009-05-19
Publication date: 2010-11-29
Also published as: KR101100126B1

Abstract

본 발명은 수련 추출분획물에서 분리한 제라닌을 유효성분으로 함유하는 방사선 방호용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제라닌(Geraniin)은, 수련(Nymphaea tetragona)을 분말형태로 제조한 후, 이를 알코올로 추출한 다음 증류수로 현탁시킨 후, 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(Ethyl acetoacetate), 부탄(Butanol), 물(Water)로 용매분획한 다음, 이 용매분획물들 중 에틸아세테이트 분획물을 다시 메틸렌클로라이드(Methylene chloride), 디에틸에테르(Diethyl ether), 에틸아세테이트(Ethyl acetoacetate), 아세톤(acetone)으로 용매분획한 후, 얻어진 디에틸에테르 분획물을 컬럼크로마토그래피로 분획하여 획득하는 것으로 구성된다.

본 발명에 의해, 수련 추출분획물에서 분리되어 뛰어난 방사선 방호효과를 갖는 제라닌(Geraniin)을 유효성분으로 함유하는 방사선 방호용 조성물이 제공된다.

수련, 추출물, 제라닌, 방사선, 방호효과

Description

수련 추출분획물에서 분리한 제라닌을 유효성분으로 함유하는 방사선 방호용 조성물{THE RADIATION RAIOPROTECTIVE COMPOSITION INCLUDED THE GERANIIN ISOLATED NYMPHAEA TETRAGONA EXTRACTION}

1895년 X선이 발견된 이래 산업적으로 사용됨과 함께 질병의 진단 및 종양 치료에 방사선의 사용은 증가 추세를 나타내고 있다.

그와 함께 방사선 피폭 시 일어나는 전신 또는 국소장기의 장해에 대한 관심도가 높아지고 있으며, 이런 부작용을 완화시켜줄 수 있는 방사선 방어물질(radioprotector)에 대한 연구가 요구되어지고 있다.

특히, 면역조혈계와 소화기계 등의 재생 조직은 방사선에 의한 생체 손상에 민감하여 방사선에 의한 급성 장애는 이들 재생조직의 손상에 의해 나타난다.

따라서, 방사선에 의한 부작용을 효과적으로 감소시키기 위해서는 방사선에 의한 재생조직의 손상을 억제시킴과 동시에 손상된 재생 조직의 회복을 증진시키는 것이 필수적이다.

생약과 같은 천연물들은 동아시아와 일부 유럽에서 주로 응용되고 있으며, 동양에서는 한의학의 처방 등에 따라 여러 종류의 약초를 혼합하여 사용하기도 한다.

이와 같은 천연물은 여러 종류의 급, 만성 질병의 치료에 대한 효능은 일부 알려져 있으나 이들의 약리학적 작용 기전 또는 성분이 명확히 밝혀져 있지 않다.

그럼에도 불구하고 각종 질병이나 상해 회복에 효과적이며, 독성이 적어서 특별히 부작용을 나타내지 않는 것으로 알려져 있어 오늘날 독성이 작고 치료효과가 입증된 천연물에 의한 대체요법과 건강식품 개발의 필요성은 증가되고 있으며, 이로 인해 많은 천연물들에 대한 기능과 기전에 대해 아래와 같이 여러 연구가 진행되고 있다.

한국등록특허공보 제10-0791108호(방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물과 그 제조방법)에는, 뛰어난 방사선 방호효과를 나타내는 담팔수 분획농축물을 유효성분으로 포함한 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.

한국등록특허공보 제10-0686251호(감마선 방호용의 트리플로레톨-에이가 함유된 분획물과 그 제조방법)에는, 뛰어난 감마선 방호효과를 갖는 트리프롤레톨-에이가 함유된 분획물에 관한 것이 공개되어 있다.

한국공개특허공보 제10-2004-0050030호(방사선 방호용 조성물)에는, 천궁 추출물 또는 비타민 E를 포함하여 독성이 없고, 부작용이 적어 인체에 안전한 방사선 방호용 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.

상기와 같이 여러 천연물들의 방사선 방호효과에 대한 연구는 이루어지고 있 으나, 수련식물 추출분획물에서 분리한 제라닌에 대한 방사선 방호효능에 관한 연구는 이루어진 적이 없다.

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 수련 추출분획물에서 분리되어 조혈계의 보호 및 회복을 촉진시키고 산화적 세포손상을 억제시킬 뿐만 아니라 면역세포의 증식능을 향상시키며, 위장관계통의 장해나 조혈기 장해에 대한 방어 효과를 갖는 제라닌을 함유하여 뛰어난 방사선 방호효과를 갖는 조성물을 제공하려는 목적이 있다.

본 발명에 대하여 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 수련 추출분획물에서 분리한 제라닌을 유효성분으로 함유하는 방 사선 방호용 조성물에 관한 것이다.

수련 (Nymphaea tetragona var. angusta)은 미나리아재비목 수련과의 여러해살이 물풀로서, 진흙속을 옆으로 기거나 덩이줄기 모양인 큰 뿌리줄기를 가지며, 특히, 꽃이 아름다워 관상용으로 많이 재배하는 식물이다.

또한, 종자와 뿌리줄기는 녹말을 많이 함유하고 있어 식용으로 많이 이용되고 있으며, 뿌리줄기는 누파리딘이라는 알칼로이드를 함유하고 있어 위장약으로 흔히 사용되고 있다.

이러한 수련(Nymphaea tetragona var. angusta)에 대해서 산소 라디칼 소거작용, 항염작용, 혈당강하, MMP-1 발현억제, 크산틴산화효소(xanthine oxidase) 저해작용, 안지오텐신 전환효소(angiotensin 1-converting enzyme, ACE) 억제 작용, 그리고 항응고 작용 등이 연구되어 알려져 있다.

