KR100791108B1

KR100791108B1 - 방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물과 그 제조방법

Info

Publication number: KR100791108B1
Application number: KR1020060108652A
Authority: KR
Inventors: 이남호; 지영흔; 박은진; 백종석; 박재우; 신태균; 현진원; 주홍구
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2006-11-06
Filing date: 2006-11-06
Publication date: 2008-01-03

Abstract

본 발명은 방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물과 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물의 제조방법은, 담팔수의 가지를 음건한 다음, 세절하여 담팔수세절물을 준비한 후, 준비된 담팔수세절물을 70 % 에탄올에 침지시킨 후, 여과하여 에탄올추출물을 제조하고, 이를 농축시켜 농축액을 제조한 다음, 농축액에 증류수를 넣고 현탁시켜 현탁액을 제조한 후, 제조된 현탁액에 헥산을 넣고 교반한 다음, 분별깔대기로 헥산층을 분리하여 제거하고 남은 물층을 획득한 후, 물층에 에틸아세테이트를 넣고 교반시킨 다음, 분별깔대기를 이용하여 에틸아세테이트층을 분리한 후 이를 농축시켜 에틸아세테이트 농축액을 제조한 다음, 에틸아세테이트 농축액을 셀라이트와 혼한합 후, 칼럼에 충진한 다음, 전개용매로 에틸아세테이트를 사용하여 에틸아세테이트 분획물을 수득한 후, 이를 농축하여 담팔수 분획농축물을 제조하는 것으로 구성된다.

본 발명에 의해, 뛰어난 방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물과 그 제조방법이 제공된다.

방사선, 방호효과, 담팔수, 분획농축물, 탄닌

Description

방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물과 그 제조방법{ELAEOCARPUS SYLVESTRIS FRACTIONS HAVING RADIATION RAIOPROTECTIVE EFFECT AND THE PREPARATION METHOD OF THEREOF}

도 1은 PGG(1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-β-D-glucose)의 분리 과정도.

도 2는 PGG(1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-β-D-glucose)의 화학구조.

도 3은 Comet assay를 이용한 림프구에서 본 발명의 담팔수 분획농축물이 DNA 손상억제에 미치는 영향을 나타내는 사진 및 그래프.

A: 정상 대조군 (×400)

B: 방사선 조사 대조군 (×400)

C: 본 발명의 담팔수 분획농축물 병행 투여군

D: Komet 5 시스템을 이용한 세포의 Tail DNA % 평가를 나타낸 그래프.

도 4는 DAPI 염색을 통해 본 발명의 담팔수 분획농축물이 림프구의 apoptosis에 미치는 영향을 나타내는 사진 및 그래프.

A: 방사선 조사 대조군 (×272)

B: 본 발명의 담팔수 분획농축물 병행 투여군 (×272)

C: 방사선 조사 대조군과 담팔수 분획농축물 병행 투여군의 apoptotic fragments % 비교를 나타낸 그래프 (평균값 ± 표준편차, * p < 0.05).

도 5는 본 발명의 담팔수 분획농축물에 의한 T 세포 증식 반응을 나타내는 그래프.

A: 방사선 조사 후 3 일째 적출한 비장의 림프구를 이용한 림프구의 증식 반응 그래프 (평균값 ± 표준편차, * p < 0.05).

B: 방사선 조사 후 9 일째 적출한 비장의 림프구를 이용한 림프구의 증식 반응 그래프 (평균값 ± 표준편차, * p < 0.05).

도 6은 H&E 염색을 통해 소장움세포에서 apoptotic fragments의 형태학적 비교를 나타낸 사진 및 그래프.

A: 방사선 조사 대조군 (×272)

B: 본 발명의 담팔수 분획농축물 병행 투여군 (×272)

C: 방사선 조사 대조군과 본 발명의 담팔수 분획농축물 병행 투여군의 소장움세포 당 apoptotic fragments 개수의 비교를 나타낸 그래프 (평균값 ± 표준편차, * p < 0.05).

