KR101864009B1

KR101864009B1 - 레드비트 추출물을 이용한 방사선에 의한 면역조혈기능 장해 방호용 조성물

Info

Publication number: KR101864009B1
Application number: KR1020160048131A
Authority: KR
Inventors: 지영흔; 장성철; 이남호; 빙소진; 김아름; 조진희; 고은희; 변상희
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2016-04-20
Filing date: 2016-04-20
Publication date: 2018-06-04
Also published as: KR20160046782A

Abstract

본 발명은 비장세포에 대해서 특별히 세포 독성을 보이지 않고(도 1 참조), in vitro 및 in vivo 실험에서 방사선 조사에 의하여 억제된 비장세포, 골수세포 및 혈구세포의 증식을 촉진하며(도 2, 도 4 및 도 5 참조), 방사선 조사에 의한 DNA 손상을 회복시키는 활성 등을 가진 레트비트 추출물을 이용한 방사선에 의한 면역조혈기능 장해 방호용 조성물을 개시한다.

Description

레드비트 추출물을 이용한 방사선에 의한 면역조혈기능 장해 방호용 조성물{Composition for Protecting Damage of Immunomodulation and Heamatopoiesis by Radiation Using a Red Beet Extract}

본 발명은 레드비트(Beta vulgaris L.) 추출물을 이용한 방사선에 의한 면역조혈기능의 장해 방호용 조성물에 관한 것이다.

최근 질병의 진단 및 치료에 방사선 및 방사성 동위원소의 이용이 증가하고 있고, 또한 산업적으로 방사선의 이용이 확대되고 있다. 이에 따라 방사선에 전신이나 국소장기가 노출되는 경우에 일어나는 방사선 장해에 대한 관심도 높아지고 있다.

방사선 장해는 주로 생체내의 구성분자의 이온화로 생성된 활성산소종에 의하여 DAN, 단백질 등이 산화적 손상을 받음으로써 나타나거나, 방사선에 민감한 면역조혈조직의 손상에 의하여 나타난다(Ito et al., Rinsho Hoshasen 24, 915-921, 1979).

비장, 골수 등의 면역조혈조직은 림프구, 적혈구, 과립구, 대식세포 등과 같은 여러 종류의 혈액세포를 성장·분화시키는 기능을 담당한다. 이들 혈액세포들은 수명이 한정되어 있으며, 자기복제능력을 가진 조혈모세포(hematopoietic stem cells)로부터 계속적으로 만들어져 혈액 내로 공급된다. 인간의 경우 태아의 면역조혈기능은 간과 비장이 담당하고 성인의 면역조혈기능은 골수가 담당한다. 마우스 등의 포유동물에 있어서는 비장이 면역조혈기능을 담당한다(Dexter et al., J. Cell. Physiol. 91, 335-344, 1997).

면역조혈기능에는 다양한 면역조혈인자에 의해서 조절되는데, 그 정확한 기전은 아직 밝혀져 있지 않다. 면역조혈인자들은 혈액세포의 성장과 분화에 관여할 뿐만 아니라 그것의 사멸에도 영향을 미친다. 이러한 면역조혈인자로서 GM-CSF(granulocyte/macrophage colony stimulating factor), G-CSF(granulocyte colony stimulating factor), M-CSF(macrophage colony stimulating factor), SCF(stem cell factor), TPO(thrombopoietin), EPO(erythropoietin), IL-1, IL-3 등이 보고되어 있다(Brugger et al., Blood 81, 2579-2584, 1994; Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59, 783-836, 1990).

방사선에 의한 면역조혈기능의 장해는 질병요인(pathogen)에 대한 방어력을 떨어뜨리고 이차감염으로 인하여 치명적인 결과를 초래할 수 있다(Chauvergne et al., Bull. Cancer 83, 315-323, 1996; Cascinu et al., Curr. Opin. Oncol. 7, 325-329, 1995).

따라서 방사선에 의한 생체 손상을 억제하기 위해서는 방사선에 의하여 생성된 활성산소종을 제거하는 것 이외에도 방사선에 의한 면역조혈기능의 장해를 방호하는 것이 중요하다.

이러한 방사선에 의한 장해를 방호하기 위한 방사선 방어 물질에 대한 연구는 아미노산의 일종인 시스테인(cysteine)이 방사선 방어효과를 가짐이 밝혀진 이후, 시올(thiol)기를 가지고 있는 합성물질들의 방어효과에 대해서 지속적으로 이루어져, 현재 방사선 방호제로서는 Walter Reed 연구센터에서 개발하여 미국 FDA의 허가를 받은 시올계 WR-2721(amifostine; 2-(3- aminopropyl amino ethylsulfanylphospho nic acid)가 있다. 그러나 WR-2721는 방사선에 의한 산화적 손상 억제에 그 활성이 한정되어 있으며 임상적 효과를 나타내기 위해서는 고용량의 투여가 요구되고 구토, 졸음, 저혈압 등의 부작용이 보고되어 있다.