그러나 방사선 방어 효과에 대한 연구는 시행된 바 없어, 수차례 연구한 결과, 본 발명의 발명자들은 수련(Nymphaea tetragona var. angusta) 추출분획물에서 방사선 방어효과를 나타냄을 알 수 있었으며, 이 결과를 토대로 어떤 성분을 통해 방사선 방어효과를 나타내는지 확인한 결과, 제라닌(geraniin) 성분에 의한 것임을 확인하였다.

즉, 제라닌(geraniin)은 세포실험에서 뿐만 아니라 동물실험에서도 방사선에 의해 억제된 비장 조혈 집락 형성을 촉진시켜 조혈계의 보호 및 회복을 촉진시키고 산화적 세포손상을 억제시킬뿐만 아니라 면역세포의 증식능을 향상시킴을 알 수 있었다.

또한, 제라닌(geraniin) 성분은 방사선에 민감한 소장움 세포의 방사선에 대한 저항성을 증가시킨다는 것을 확인하였으며, 이는 제라닌(geraniin)이 방사선 조사로 인한 부작용인 위장관계통의 장해나 조혈기 장해에 대한 방어 효과를 가지는 것임을 알 수 있었다.

이러한 우수한 활성을 갖는 천연식물인 수련의 추출분획물에서 분리한 제라닌(geraniin)을 이용함으로서 합성원료들로 야기되는 알러지 및 부작용, 안전성 및 안정성 면을 해결할 수 있음을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

먼저, 본 발명은 수련(Nymphaea tetragona var. angusta)을 분말형태로 제조한 후, 이를 메탄올 또는 에탄올 중에서 선택되는 어느 하나의 저급알코올로 추출한 다음 증류수로 현탁시킨 후, 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(Ethyl acetoacetate), 부탄(Butanol), 물(Water)로 용매분획한 다음, 이 용매분획물들 중 에틸아세테이트 분획물을 다시 메틸렌클로라이드(Methylene chloride), 디에틸에테르(Diethyl ether), 에틸아세테이트(Ethyl acetoacetate), 아세톤(acetone)으로 용매분획한 후, 얻어진 디에틸에테르 분획물을 컬럼크로마토그래피로 분획하여 분리된 성분인 제라닌(geraniin)을 획득한다.

본 발명은 체계적인 방법으로 상기의 수련 추출분획물에서 분리한 제라닌(geraniin)의 효능을 확인한 결과, 방사선에 대한 중요한 방호기전 중 하나인 항산화활성을 나타내었으며, 이 결과로 인해 방사선에 의한 산화적 세포손상에 대해 방호 효과 및 방사선 장해 경감 효과도 나타낼 것임을 예측하였다.

이에, 본 발명에서는 방사선에 민감한 마우스 비장세포를 이용하였고 또한 마우스를 이용하여 방사선 단독 또는 제라닌(geraniin)을 병행 처리하여 방사선 방어 효과를 연구하여 향후 제라닌(geraniin)의 방사선 방어제로서의 개발에 대한 가능성을 증명하고자 하였다.

그 결과, 비장세포실험에서 제라닌(geraniin)을 고농도의 100 ㎍/ml까지 독성을 나타내지 않았고, 비장세포에서 1.6 ㎍/ml의 농도에서 각각 3.2 배의 세포증식 효과를 보였다.

뿐만 아니라, 단세포 겔 전기영동(Comet assay)을 통해 본 림프구 DNA 손상 억제시험에서 제라닌(geraniin)은 세포에 방사선을 직접 조사시 비장세포의 DNA 손상을 약 40% 이상의 유의성 있는 억제효과를 나타내었고, 방사선 조사 후 방사선표지 분석연구방법( ³H thymidine incorporation assay)으로 본 비장세포 증식효과에서 제라닌(geraniin)은 1.6과 3.1 ㎍/ml의 농도에서 약 2.0배 증가하였다.

또한, 동물실험에서도 제라닌(geraniin)의 투여는 방사선 조사 대조군에 비해 내재성 비장 조혈 집락 형성을 촉진시켰고, 말초혈액 내 림프구와 비장세포의 DNA 손상을 50 % 이상 억제시킴과 함께 림프구의 증식률을 190 % 이상 증가시켰다.

뿐만 아니라, 제라닌(geraniin)은 방사선에 민감한 소장움세포의 세포사멸(apoptosis)을 억제시킴으로써 방사선에 대한 저항성을 증가시킨다는 것을 확인하였다.

이는 제라닌(geraniin)이 방사선 조사로 인한 부작용인 위장관계통의 장해나 조혈기 장해에 대하여 방사선 방어제로서의 임상적 활용 가능성을 가질 것으로 사료된다.

이상과 같이, 본 발명의 수련 추출분획물에서 분리한 제라닌(geraniin)은 방사선 방호효과가 탁월하여 식품첨가제, 음료조성물, 기능성 건강식품, 화장료조성물 등에도 매우 유용하게 이용될 수 있다.

특히, 본 발명의 수련 추출분획물에서 분리한 제라닌은 방사선 방호용 조성물의 유효성분으로 포함하여 사용될 시, 방사선 방호용 조성물 전체중량 대비 0.0001 ~ 10.0 중량 %가 함유되며, 바람직하게는 0.1 ~ 10.0 중량 % 함유되는 것을 특징으로 한다.

상기 제라닌의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 방사선 방호효과가 거의 나타나지 않으며, 10 중량 % 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하면서, 제형상의 안정 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

또한, 약학적 조성물로 이용할 수 있으며, 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의해 제조될 수 있고, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있고, 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 수련 추출분획물에서 분리한 제라닌의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 본 발명의 수련 추출분획물에서 제라닌 분리

수련(Nymphaea tetragona var. angusta)은 한라수목원에서 제공받아 준비하였다.