방사선에 의한 장해는 피폭된 선량에 따라 다르게 나타난다.

즉, 초고선량(100 ~ 300 Gy)피폭 시에는 중추신경계 장해로 인하여 수시간 내지 1 ~ 2 일 안에 대부분 사망하게 되고, 고선량(10 ~ 30 Gy)피폭 시에는 위장관장해(위장관 점막손상)로 1 ~ 2 주 안에 많은 수가 사망하게 되며, 중간선량(4 ~ 8 Gy)피폭 시에는 골수장해로 조혈 및 면역기능 지하를 초래하게 되어 30 일 안에 일부가 사망하게 되고, 저선량(1 ~ 2 Gy)피폭 시에는 저선량장해가 만성적으로 나타나게 된다.

현재 이러한 방사선에 의한 장해를 방호하기 위해서 독성이 없고, 부작용이 적어 인체에 안전한 방사선 방호용 조성물에 대한 연구가 많이 이루어지고 있는 실정이다.

한국공개특허공보 제10-2004-0050030호(방사선 방호용 조성물)에는, 천궁 추출물 또는 비타민 E를 포함하여 독성이 없고, 부작용이 적어 인체에 안전한 방사선 방호용 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.

상기와 같은 발명은, 방사선 방호용 조성물로 생약재를 이용하여 연구하였으나, 방사선에 의한 장해는 피폭된 선량에 의해 다르는데 중간선량(6 Gy) 피폭시 나타내는 방사선 방호효과 실험밖에 없으며, 그 효능이 미흡하다.

한국등록특허공보 제10-0401955호(면역, 조혈기능 증진 및 방사선 방호용 생약조성물 및 그의 제조방법)에는, 당귀, 천궁 및 작약을 동일 무게 비율로 혼합하고, 열탕 추출하여 제조한 생약조성물에 관한 것이 공개되어 있다.

상기와 같은 발명은, 여러 생약재를 이용하여 우수한 방사선 방호용 조성물 제조에 관한 연구는 이루어지고 있으나, 조성물이 어떠한 유효성분으로 인하여 방사선 방호효과를 나타내는지 알 수 없으며, 고가의 여러 생약재를 이용하는 것으로 비용면에서 적합하지 않으며, 담팔수 식물을 이용한 방사선 방호효능에 대한 연구는 이루어진 적이 없다.

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 뛰어난 방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물과 그 제조방법을 제공하려는 목적이 있다.

본 발명의 방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물의 제조방법은, 담팔수의 가지를 음건한 다음, 세절하여 담팔수세절물을 준비하는 제1공정, 준비된 담팔수세절물을 70 % 에탄올에 침지시킨 후, 감압여과장치로 여과하여 에탄올추출물을 제조하는 제2공정, 에탄올추출물을 감압농축시켜 농축액을 제조하는 제3공정, 농축액에 증류수를 넣고 현탁시켜 현탁액을 제조한 후, 현탁액 1 ℓ 당 헥산 0.5 ~ 2 ℓ를 제조된 현탁액에 넣고 교반한 다음, 분별깔대기로 헥산층을 분리하여 제거하고 남은 물층을 획득하는 제4공정, 물층 1 ℓ 당 에틸아세테이트 0.5 ~ 2 ℓ를 획득한 물층에 넣고 교반한 후, 분별깔대기를 이용하여 에틸아세테이트층을 분리하는 제5공정, 에틸아세테이트층을 감압농축시켜 에틸아세테이트 농축액을 제조하는 제6공정, 에틸아세테이트 농축액을 셀라이트와 혼합한 후, 칼럼에 충진한 다음, 전개용매로 에틸아세테이트를 사용하여 에틸아세테이트 분획물을 수득한 후, 이를 농축하여 본 발명인 담팔수 분획농축물을 제조하는 제7공정으로 구성된다.