방사선에 의한 면역조혈기능의 장해를 방호하기 위하여 면역조혈인자인 G-CSF가 임상적으로 사용되고 있는데, 이 G-CSF는 단백질 의약품으로 고가여서 실제 그 사용에 한계가 있다.

따라서 최근에는 미국, 일본 등 선진국을 중심으로 장기간의 지속적인 사용에도 독성이 적고, 임상적인 치료효과를 보이는 천연물들을 방사선 방어 물질로 이용하는 연구가 활발히 이루어지고 있다.

본 발명은 이러한 배경하에서 이루어진 것으로 방사선에 의한 면역조혈기능의 장해에 방호 효과를 보이는 레드비트 추출물을 개시한다.

본 발명의 목적은 레드비트 추출물을 이용한 방사선에 의한 면역조혈기능 장해 방호용 조성물을 제공하는 데 있다.

기타 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 레트비트 추출물 또는 그 분획물이 비장세포에 대해서 특별히 세포 독성을 보이지 않고(도 1 참조), in vitro 및 in vivo 실험에서 방사선 조사에 의하여 억제된 비장세포, 골수세포 및 혈구세포의 증식을 촉진하며(도 2, 도 4 및 도 5 참조), 방사선 조사에 의한 DNA 손상을 회복시킴을 확인할 수 있다. 나아가 방사선 조사에 의한 골수세포의 세포자멸사를 억제할 뿐만 아니라(도 6 참조) 방사선 조사에 의해 억제된 골수세포의 적혈구로의 분화를 촉진하며(도 7 참조) 면역조혈인자(IL-3, GM-CSF)의 분비를 촉진함을 확인할 수 있었다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 전술한 바를 고려할 때, 일 측면에 있어서 본 발명은 레드비트 추출물을 유효성분으로 포함하는 방사선에 의한 면역조혈기능 장해 방호용 조성물로 파악할 수 있고, 다른 측면에 있어서는 레드비트 추출물을 유효성분으로 포함하는 방사선에 의한 비장세포 장해 방호용 조성물로 파악할 수 있으며, 또 다른 측면에 있어서는 레드비트 추출물을 유효성분으로 포함하는 방사선에 의한 골수세포 장해 방호용 조성물로 파악할 수 있고, 또 다른 측면에 있어서는 레드비트 추출물을 유효성분으로 포함하는 방사선에 의한 면역조혈인자 생성 억제 방호용 조성물로 파악할 수 있다.

본 명세서에서, "방사선에 의한 면역조혈기능 장해 방호"는 방사선에 의한 면역조혈기능의 저하를 회복시키는다는 의미로서, 구체적으로는 혈액모세포의 림프구, 적혈구, 과립구, 대식세포 등 혈액세포로의 성장·분화 기능의 방사선에 의한 저하를 회복시킨다는 의미이며, 더 구체적으로는 면역조혈기능을 담당하는 비장세포 또는 골수세포의 방사선에 의한 장해를 회복시키거나 방사선에 의한 비장세포 또는 골수세포의 조혈인자(IL-3 및/또는 GM-CSF) 생성 억제를를 회복시킨다는 의미이다.

또 본 명세서에서, "방사선에 의한 비장세포 장해 방호"는 방사선에 의한 비장세포의 기능 억제, 증식 억제 및/또는 세포자멸사를 회복시키다는 의미이다.

또 본 명세서에서, "방사선에 의한 골수세포 장해 방호"는 방사선에 의한 골수세포의 기능 억제, 증식 억제 및/또는 세포자멸사를 회복시키다는 의미이다.