준비한 수련 뿌리를 음건한 후, 건조시킨 다음, 분쇄하여 수련뿌리분말 2.5 kg을 준비한 후, 이를 70 % 에탄올에 넣고 실온(25 ℃)에서 24 시간동안 교반시킨 다음, 얻은 용액을 여과하였다.

여과하여 걸러진 이 여액을 감압 농축하였으며, 분리된 잔사는 동일한 조건에서 2회 반복 추출하였다.

이 과정을 통해 70 % 에탄올 추출물 250 g을 얻었다.

이 중에서 에탄올 추출물 57.6 g을 증류수 1 ℓ에 현탁시키고 분별 깔대기를 이용해 각각 1 ℓ씩 헥산(n-hexane) 층, 에틸아세테이트(EtOAc) 층, 부탄(n-butanol) 층 및 물(H₂O) 층 4개의 분획층을 얻었다.

상기 얻어진 분획물들 중 에틸아세테이트(EtOAc) 분획층을 셀라이트(celite)로 충진한 컬럼(glass column)을 이용하여 다시 한번 분획하였다.

이때, 용출용매로 메틸렌클로라이드(Methylene chloride, CH₂Cl₂), 디에틸에테르(Diethyl ether, Et₂O), 에틸아세테이트(Ethyl acetoacetate, EtOAc), 아세톤(acetone, Me₂CO)을 각각 사용하여 해당되는 4개의 분획을 얻었다.

얻어진 Et₂O 분획층(9 g)을 사용하여 순상 실리카겔(silica gel) 칼럼 크로마토그라피를 하였으며, 용출용매로는 gradient 조건(Hex/EtOAc→EtOAc/MeOH)을 사용하였다.

이 때, 6개의 분획(NP-I에서 NP-VI)을 얻었다.

이 중 NP-V 분획을 Amberlite XAD-16가 충진된 칼럼 크로마토그라피를 gradient 조건(H₂O/MeOH)에서 수행하여 5개의 분획(NP-V-1에서 NP-V-5)을 얻었다.

얻어진 NP-V-2을 Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그라피를 gradient 조건(H₂O/MeOH)에서 수행하여 제라닌 182 mg을 얻었다.

상기 제라닌의 구조는 도 1에 나타내었다.

상기 제라닌의 구조는 NMR 데이터를 문헌(Hideyuki, K.; Jun, K.; Mutsuo, H. "Geraniin, a Hydrolyzable Tannin from Nymphaea tetragona Georgi(Nymphaeaceae)." Biosci. Biotech. Biochem, 1993, 57, 9, 1570-1571.)과 비교하여 규명하였다.

<실시예 2> 수련 추출물이 함유된 방사선 방호용 조성물의 제조

통상적인 방사선 방호용 조성물에 방사선 방호용 조성물 전체중량대비 상기의 실시예 1의 제라닌 10 중량% 첨가하여 사용하였다.

<실험예 1> 본 발명의 제라닌(geraniin)이 비장세포에서 나타내는 세포독성 효과측정(in vitro)

1. 실험재료

1) 마우스의 비장세포 부유액 준비

7 ~ 10주령 ICR 마우스의 비장을 적출하여 세포 여과기를 통해 단일세포 부유액을 얻었다.

이렇게 얻은 세포는 염화암모늄(ammonium chloride, ACK)용액과 함께 10 분간 실온에서 배양한 뒤 인산완충용액(Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS, Gibco BRL, Paisley, UK)로 씻어내고, 10% 소태아 혈청(Gibco BRL)과 1% 항생제(100U/ml penicillin-streptomycin, Gibco BRL)가 포함된 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL)에 부유시켰다.

2. 실험방법

상기 비장세포에 본 발명인 제라닌(geraniin)에 대한 세포독성을 확인하기 위해 MTT 분석법을 이용하여 비장세포의 생존율에 대하여 측정하였다.

96-well plate에 상기 마우스의 비장세포를 1×10⁵cells/well로 넣고 본 발명인 제라닌(geraniin)을 농도별로 0, 0.8, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, 50 또는 100 ㎍/ml로 처리하였다.

24 시간 배양한 후, MTT용액(5mg/ml)를 각각의 well에 15 ㎕씩 넣고 4시간 배양하였다.

이후 버퍼(solubilzation buffer, pH 4.7) 100 ㎕를 첨가하여 formazan 결정을 녹인 후, 570nm에서 흡광도를 측정하고, 결과는 대조군(0 ㎍/ml)의 OD 값에 대한 비율로 표현하였다.

각 실험결과는 평균값 ± 표준편차로 나타내었고 student t-test를 이용하였고 통계처리한 후 p<0.01 수준에서 유의성을 검정하였다.

3. 실험결과

상기 실험결과는 도 2에 나타내었다.

즉, 25 ㎍/ml에서 100 ㎍/ml까지의 농도에서 본 발명인 실시예 1의 제라닌(Geraniin)은 유의적으로 생존율을 임을 알 수 있었다.

특히, 본 발명인 실시예 1의 제라닌(Geraniin)을 100 ㎍/ml로 처리한 경우, 이를 처리하지 않을 경우에 비해 약 324% 까지 생존율을 증가시켜 고농에서도 비장세포에 대한 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.

<실험예 2> 본 발명의 제라닌(geraniin) 농도에 따른 비장세포 증식효과측정(in vitro)

1. 실험재료

상기 실험예 1과 동일한 재료를 사용하였다.

2. 실험방법

비장세포 부유액에 2 Gy 방사선 조사와 함께 본 발명인 실시예 1의 제라닌(Geraniin)을 0, 0.8, 1.6, 3.1, 6.3 또는 12.5μg/ml로 처리하였다.