본 발명에서 이용한 주재료인 담팔수(Elaeocarpus sylvestris var. ellipticus)는 아욱목 담팔수과에 속하는 식물로서, 중국 남부, 대만, 일본에도 분포하며, 우리나라에서는 제주도 서귀포지역에 주로 분포되어 있다.

담팔수는 상록교목으로서, 목재는 주로 가구재로, 껍질은 염료재로 이용되며, 열매는 식용으로 사용되어 왔으며, 한방에서는 뿌리 껍질을 산두영이라는 약염료재로 쓰는데 타박상으로 멍이 들고 부었을 때 주로 사용한다.

담팔수의 화학성분에 관한 연구로는 갈릭산의 배당체인 ellagitannin, elaeocarpusin 등이 보고되었으나, 다른 성분에 관한 연구는 보고되어진 바 없다.

본 발명에서는 이러한 담팔수를 이용하여 여러가지 연구를 한 결과, 담팔수의 가지부분을 에탄올로 추출하여 에탄올추출물을 제조하고, 여기에 헥산을 넣고 교반한 후 분별깔대기로 헥산층을 분리하여 제거하고 남은 물층에 에틸아세테이트를 넣고 교반한 후 다시 분별깔대기로 에틸아세테이트층을 분리한 후, 이를 컬럼에 충진한 다음, 전개용매로 에틸아세테이르를 사용하여 에틸아세테이트 분획물을 수득한 다음, 농축하여 담팔수 분획농축물을 제조할 시, 방사선 방호효과가 높게 나타남을 알 수 있었다.

구체적인 실험을 통해, 본 발명에 의해 제조된 담팔수 분획농축물에서 방사선 방호효과를 나타내는 성분이 탄닌성분(도 2)이며, 이로 인하여 뛰어난 방사선 방호효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

탄닌(Tannin)은 여러 종류의 나무 껍질이나 열매에 주로 함유되어 있는 화학성분으로써 주로 천연 항산화제로 많이 쓰이는 성분으로 알려져 있다.

이하, 본 발명의 방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물의 제조공정에 대해 상세히 설명하면 다음과 같다.

<방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물의 제조공정>

1.제1공정 : 담팔수세절물 준비

담팔수(Elaeocarpus sylvestris var. elipticus)의 가지를 음건한 다음, 세절하여 담팔수세절물을 준비한다.

2.제2공정 : 에탄올추출물 제조

준비된 담팔수세절물을 70 % 에탄올에 침지시켜, 감압여과장치로 여과하여 에탄올추출물을 제조한다.

이때, 20 ~ 24 시간동안 20 ~ 25℃에서 침지시키는 것이 바람직하다.

3.제3공정 : 농축액 제조

상기 에탄올추출물을 감압농축시켜 농축액을 제조한다.

4.제4공정 : 물층 획득

상기 농축액의 2 ~ 4 배의 증류수를 제조된 농축액에 넣고 현탁시켜 현탁액 을 제조한 후, 현탁액 1 ℓ 당 헥산 0.5 ~ 2 ℓ를 현탁액에 넣고 교반한 다음, 분별깔대기로 헥산층을 분리하여 제거하고 남은 물층을 획득한다.

5.제5공정 : 에틸아세테이트층 분리

물층 1 ℓ 당 에틸아세테이트 0.5 ~ 2 ℓ를 획득한 물층에 넣고 교반한 다음, 분별깔대기를 이용하여 상층액은 제거하고 남은 에틸아세테이트층을 분리한다.

6.제6공정 : 에틸아세테이트 농축액 제조

에틸아세테이트층을 감압농축시켜 에틸아세테이트 농축액을 제조한다.

7.제7공정 : 담팔수 분획농축물 제조

에틸아세테이트 농축액을 셀라이트와 혼합한 후, 칼럼에 충진한 다음, 전개용매로 에틸아세테이트를 사용하여 에틸아세테이트 분획물을 수득한 후, 이를 농축하여 담팔수 분획농축물을 제조한다.