또 본 명세서에서, "레드비트 추출물"이란 추출 대상인 레드비트를 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도 등을 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방식을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 상기 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물을 포함하고, 상기 추출물을 상기 용매들을 극성이 증가 또는 감소하는 순으로 사용하여 순차적으로 분획하여 얻어진 분획물을 포함하며, 나아가 크기, 전하, 소수성, 친화성 등의 성질을 이용한 크로마토그래피에 의하여 얻어진 분획물을 포함한다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 아래의 실시예를 참조할 때, 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물(특히 물과 에탄올의 혼합 용매), 그 추출물에서 추출용매를 제거하여 얻은 고형상의 추출물을 물에 현탁하고 이를 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하였을 때 얻어지는 각층의 분획물을 의미한다. 여기서 '순차적으로 분획한다'는 의미는 분획 후의 잔여 물층을 계속적으로 사용하여 상기 열거된 순서대로의 분획 용매로 분획한다는 의미이다. 특히 바람직하게는 아래의 실시예 및 실험예에서 보여지듯이 비장세포에 대해서 독성을 나타내지 않으면서(실험예 1 참조), 방사선 조사에 의해 억제된 비장세포의 증식 촉진 정도를 확인한 in vitro 실험(실험예 2 참조)에서 증식 촉진 활성이 우수한 물과 에탄올 혼합 용매 추출물 또는 상기 순차적 분획물 중 잔여 물층의 분획물을 의미한다.

또 본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어는 국어사전적 의미나 당업계에서 통용되고 있는 의미에 따른다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 염증성 질환의 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게서, 염증성 질환의 개선, 치료, 또는 이러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등) 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 아토피성 피부염 조성물처럼 경우에 따라서는 국소적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

또한 향미나 기호성을 향상시키고 다른 기능성을 추가하기 위하여 한약재가 추가될 수 있는데, 추가될 수 있는 한약재로서는 두충 추출물, 속단 추출물, 녹용 추출물, 홍화인 추출물, 토사자 추출물, 숙지황 추출물, 별갑 추출물, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 감초 추출물, 당귀 추출물, 갈근 추출물, 강진향 추출물, 합환피 추출물, 산두근 추출물, 괴화 추출물, 고삼 추출물 등이 예시될 수 있다.

전술한 바와 같이 본 발명에 따르면, 레드비트 추출물을 이용한 방사선에 의한 면역조혈기능 장해 방호용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 식품 조성물 또는 약품 조성물로 제품화될 수 있다.

도 1은 비장세포에 대한 레드비트 추출물의 독성 실험 결과이다.
도 2는 방사선 조사에 의해 억제된 비장세포의 증식능에 대해 레드비트 추출물이 미치는 영향에 대한 in vitro 실험 결과이다.
도 3은 레드비트 추출물(물층의 분획물)이 방사선 조사에 의한 비장세포의 DNA 손상을 억제하는 정도에 대한 실험 결과이다.
도 4는 방사선 조사에 의해 억제된 비장세포의 증식능에 대해 레드비트 추출물(물층의 분획물)이 미치는 영향에 대한 in vivo 실험 결과이다.
도 5는 방사선 조사에 의해 억제된 골수세포의 증식능에 대해 레드비트 추출물(물층의 분획물)이 미치는 영향에 대한 실험 결과이다.
도 6은 방사선 조사에 의해 억제된 골수세포에 대해 레드비트 추출물(물층의 분획물)이 세포주기에 미치는 영향 대한 실험 결과이다.
도 7은 방사선 조사에 의해 억제된 골수세포의 분화능에 대해 레드비트 추출물(물층의 분획물)이 미치는 영향 대한 실험 결과이다.
도 8은 방사선 조사에 의해 억제된 골수세포의 면역조혈인자의 생성능에 대해 레드비트 추출물(물층의 분획물)이 미치는 영향 대한 실험 결과이다.
도 9는 방사선 조사에 의해 억제된 혈구세포의 증식능에 대해 레드비트 추출물(물층의 분획물)이 미치는 영향에 대한 실험 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 레드비트 추출물의 제조

세분하여 동결 건조된 레드비트(지상부) 996.0 g을 가루로 분쇄한 후, 70% 에탄올 20 L에 넣고 실온에서 24시간 침출시켰다. 침출시킨 레드비트를 감압 여과 장치를 이용하여 여액만 취하였으며, 이와 같은 방법으로 분리한 잔사에 대하여 동일한 조건으로 2회 더 반복 추출하였다. 얻어진 여액을 40℃ 이하의 수욕 상에서 진공농축기(rotary vacuum evaporator)로 농축하여 70% 에탄올 추출물 105.7 g(수율 10.6%)을 얻었다. 이 중 67.5 g을 증류수 3 L에 현탁시키고, 분별깔대기를 이용해 극성 순서에 따라 헥산(n-hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 부탄올(n-butanol)로 순차적으로 분획하여 헥산 층(Hexane extract) 0.1 g 미만(수율 0.1%), 에틸아세테이트 층(EtOAc extract) 0.4 g(수율 0.6%), 부탄올 층(BuOH extract) 7.8 g(수율 11.5%), 물 층(H₂O extract) 55.6 g(수율 82.4 %)의 총 4개의 용매 분획층을 얻었다.