각각의 비장세포를 96well plate의 각 well에 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 스트렙토마이신(streptomycin)과 페니실린(penicillin)이 포함되어 있는 RPMI 배지 200ml에 well당 5×10⁵개로 세포를 3배수로 분주하였다.

이후, 36.5℃, 5% CO₂가 있는 배양기(incubator)에서 72시간 배양 후, ³H-thymidine(42 Ci/mmol; Amersham, USA)를 1 μCi/well를 첨가한 후 18시간 후에 유리섬유 여지에 포획하고 건조한 후 방사선 측정기(TriLux, USA)를 이용하여 방사선 동위원소 양을 측정하였다.

각 실험결과는 평균값 ± 표준편차로 나타내었고 student t-test를 이용하였고 통계처리한 후 * p<0.05. **p<0.01 수준에서 유의성을 검정하였다.

3. 실험결과

상기 실험결과, 도 3에 나타내었다.

즉, 정상 대조 세포군에 비해 본 발명인 실시예 1의 제라닌(Geraniin)을 처리한 세포군은 농도 0.8 ㎍/ml부터 12.5 ㎍/ml에서 비장 세포의 증식이 증가하는 경향을 나타내었다.

그 중 제라닌(geraniin)을 처리하지 않은 대조군이 5,542 ± 3,439 cpm인 것에 비해, 본 발명인 실시예 1의 제라닌(Geraniin)을 0.8과 1.6 μg/ml의 농도로 처리할 시, 각각 14,424 ± 2,769 cpm과 17,570 ± 1,161 cpm으로 비장세포의 증식이 약 2.6(p< 0.05)과 3.2배(p< 0.01)까지 유의성 있게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

이 결과로부터 제라닌(geraniin)의 최적 농도 조건을 확인한 후, 제라닌( geraniin)의 농도를 1.6 ㎍/ml으로 하여 다음 실험들을 진행하였다.

<실험예 3> 본 발명의 제라닌(geraniin)이 DNA에 나타내는 손상억제 효과측정(in vitro)

1. 실험재료

상기 실험예 1과 동일하게 준비하였다.

2. 실험방법

비장세포에서 방사선 조사에 의한 손상 시에 본 발명인 실시예 1의 제라닌(Geraniin)이 미치는 영향을 알아보기 위해 비장세포 부유액에 2 Gy 방사선 조사 와 함께 본 발명인 실시예 1의 제라닌(Geraniin, 1.6 μg/ml)를 처리 후 6시간 배양하였다.

이후 비장세포(5×10⁴)를 1000ml의 DPBS로 세척을 한 다음, 0.7% LMPA(Low melting point agarose)와 골고루 섞은 후 1% NMPA(normal melting point agarose)가 코팅되어 있는 슬라이드 위에 75ml을 로딩(loading)하여 4℃ 냉장고에 넣어 굳힌 후 그 위에 다시 0.7% LMPA 용액 75ml를 올려 굳힌 뒤, 용해용액(lysing solution = 2.5 M NaCl, 100mM Na₂-EDTA, 10mM Tris-HCl pH 10, 1% DMSO, 1% Triton X-100, and 1% N-lauroulsarcosinate)에 슬라이드(slide)를 넣고 4℃, 암실에서 1시간 동안 침지시켜 용해시켰다.

그 후 슬라이드를 전기영동장치에 배열하고 4℃ 버퍼(unwinding buffer = 300 mM NaOH, 10 mM Na₂-EDTA pH 8)를 채워 20분 동안 언와이딩(unwinding) 시킨 후 25V/300 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하고, 전기영동이 끝난 슬라이드는 버퍼(neutralization buffer = 0.4 M Tris, pH 7)로 15분씩 세척하였다.

DNA 손상 정도를 분석하기위해 Et-Br(ethidium bromide)로 뉴클레오티드(nucleotide)를 염색하여 형광현미경에서 관찰하고 각각의 세포핵 이미지를 혜성 이미지 분석 프로그램(Comet image analyzing program)인 Komet 5.5 프로그램 (Kinetic Image Co. UK)으로 분석하였다.

DNA 손상정도는 tail DNA%, olive tail movement(mm) 그리고 tail lengh(mm)로 측정하였고 각각의 마우스 당 100개의 세포를 관찰하여 측정하였다.

각 실험결과는 평균값 ± 표준편차로 나타내었고 student t-test를 이용하였고 통계처리한 후 *p<0.05, **p<0.01 수준에서 유의성을 검정하였다.

3. 실험결과

Comet assay는 in vivo와 in vitro system에서 각각의 세포수준에서 DNA 손상을 빠르고 민감하게 감지해 낼 수 있어, 많은 화학적 생물학적 인자에 의한 DNA 손상을 확인할 수 있는 유용한 기법으로 알려져 있다

따라서, 방사선에 의해 유도된 DNA 손상에 대한 본 발명인 실시예 1의 제라닌(Geraniin)의 효과를 평가하기 위해 comet assay를 수행하였다.

그 결과, 도 4과 도 5에 나타내었다.

즉, 비장세포에 감마선 조사한 군에서는 tail DNA %, tail movement 및 tail length가 제라닌(geraniin)을 처리하지 않은 군(IR)에서는 각각 36.5 ± 2.3%, 47.1 ± 4.0 μm 및 221.9 ± 11.9 μm로 크게 증가한 반면, 본 발명인 실시예 1의 제라닌(Geraniin, 1.6 μg/ml) 병행 처리군(IR+geraniin)에서는 21.7 ± 0.1%, 22.2 ± 1.4 μm 및 197.4 ± 5.0 μm로 유의성 있게 감소하여 각각 42.3, 52.9 및 11.0% 억제되었다.

이는 제라닌(geraniin)이 방사선 조사에 의해 생기는 비장세포의 DNA 손상을 효과적으로 억제시키는 효능을 가지고 있다는 것을 의미한다.