이하, 본 발명의 방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물의 제조방법에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

그러나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 본 발명의 방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물 제조1

한라산에서 서식하는 담팔수의 가지를 채집한 후, 이를 음건한 다음, 세절하여 담팔수세절물을 준비하였다.

준비된 담팔수세절물 300 g을 70 % 에탄올 6 ℓ에 20 ℃에서 24 시간동안 침지시킨 후, 감압여과장치로 여과하여 에탄올추출물을 제조하고 이를 감압농축시켜 농축액을 제조하였다.

제조된 농축액 32 g에 증류수 1 ℓ를 넣고 현탁시켜 현탁액을 제조한 후, 현탁액 1 ℓ에 헥산 1 ℓ를 넣고 교반한 다음, 분별깔대기로 헥산층을 분리한 후 제거하고 남은 물층을 획득하였다.

상기 획득한 물층 1 ℓ에 에틸아세테이트 1 ℓ를 넣고 교반시킨 후, 분별깔대기를 이용하여 상층액은 제거하고 에틸아세테이트층을 분리한 다음, 이를 감압농축시켜 에틸아세테이트 농축액 4.8 g을 제조하였다.

이렇게 제조된 에틸아세테이트 농축액 4.8 g과 셀라이트 480 g을 혼합한 후, 칼럼에 충진한 다음, 전개용매로 에틸아세테이트를 사용하여 에틸아세테이트 분획물을 수득한 후, 이를 농축하여 본 발명의 담팔수 분획농축물 3.8 g을 제조하였다.

<실시예 2> 본 발명의 방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물 제조2

실시예 1과 같은 방법으로 제조하되, 담팔수세절물 300 g을 70 % 에탄올 6 ℓ에 24 ℃에서 20 시간동안 침지시킨 후, 감압여과장치로 여과하여 에탄올추출물을 제조하였다.

이하, 실시예 1과 같은 방법으로 하여 본 발명의 담팔수 분획농축물 3.8 g을 제조하였다.

<실험예 1> 본 발명의 담팔수 분획농축물이 함유하는 탄닌 성분의 분리 및 동정

1. 실험방법

동정은 한라산연구소에 의뢰하였으며, 실시예 1에서 제조된 담팔수 분획농축물이 함유하는 성분을 분리하기 위해, 도 1에 나타나 있듯이, 실리카겔 컬럼에 흡착시킨 후 순차적으로 용리액 (Hex → EtOAc → MeOH)을 통과시켜 각 11개의 분획을 얻었다.

그 중 Fr-8 (823.7 mg)을 CH₂C_l2와 60 % MeOH로 분액하여 다시 2개의 분획을 얻은 후 Fr-8-2를 MeOH을 용리액으로 사용하여 sephadex컬럼을 하여 7개의 분획을 얻었고, 그 중 Fr-8-2-6분획을 CHCl₃/MeOH를 사용하여 재결정한 후 prep-HPLC (30 % MeOH → 60 % MeOH → 100 % MeOH)을 통하여 PGG(1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-β-D-glucose) 5 mg을 얻었다.

2. 실험결과

상기 PGG의 성분을 규명하기 위해 ¹H NMR로 확인한 결과, 아래와 같은 데이터로 나타났으며, PGG 화학구조는 도 2에 나타내었다.

<PGG(1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-β-D-glucose)의 NMR 데이터 측정결과>

¹H NMR (CD₃OD, 400MHz)

δ 7.10, 7.04, 6.97, 6.94, 6.89 (each 2H, s, galloyl-H), 6.23 (1H, d, J = 8.32Hz, Glc H-1), 5.89 (1H, t, J = 9.76Hz, Glc H-3), 5.61 (1H, t, J = 9.76, Glc H-4) 5.58 (1H, dd, J = 9.76, 8.32, Glc H-2), 4.51 (1H, m), 4.38 (2H, m)

¹³C NMR (CD₃OD, 100MHz)

δ 167.9, 167.3, 167, 166.9, 166.2 (C=O), 146.6, 146.5, 146.4, 146.4, 146.2 (galloyl C-3, 5), 140.8, 140.4, 140.3, 140.2, 140 (galloyl C-4), 121.1, 120.4, 120.2, 120.2, 119.7 (galloyl C-1), 110.6, 110.5, 110.4, 110.4, 110.3 (galloyl C-2, 6), 93.8 (glucose C-1), 74.4 (glucose C-5), 74.1 (glucose C-3), 72.2 (glucose C-2), 69.8 (glucose C-4), 63.1 (glucose C-6)

상기 결과에 나타나 있듯이, galloyl tannin에서 나타나는 방향족 ¹H 피크가 다량 검출됨으로서, 탄닌 성분이 주성분임을 알 수 있었다.

계속된 화학성분의 규명을 통하여 PGG 성분이 규명되었으며, 담팔수에서 PGG성분이 규명된 건 처음이었다.

<실험예 2> 고선량의 방사선을 조사한 동물에서의 생존률 증가 효과 측정

1. 실험방법

1) 동물 처치

본 실험에 이용된 동물은 바이오제노믹스사에서 구입한 15 주령, 24 ~ 30 g의 C57BL/6 마우스 (Jackon사, USA)를 사용하였다.

사육 조건은 온도 23 ± 3 ℃, 습도 50 % ± 5를 맞추어 주었으며, 마우스 전용사료와 음수를 자유급식 하였다.

생존율 검사 시험을 위해 ⁶⁰Co 조사기 (Theratron-780 teletherapy unit, 방사선응용과학연구소, 제주대학교)를 이용하여 0.69 Gy/min의 선량률로 9 Gy의 선량으로 마우스에 전신 조사하였다.

본 발명인 실시예 1에서 제조된 담팔수 분획농축물은 방사선 조사 1일 전과 방사선 조사 후 0, 3, 6, 9, 15일에 각각 500 ㎍/mouse씩 복강내 투여하였다.

2) 방사선 조사

실험에 공시된 mouse는 생존률 시험을 위해 perspex box (3 × 3 × 11 cm)에 넣어 ⁶⁰Co 감마선(Theratron-780 teletherapy unit, 방사선응용과학연구소, 제주대학교)을 조사한 마우스의 전군이 모두 사망하는 선량인 9 Gy를 1회 전신 조사하였다.

3) 생존률 검사 시험

실험군은 C57BL/7 마우스를 정상대조군과 방사선 조사 대조군과 담팔수 분획농축물 병행 투여군으로 각각 구분하였고, 9 Gy의 방사선 전신 조사 후 생존한 마우스의 수를 30 일까지 관찰하였다.

4) 통계처리

각 실험결과는 평균값 ± 표준편차로 나타내었고 student t-test를 이용하였고 통계처리한 후 p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과를 아래의 표 1에 나타냈다.

<표 1> 9Gy를 조사한 마우스에서 생존률에 미치는 영향 평가

	생존률 (%)	평균 생존기간 (일)
9Gy IR (n=9)	33.3	19.9 ± 8.1
9Gy IR + 담팔수 분획농축물 처리 (n=6)	66.7	22.7 ± 11.4 *

*; 30일 경과 후 생존한 마우스에 대해서는 안락사를 유도하였다.

상기 표 1에 나타나 있듯이, 9 Gy의 고선량의 방사선을 조사한 마우스에 있어서, 본 발명인 담팔수 분획농축물의 병행 투여군은 66.7 %의 생존률로 방사선 조사 대조군에서의 생존률인 33.3 %에 비하여 현저히 마우스의 생존률을 증가시켰다.

또한, 생존기간도 방사선 대조군의 19.9일에 비해 22.7일로 연장됨을 관찰할 수 있었다.

이와 같은 결과에 따라 본 발명인 담팔수 분획농축물의 투여는 고선량의 방사선 조사에서도 그 효과를 나타내어 생존률의 증가와 함께 생존기간의 연장을 유도함을 알 수 있었다.