<실험예 4> 본 발명의 제라닌(geraniin)이 마우스 비장세포에서 나타내는 세 포증식 효과측정(in vivo)

1. 실험재료

1) 동물처치

본 실험에 이용된 동물은 바이오제노믹스사에서 구입한 15 주령, 24 ~ 30g의 C57BL/6 마우스 (Jackon사, USA)를 사용하였다.

사육 조건은 온도 23 ± 3℃, 습도 50% ± 5%를 맞추어 주었으며, 마우스 전용사료와 음수를 자유급식 하였다.

동물실험에서 본 발명인 실시예 1의 제라닌(Geraniin) 처리군은 방사선 조사 17 시간과 1시간 전에 각각 500 mg/mouse을 각각 복강 내 투여하였고, 대조군은 동량의 PBS를 각각 복강내 투여하였다.

2) 방사선 조사

실험에 공시된 마우스(mouse)는 방풍유리케이스(perspex box, 3 × 3 × 11 cm)에 넣고, 비장세포유액은 15ml 튜브에 넣어 상온에서 0.69Gy/min의 선량률로 ⁶⁰Co 감마선(Theratron-780 teletherapy unit, 방사선응용과학연구소, 제주대학교)을 이용하여 각각 7 Gy와 2 Gy의 선량으로 조사하였다.

2. 실험방법

비장세포에서 본 발명인 실시예 1의 제라닌(Geraniin)이 방사선 조사 후 세 포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해, 비장세포 부유액에 2 Gy 방사선 조사와 함께 본 발명인 실시예 1의 제라닌(Geraniin)을 0, 1.6, 3.1 ㎍/ml로 처리하였다.

각각의 비장세포를 96well plate의 각 well에 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% streptomycin과 penicillin이 포함되어 있는 RPMI 배지 200ml에 well당 5×10⁵개로 세포를 3배수로 분주하였다.

이후, 36.5℃, 5% CO₂가 있는 incubator에서 72시간 배양 후, ³H-thymidine(42 Ci/mmol; Amersham, USA)를 1 μCi/well를 첨가한 후 18시간 후에 유리섬유 여지에 포획하고 건조한 후 방사선 측정기(TriLux, USA)를 이용하여 방사선 동위원소 양을 측정하였다.

3. 실험결과

방사선 조사 후 억제된 비장세포의 증식능에 본 발명인 실시예 1의 제라닌(Geraniin)이 미치는 영향을 확인하기 위해 ³H-thymidine incorporation 실험을 수행하였다.

2Gy 방사선 조사와 함께 본 발명인 실시예 1의 제라닌(Geraniin)를 각각 1.6과 3.1 μg/ml의 농도로 처리한 결과, 도 6과 같이 나타내었다.

즉, 본 발명인 실시예 1의 제라닌 처리군(Geraniin)은 각각 2,053.0 ± 121.6, 1,908.7 ± 589.0 cpm 으로 방사선 조사 대조군(IR)이 1,014.7 ± 121.9 cpm인 것에 비해 유의성 있게 약 2.0, 1.9배 증가를 나타내었다.

이는 제라닌(geraniin)이 비장세포의 손상을 억제를 시킬 뿐만 아니라 비장세포의 증식을 촉진시키는 것으로 사료된다.

<실험예 5> 본 발명의 제라닌(geraniin)이 마우스 말초혈액내 림프구와 비장세포에서 나타내는 DNA 손상억제 효과측정(in vivo)

1. 실험재료

상기 실험예 4와 동일하게 준비하였다.

2. 실험방법

1) DNA 손상억제

방사선 조사 대조군의 말초혈액내 방사선을 조사한 마우스로부터 얻은 비장세포에서도 본 발명인 실시예 1의 제라닌(geraniin)이 미치는 영향을 알아보기 위해 실험군은 각 군당 2마리씩 정상 대조군(Naive)과 방사선 조사 대조군(IR), 본 발명인 실시예 1의 제라닌 병행 투여군(IR + geraniin)으로 구분하였고 방사선 조사하기 17, 1시간 전에 geraniin 병행 투여군에게 각각 500mg/mouse를 복강 내에 투여하였다.

2 Gy 방사선 전신조사 후 24시간에 마우스를 희생시킨 후 비장과 말초혈액을 채취하여 각각 5× 10⁴/㎖의 림프구를 얻었다.

이후 비장세포와 림프구(5×10⁴/group)를 1000ml의 DPBS로 세척을 한 다음, 0.7% Low melting point aparose (LMPA)와 골고루 섞은 후 1% normal melting point agarose (NMPA)가 코팅되어 있는 슬라이드 위에 75ml을 loading하여 4℃ 냉장고에 넣어 굳힌 후 그 위에 다시 0.7% LMPA 용액 75ml를 올려 굳힌 뒤, lysing solution(2.5 M NaCl, 100mM Na₂-EDTA, 10mM Tris-HCl pH 10, 1% DMSO, 1% Triton X-100, and 1% N-lauroulsarcosinate)에 slide를 넣고 4℃, 암실에서 1시간 동안 침지시켜 용해시켰다. 그 후 슬라이드를 전기영동장치에 배열하고 4℃ unwinding buffer(300 mM NaOH, 10 mM Na₂-EDTA pH 8)를 채워 20분 동안 unwinding 시킨 후 25V/300 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하고, 전기영동이 끝난 슬라이드는 neutralization buffer(0.4 M Tris, pH 7)로 15분씩 세척하였다. DNA 손상 정도를 분석하기위해 ethidium bromide로 nucleotide를 염색하여 형광현미경에서 관찰하고 각각의 세포핵 이미지를 Comet image analyzing program인 Komet 5.5 프로그램 (Kinetic Image Co. UK)으로 분석하였다.