<실험예 3> 림프구에서의 DNA 손상억제 측정

1. 실험방법

1) 동물 처치

본 실험에 이용된 동물은 바이오제노믹스사에서 구입한 15 주령, 24 ~ 30g의 C57BL/6 마우스 (Jackon사, USA)를 사용하였다.

사육 조건은 온도 23 ± 3℃, 습도 50% ± 5%를 맞추어 주었으며, 마우스 전용사료와 음수를 자유급식 하였다.

2Gy를 1.5Gy/min 선량률로 전신 조사하였고, 본 발명인 실시예 1에서 제조된 담팔수 분획농축물(200 ㎍/mouse)은 방사선 조사 1일 전과 방사선 조사 당일에 각각 복강내 투여되었다.

2) 방사선 조사

실험에 공시된 mouse는 perspex box (3 × 3 × 11 cm)에 넣어 ⁶⁰Co 감마선(Theratron-780 teletherapy unit, 방사선응용과학연구소, 제주대학교)을 조사한 마우스의 전군이 모두 사망하는 선량인 2 Gy를 1회 전신 조사하였다.

3) 림프구에서의 Comet assay를 이용한 DNA 손상억제 측정법

실험군은 각 군당 2 마리씩 정상 대조군과 방사선 조사 대조군, 본 발명인 담팔수 분획농축물의 병행 투여군으로 구분하였고 방사선 전신조사 후 72 시간에 마우스를 희생시킨 후 비장을 채취하여 각각 5× 10⁴/㎖의 림프구를 얻었다.

이렇게 얻은 세포를 1000 ㎕의 DPBS에 세척을 한 다음, 0.7 % Low melting point aparose (LMPA)와 골고루 섞은 후 1 % normal melting point agarose (NMPA)가 코팅되어 있는 슬라이드 위에 75 ㎕을 loading 하여 4 ℃ 냉장고에 넣어 굳힌 후 그 위에 다시 0.7 % LMPA 용액 75 ㎕를 올려 굳힌 뒤, lysing solution (2.5 M NaCl, 100 mM Na₂-EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 10, 1% DMSO, 1% Triton X-100, and 1% N-lauroulsarcosinate)에 slide를 넣고 4 ℃, 암실에서 1 시간 동안 침지시켜 용해시켰다.

그 후 슬라이드를 전기영동장치에 배열하고 4 ℃ unwinding buffer (300 mM NaOH, 10 mM Na₂-EDTA pH8)를 채워 20 분 동안 unwinding 시킨 후 25V/300 mA의 전압을 걸어 20 분간 전기영동을 실시하고, 전기영동이 끝난 슬라이드는 neutralization buffer (0.4 M Tris, pH 7)로 15 분씩 세척하였다.

DNA 손상 정도를 분석하기위해 ethidium bromide로 nucleotide를 염색하여 형광현미경에서 관찰하고 각각의 세포핵 이미지를 Comet image analyzing program인 Komet 5 프로그램 (Kinetic Image Co. UK)으로 분석하였다.

DNA 손상정도는 tail DNA %로 측정하였고 각각의 마우스당 50 개의 세포를 관찰하여 측정하였다.

4) 통계처리

2. 실험결과

상기 실험결과, 도 3와 아래의 표 2에 나타내었다.

<표 2> Comet assay를 이용한 림프구에서 담팔수가 DNA 손상에 미치는 영향 평가

	Tail DNA % (Means ± SE)	Inhibition activity(%)
0Gy IR	9.77 ± 5.36	76.63
2Gy IR	41.82 ± 10.19	0
2Gy IR + 담팔수 처치	16.13 ± 6.18	61.43*

*; p < 0.05

방사선 조사 대조군의 Tail DNA %가 41.82 %인 것에 비해 본 발명인 담팔수 분획농축물의 병행 투여군은 16.13 %로써 방사선 조사에 의한 림프구 DNA 손상을 61.43 %로 현저히 억제시켰다(표 2, 도 3).