2) 말초내 림프구 준비

마우스의 말초혈액을 심장천자를 통해 얻은 다음, 혈액과 PBS를 1:1로 섞고 300ml의 histopaque(Sigma)에 첨가한 뒤, 원심분리(400G, 30분)를 한 후 회색응고덩어리(buffy coat) 부분을 파스테르 피펫을 이용하여 15ml 튜브에 옮겨 담고, PBS로 2번 씻어내어 사용하였다.

3. 실험결과

상기 실험결과, 도 7, 8, 9, 10에 나타내었다.

즉, 방사선 조사 대조군의 말초혈액내 방사선을 조사한 마우스로부터 얻는 림프구의 tail DNA %, tail movement 및 tail length가 각각 30.5 ± 0.1%, 39.3 ± 0.5 μm 및 165.2 ± 5.0 μm로 크게 증가한 반면, geraniin(1.6 μg/ml) 병행 처리군에서는 12.1 ± 3.0%, 13.4 ± 0.8 μm 및 69.7 ± 40.5 μm로 유의성 있게 감소하여 방사선 대조군에 비해 각각 60.3, 65.9 및 57.8% 억제되었다(도 7, 8).

또한, 방사선을 조사한 마우스로부터 얻는 비장세포에서도 방사선 조사 대조군의 Tail DNA %, tail movement 및 tail length가 각각 32.5 ± 2.5%, 44.0 ± 5.6 μm 및 189.7 ± 34.7 μm로 크게 증가한 반면, geraniin(1.6 μg/ml) 병행 처리군에서는 14.8 ± 0.1%, 14.0 ± 1.5 μm 및 90.9 ± 7.1 μm로 유의성 있게 감소하여 각각 54.4, 31.8 및 52.1% 현저히 억제되었다(도 9, 10).

이는 정상 대조군보다는 낮은 값이지만 방사선 조사 대조군에 비해 탁월한 세포 손상 억제 효과를 나타내었다.

이 결과로부터 제라닌(geraniin)은 세포에 직접 추출물을 처리했을 때뿐만 아니라 마우스 복강 내 투여 실험에서도 방사선 조사에 의해 생기는 림프구의 DNA 손상을 억제시키는 것을 알 수 있었다.

<실험예 6> 본 발명의 제라닌(geraniin)이 마우스 비장에 나타내는 조혈촉진효과측정(in vivo)

1. 실험재료

상기 실험예 4와 동일하게 준비하였다.

2. 실험방법

방사선을 마우스의 전신 조사에 의한 조혈기능 억제에 본 발명인 실시예 1의 제라닌(geraniin)이 미치는 영향을 알아보기 위해, 실험군은 각 군당 3마리씩 정상 대조군과 방사선 조사 대조군, geraniin 병행 투여군(500mg/mouse)으로 구분하였고, 방사선 조사하기 17, 1시간 전에 geraniin 병행 투여군에게 각각 500mg/mouse를 복강 내에 투여하였다.

각각실험에 공시된 mouse는 내재성 비장집락형성시험을 위해 7 Gy를 조사하고, 방사선 조사 후 10일 째에 비장을 채취하여 표면에 형성된 조혈 집락을 시각적으로 관찰하여 그 수를 세었다. 각각의 실험은 3회 이상 반복 실시하였다.

각 실험결과는 평균값 ± 표준편차로 나타내었다.

3. 실험결과

상기 실험결과, 도 11에 나타내었다.

즉, 방사선이 조사된 생체에서는 말초혈액 및 말초 림프기관 내의 면역세포수가 급격히 감소되며, 감소된 면역세포의 재생성시 골수내의 조혈모세포가 말초 림프기관으로 이동하여 증식한다.

이때, 비장 내에서는 조혈모세포의 증식에 의한 집락이 형성되며, 방사선 조사 후 비장에서 형성된 집락이 수는 조혈모세포의 방호 및 재생성 능력의 지표로 사용되어지고 있다.

이에, 본 실험에서는 본 발명인 실시예 1의 제라닌(geraniin)이 조혈 촉진에 대한 기여도를 알아보기 위해 방사선 조사 후 10일 째에 비장을 채취하여 표면에 형성된 조혈 집락을 시각적으로 관찰하여 그 수를 세었다.

정상 대조군(naive)에서는 이러한 비장 집락을 관찰할 수 없는 반면 방사선 조사대조군(IR)은 3.75 ± 1.0개로 그 수가 증가하였다.

또한, 본 발명인 실시예 1의 제라닌 병행 투여군(IR+geraniin)은 4.57 ± 1.0개로 방사선 조사 대조군에 비해 다소 증가하였다.

이 결과는 방사선이 조사된 마우스에서 geraniin이 비장집락 수를 방사선 조사 대조군에 비해 약 1.2배 증가시킨 것으로, geraniin이 조혈모세포의 방호와 재생성을 촉진시키는 효과가 있는 것을 알 수 있었다.

<실험예 7> 방사선 조사후 억제된 면역세포에 본 발명의 제라닌(geraniin)이 나타내는 세포증식효과측정(in vivo)

1. 실험재료

상기 실험예 4와 동일하게 준비하였다.

2. 실험방법

상기 실험예 6의 실험 후, 내재성 비장 집락의 형성 경로가를 바탕으로 방사선 조사 후 억제된 면역세포의 증식능에 본 발명인 실시예 1의 제라닌(geraniin)이 미치는 영향을 알아보기 위해, ³H-thymidine incorporation 실험을 수행하였다.

방사선을 전신 조사 후 9일 째 마우스를 희생시켜 비장을 얻었다.

각 실험결과는 평균값 ± 표준편차로 나타내었고 student t-test를 이용하였고 통계처리한 후 *p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.

3. 실험결과

상기 실험결과, 도 12에 나타내었다.