이는 정상 대조군보다는 낮은 수치이지만, 방사선 조사 대조군에 비해 월등한 세포 손상 억제 효과를 나타내었다.

이 결과로 보아 본 발명인 담팔수 분획농축물은 방사선 조사에 의해 생기는 림프구의 DNA 손상을 억제시키는 것으로 사료된다.

<실험예 4> 림프구에서의 apoptotic cell 빈도 확인

1. 실험방법

1) 동물 처치

사육 조건은 온도 23 ± 3 ℃, 습도 50 ± 5 %를 맞추어 주었으며, 마우스 전용사료와 음수를 자유급식 하였다.

2 Gy를 1.5 Gy/min 선량률로 전신 조사하였고, 본 발명인 실시예 1에서 제조된 담팔수 분획농축물(200 ㎍/mouse)은 방사선 조사 1일 전과 방사선 조사 당일에 각각 복강내 투여되었다.

2) 방사선 조사

3) DAPI staining

실험군은 각 군당 2마리로 정상 대조군과 방사선 조사 대조군, 본 발명인 담팔수 분획농축물의 병행 투여군으로 구분하였다.

방사선 전신 조사 후 24시간에 비장을 채취하여 림프구를 얻은 후 1 × 10⁶의 세포를 DPBS (pH 7.4) 1 ㎖에 세척한 후 Carnoy's fixative solution에 고정시켰다.

슬라이드에 고정액과 현탁된 세포 20 ㎕를 떨어뜨린 후 건조시키고 1:300으로 희석한 DAPI (4‘6-Diamidio-2-phenylindole, dihydrochloride)를 암실에서 10분 처리 후 PBS (pH 7.4)에 5 분간 세척하였다.

각각의 슬라이드는 형광현미경을 통해 마우스 당 500개의 세포 중 apoptotic cell의 개수를 측정하였다.

4) 통계처리

각 실험결과는 평균값 ± 표준편차로 나타내었고 student t-test를 이용하였 고 통계처리한 후 p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과, 도 4에 나타내었다.

본 발명인 담팔수 분획농축물의 병행 투여군에 대한 림프구의 apoptotic cell의 개수는 6.83개로 방사선 조사 대조군이 14.92 개인 것에 비해 54 %로 유의성 있는 억제 효과를 나타내었다 (p < 0.05).

이는 Comet assay에 의한 방사선 조사 후 3일째의 DNA 손상방어효과와 일치한 결과를 나타내었다 (도 4).

이 결과를 보아 본 발명인 담팔수 분획농축물은 방사선 조사에 의한 림프구의 사멸을 억제시키는 것으로 사료된다.

<실험예 5> T cell 증식능 검사

1. 실험방법

1) 동물 처치

2) 방사선 조사

3) T cell 증식능 검사법

실험군은 각 군당 2마리로 정상 대조군과 방사선조사 대조군과 본 발명인 담팔수 분획농축물의 병행 투여군으로 구분하였고, 방사선 조사 후 3일과 9일에 얻은 비장에서 얻은 림프구를 96 well plate의 각 well에 10 % FBS (fetal bovine serum)와 1 % streptomycin과 penicillin이 포함되어 있는 RPMI 배지 200 ㎕에 well당 4×10⁵ 개로 세포를 3 배수로 분주하고 36.5 ℃, 5 % CO₂가 있는 incubator에서 72시간 배양 후, 3H-thymidine (42 Ci/mmol; Amersham, USA)를 1μCi/well를 첨가한 후 18 시간 후에 유리섬유 여지에 포획하고 건조한 후 방사선 측정기 (TriLux, USA)를 이용하여 방사선 동위원소 양을 측정하였다.

4) 통계처리

2. 실험결과

상기 실험결과, 도 5에 나타내었다.

방사선 조사 후 3일째 절취한 비장에서 얻은 림프구에서의 T cell 증식력에서 방사선 조사 대조군이 1776 cpm인 반면, 본 발명인 담팔수 분획농축물의 병행 투여군은 3533 cpm으로 1.99배 증가하였다.

그리고 방사선 조사 후 9일째 절취한 비장에서 얻은 림프구에서의 T cell 증식력에서 방사선 대조군의 cpm이 1282인 반면 본 발명인 담팔수 분획농축물의 병행 투여군은 13503로 10.5배 증가하였다 (도 5).

Concanavalin A (ConA) 양성 대조군은 23561±3285 cpm을 보였다.

이는 본 발명인 담팔수 분획농축물이 림프구의 손상과 사명을 억제시킬 뿐만 아니라 림프구의 증식을 촉진시키는 것으로 보인다.

<실험예 6> 소장의 apoptotic fragment 빈도

1. 실험방법

1) 동물 처치

2) 방사선 조사

3) 소장에서의 apoptotic fragment 빈도 검사법

방사선조사 후 24 시간 또는 72 시간에 소장을 채취하고 20 % 중성포르말린에 1 일 이상 고정시킨 뒤 각 마우스 당 5 ~ 6 개의 소장편을 통상적인 방법에 따라 조직검사 처리과정을 거쳐 파라핀 포매를 한 후 5 ㎛ 두께의 절편을 만들어 hematoxylin-eosin염색을 하였다.

각 소장절편 당 소장움세포 50 ~ 100 개에서의 apoptotic fragments를 광학현미경으로 관찰하여 그 수를 세었다.

4) 통계처리

2. 실험결과

상기 실험결과, 도 6에 나타내었다.

즉, 도 6에 나타나 있듯이, 본 발명인 담팔수 분획농축물의 병행 투여군의 소장움세포 당 apoptotic fragments의 수는 3.8 개로 방사선 조사 대조군에서의 apoptotic cell의 개수 2.2 개에 비해 42 %의 억제 효과를 나타내었다 (도 6).

이는 본 발명인 담팔수 분획농축물이 방사선 조사에 의한 림프구 손상뿐만 아니라 조직세포의 apoptosis을 억제시키는 것으로 보인다.

Claims

분획농축물 제조방법에 있어서,

담팔수(Elaeocarpus sylvestris var. elipticus)의 가지를 음건한 다음, 세절하여 담팔수세절물을 준비하는 제1공정,

준비된 담팔수세절물을 70 % 에탄올에 침지시킨 후, 감압여과장치로 여과하여 에탄올추출물을 제조하는 제2공정,

에탄올추출물을 감압농축시켜 농축액을 제조하는 제3공정,

농축액에 증류수를 넣고 현탁시켜 현탁액을 제조한 후, 현탁액 1 ℓ 당 헥산 0.5 ~ 2 ℓ를 제조된 현탁액에 넣고 교반한 다음, 분별깔대기로 헥산층을 분리한 후 제거하고, 남은 물층을 획득하는 제4공정,

물층 1 ℓ 당 에틸아세테이트 0.5 ~ 2 ℓ를 획득한 물층에 넣고 교반한 후, 분별깔대기를 이용하여 에틸아세테이트층을 분리하는 제5공정,

에틸아세테이트층을 감압농축시켜 에틸아세테이트 농축액을 제조하는 제6공정,

에틸아세테이트 농축액을 셀라이트와 혼합한 후, 이를 칼럼에 충진 한 다음, 전개용매로 에틸아세테이트를 사용하여 에틸아세테이트 분획물을 수득한 후, 이를 농축하여 본 발명인 담팔수 분획농축물을 제조하는 제7공정으로 구성된,

방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물의 제조방법.
제1항에 있어서,

제2공정의 담팔수세절물을 70 % 에탄올에 침지시킬 때, 20 ~ 25 ℃에서 20 ~ 24 시간동안 침지시키는 것을 특징으로 하는,

방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물의 제조방법.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된,

방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물.
제3항에 있어서,

탄닌성분을 함유하는 것이 특징인,

방사선 방호효과를 갖는 담팔수 분획농축물.