즉, 방사선 조사 후 9일째 얻은 비장세포에서 geraniin 병행 투여군은 7,560 ± 2,188cpm으로 방사선 조사 대조군이 3,927 ± 421cpm에 비해 약 1.9배 증가를 나타내었다.

geraniin 투여는 림프구의 손상을 억제를 시킬 뿐만 아니라 비장세포의 증식을 촉진시키는 것으로 사료된다.

<실험예 8> 본 발명의 제라닌(geraniin)이 동물의 소장움세포에 나타나는 세포사멸 단편(apoptotic fragment) 형성억제 효과측정(in vivo)

1. 실험재료

상기 실험예 4와 동일하게 준비하였다.

2. 실험방법

방사선을 마우스의 전신 조사에 의한 소장움 세포의 사멸(apoptosis)에 본 발명인 실시예 1의 제라닌(geraniin)이 미치는 영향을 알아보기 위해, 실험군은 각 군당 2마리씩 정상 대조군과 방사선 조사 대조군, geraniin 병행 투여군(500mg/mouse)으로 구분하였고, 방사선 조사하기 17, 1시간 전에 geraniin 병행 투여군에게 각각 500mg/mouse를 복강 내에 투여하였다.

방사선 조사 후 24시간에 소장을 채취하고 20% 중성포르말린에 1일 이상 고정시킨 뒤 각 마우스 당 5-6개의 소장편을 통상적인 방법에 따라 조직검사 처리과정을 거쳐 파라핀 포매를 한 후 5㎛ 두께의 절편을 만들어 hematoxylin-eosin 염색을 하였다.

각 소장 절편 당 소장움 50-100개에서의 apoptotic fragment를 광학현미경으로 관찰하여 그 수를 세었다. 각각의 실험은 3회 이상 반복 실시하였다.

각 실험결과는 평균값 ± 표준편차로 나타내었고 student t-test를 이용하였고 통계처리한 후 **p<0.01 수준에서 유의성을 검정하였다.

3. 실험결과

상기 실험결과, 도 13, 14에 나타내었다.

즉, 소장움은 방사선에 민감한 재생 조직으로서, 방사선에 의한 산화적 생체손상을 측정하는 대표적인 지표로 이용되어지고 있으며, 방사선에 대한 생체방호에 있어서 소장움 등의 소화기관 재생조직 손상의 억제 및 회복이 중요한 요건의 하나로 받아들여지고 있다.

방사선 조사 후 24시간에 희생시킨 마우스에서 소장을 채취하였고, 각 마우스 당 5-6개의 소장편을, 그리고 각 소장 절편 당 소장움 50-100개 중 apoptotic cell 수를 세었다.

본 발명인 실시예 1의 제라닌(geraniin) 병행 투여군의 소장에서 한 개의 소장움에서 관찰되는 apoptotic fragments의 수는 각각 6.3 ± 1.1개로, 방사선 조사 대조군에서의 apoptotic cell의 개수 10.0 ± 1.0개에 비해 41%의 소장움의 apoptosis 억제 효과가 유의성 있게 나타났다.

이는 geraniin이 방사선 조사에 의한 림프구 손상뿐만 아니라 소장에서 재생력이 있는 stem cell에 해당하는 소장움 세포의 apoptosis를 억제시켜 방사선 장해에 대한 방호 효과를 나타내었다.

<실험예 9> 본 발명의 제라닌(geraniin)이 동물 소장움세포의 재생효과측정(in vivo)

1. 실험재료

상기 실험예 4와 동일하게 준비하였다.

2. 실험방법

방사선을 마우스의 전신 조사에 의한 소장움 생존에 본 발명인 실시예 1의 제라닌(geraniin)이 미치는 영향을 알아보기 위해, 실험군은 각 군당 2마리씩 정상 대조군과 방사선 조사 대조군, geraniin 병행 투여군(500mg/mouse)으로 구분하였고, 방사선 조사하기 17, 1시간 전에 geraniin 병행 투여군에게 각각 500mg/mouse를 복강 내에 투여하였다.

방사선조사 후 3, 5일에 소장을 채취하고 20% 중성포르말린에 1일 이상 고정시킨 뒤 각 마우스 당 5-6개의 소장편을 통상적인 방법에 따라 조직검사 처리과정을 거쳐 파라핀 포매를 한 후 5㎛ 두께의 절편을 만들어 hematoxylin-eosin 염색을 하였다.

가로절편된 소장표본의 가장자리에 위치하는 소장움의 수를 광학현미경으로 관찰하여 그 수를 세었다. 각각의 실험은 3회 이상 반복 실시하였다.

3. 실험결과

상기 실험결과, 도 15에 나타내었다.

즉, 정상대조군의 소장단면에서의 소장움 수는 평균 119.9 ± 13.2개로 방사선 단독 조사군에서는 106.3 ± 14.6개로 약간 감소하였다.

그리고 geraniin을 병행 투여한 마우스의 평균 소장움 수는 106.6 ± 14.8개로 방사선 조사 대조군에 비해 유의적 차이는 없었다.

그러나 7 Gy 방사선 조사는 소장융모가 짧아지고 서로 융합하는 등 소장점막의 심한 손상을 보였다. 반면 geraniin을 병행 투여한 경우, 방사선 조사에 의한 소장융모의 손상을 줄여 융모의 길이가 확연히 길어진 것을 확인할 수 있었다.

이로써 geraniin이 방사선 조사로 손상된 소장움 재생에는 영향을 미치지 못하지만, 소장 융모의 손상을 억제하여 방사선에 의한 장 장해나 피폭 후 7-10에 생기는 위장관계증후군에 효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 본 발명인 제라닌(geraniin)의 화학구조.

도 2는 본 발명의 제라닌(geraniin)의 비장세포 생존율에 나타낸 그래프.

도 3은 본 발명의 제라닌(geraniin)의 농도별 비장세포 증식효과를 나타낸 그래프.

도 4는 Comet assay를 이용하여 비장세포에서 본 발명의 제라닌(geraniin)이 DNA 손상에 미치는 영향을 나타낸 사진.

A: 정상 대조군 (×400)

B: 방사선 조사 대조군 (×400)

C: 본 발명의 제라닌(geraniin)병행 처리군

도 5는 도 4를 Komet 5.5 시스템을 통해 DNA 손상정도를 나타낸 그래프.

D: Tail DNA % - Naive(A), IR(B), IR+geraniin(C)

E: Olive tail movement - Naive(A), IR(B), IR+geraniin(C)

F: Tail length 평가 - Naive(A), IR(B), IR+geraniin(C)

도 6은 본 발명의 제라닌(geraniin)의 마우스 생체내 비장세포의 증식효과를 나타낸 그래프.

IR : 방사선 조사 대조군

geraniin : 본 발명인 제라닌 처리군

도 7은 본 발명의 제라닌(geraniin)이 마우스 생체내 말초혈액 림프구의 DNA손상에 미치는 영향을 나타낸 사진.

A: 정상 대조군 (×400)

B: 방사선 조사 대조군 (×400)

C: 본 발명의 제라닌(geraniin)병행 처리군

도 8은 도 7을 Komet 5.5 시스템을 통해 DNA 손상정도를 나타낸 그래프.

D: Tail DNA % - Naive(A), IR(B), IR+geraniin(C)

E: Olive tail movement - Naive(A), IR(B), IR+geraniin(C)

F: Tail length 평가 - Naive(A), IR(B), IR+geraniin(C)

도 9는 본 발명의 제라닌(geraniin)의 마우스 생체내 비장세포의 DNA 손상에 미치는 영향을 나타낸 사진.

A: 정상 대조군 (×400)

B: 방사선 조사 대조군 (×400)

C: 본 발명의 제라닌(geraniin)병행 처리군

도 10은 도 9을 Komet 5.5 시스템을 통해 DNA 손상정도를 나타낸 그래프.

D: Tail DNA % - Naive(A), IR(B), IR+geraniin(C)

E: Olive tail movement - Naive(A), IR(B), IR+geraniin(C)

F: Tail length 평가 - Naive(A), IR(B), IR+geraniin(C)

도 11은 본 발명의 제라닌(geraniin)이 내재성 비장집락 형성에 미치는 영향을 나타낸 사진 및 그래프.

A: 내재성 비장 집락형성 사진

Naive: 정상 대조군

IR: 방사선 조사 대조군

IR+geraniin: 본 발명의 제라닌병행 처리군

B: 비장집락 수를 나타낸 그래프.

Naive: 정상 대조군

IR: 방사선 조사 대조군

IR+geraniin: 본 발명의 제라닌병행 처리군

도 12는 본 발명의 제라닌(geraniin)에 의한 T 세포 증식 반응을 나타낸 그래프.

Naive: 정상 대조군

IR: 방사선 조사 대조군

IR+geraniin: 본 발명의 제라닌병행 처리군

도 13은 소장움에서 본 발명의 제라닌(geraniin)의 세포사멸 단편(apoptotic fragment)의 빈도를 나타낸 사진.

A: 방사선 조사 대조군,

B: 본 발명의 제라닌병행 처리군

도 14는 도 13의 세포사멸 단편(apoptotic fragment)의 개수를 나타낸 그래프화.

Naive: 정상 대조군

IR: 방사선 조사 대조군

IR+geraniin: 본 발명의 제라닌병행 처리군

도 15는 소장단면에서 본 발명의 제라닌(geraniin)의 소장융모길이를 나타낸 사진.

A(Naive) : 정상 대조군

B(IR) : 방사선 조사 대조군

C(IR+geraniin) : 본 발명의 제라닌병행 처리군

Claims

제라닌(Geraniin)을 유효성분으로 함유하는 방사선 방호용 조성물.
제1항에 있어서,

제라닌(Geraniin)은 수련(Nymphaea tetragona var. angusta) 추출분획물에서 분리한 성분인 것을 특징으로 하는,

방사선 방호용 조성물.
제1항에 있어서,

상기 유효성분은 조성물의 총 중량대비 0.0001 ~ 10.0 중량 %로 포함되는 것을 특징으로 하는,

방사선 방호용 조성물.
제1항에 있어서,

상기 제라닌은 조혈계의 보호 및 회복을 촉진시키고, 산화적 세포손상을 억제시키며, 면역세포의 증식능을 향상시키며, 위장관계통의 장해나 조혈기 장해에 대한 방어 효과를 갖는 것을 특징으로 하는,

방사선 방호용 조성물.
제1항에 있어서,

제라닌은, 수련(Nymphaea tetragona var. angusta)을 분말형태로 제조한 후, 이를 알코올로 추출한 다음 증류수로 현탁시킨 후, 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(Ethyl acetoacetate), 부탄(Butanol), 물(Water)로 용매분획한 다음, 이 용매분획물들 중 에틸아세테이트 분획물을 다시 메틸렌클로라이드(Methylene chloride), 디에틸에테르(Diethyl ether), 에틸아세테이트(Ethyl acetoacetate), 아세톤(acetone)으로 용매분획한 후, 얻어진 디에틸에테르 분획물을 컬럼크로마토그래피로 분획하여 분리된 성분인 것을 특징으로 하는,

방사선 방호용 조성물.
제5항에 있어서,

상기 수련을 추출할 시, 메탄올 또는 에탄올 중에서 선택되는 어느 하나의 저급알코올로 추출하는 것을 특징으로 하는,

방사선 방호용 조성물.