< 실험예 > 레트비트 추출물의 면역 증진 활성, 조혈 증진 활성 및 방사선 방호 활성 실험

< 실험예 1> 레드비트가 비장세포에서 나타내는 세포독성 효과 측정

< 실험예 1-1> 마우스의 비장세포 부유액 준비

7 ~ 10주령 C57BL/6 마우스의 비장을 적출하여 세포 여과기를 통해 단일세포 부유액을 얻었다. 이렇게 얻은 세포는 염화암모늄(ammonium chloride, ACK) 용액과 함께 10 분간 실온에서 배양한 뒤 인산완충용액(Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS, Gibco BRL, Paisley, UK)로 씻어내고, 10% 소태아 혈청(Gibco BRL)과 1% 항생제(100U/ml penicillin-streptomycin, Gibco BRL)가 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL)에 부유시켰다.

< 실험예 1-2> 실험 방법

상기 비장세포에 상기 실시예의 레드비트 추출물과 각 분획물의 세포독성을 확인하기 위해 MTT 분석법을 이용하여 비장세포의 생존율에 대하여 측정하였다.

96 well plate에 상기 마우스의 비장세포를 1×10⁵cells/well로 넣고 시료를 농도별로 0, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000 ㎍/ml로 처리하였다. 72 시간 배양한 후, MTT 용액(5 mg/ml)을 각각의 well에 15 ㎕씩 넣고 4시간 배양하였다. 이후 버퍼(solubilzation buffer, pH 4.7) 100 ㎕를 첨가하여 formazan 결정을 녹인 후, 570nm과 630nm에서 흡광도를 측정하고, 결과는 대조군(0 ㎍/ml)의 OD 값에 대한 비율로 표현하였다. 각 실험결과는 평균값±표준편차로 나타내었고 student t-test를 이용하여 통계 처리하였다.

< 실험예 1-3> 실험 결과

상기 실험결과는 도 1에 나타내었다.

도 1을 참조하여 보면, 실시예의 추출물과 물층의 분획물 그리고 부탄올층 분획물은 고농도인 1,000 ㎍/ml에서도 말초면역세포인 비장세포에 대한 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다. 에틸아세테이트층 분획물과 헥산층의 분획물은 저농도에서는 독성을 나타내지 않았지만 250 ㎍/ml 이상의 고농도에서 약간의 독성을 나타내었다.

< 실험예 2> 레드비트가 비장세포의 세포증식능에 미치는 영향 측정

< 실험예 2-1> 마우스의 비장세포 부유액 준비

비장세포유액은 15ml 튜브에 넣어 상온에서 0.69Gy/min의 선량율로 ⁶⁰Co 감마선(Theratron-780 teletherapy unit, 방사선응용과학연구소, 제주대학교)을 이용하여 2 Gy의 선량으로 1회 조사하였다.

< 실험예 2-2> 실험 방법

상기 비장세포에 대해 상기 실시예의 레드비트 추출물과 각 분획물이 세포증식능에 미치는 영향을 확인하기 위해 tritium thymidine incorporation 분석법을 이용하여 비장세포의 증식능에 미치는 영향에 대하여 측정하였다.

각각의 비장세포를 96 well plate의 각 well에 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% streptomycin과 penicillin이 포함되어 있는 RPMI 배지 200 ml에 well당 5×5⁵개로 세포를 3배수로 분주 후 시료를 농도별로 0, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000 ㎍/ml로 처리하였다. 이후, 36.5℃, 5% CO²가 있는 incubator에서 54시간 배양 후,³H-thymidine(42 Ci/mmol; Amersham, USA)를 1 uCi/well를 첨가한 후 18시간 후에 유리섬유 여지에 포획하고 건조한 후 방사선 측정기(TriLux, USA)를 이용하여 방사선 동위원소 양을 측정하였다.

각 실험결과는 평균값 표준편차로 나타내었고 student t-test를 이용하였고 통계처리한 후 **p<0.01 수준에서 유의성을 검정하였다.

< 실험예 2-3> 실험 결과

상기 실험결과는 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하여 보면, 실시예의 추출물과 물층의 분획물 그리고 부탄올층 분획물이 대체로 처리 농도에 비례하여 유의성 있게 비장세포의 증식 효과를 보였다.

< 실험예 3> 레드비트가 말초 비장세포에서 나타나는 DNA 손상억제 효과 측정

< 실험예 3-1> 실험 재료

a) 동물 처치

본 실험에 이용된 동물은 바이오제노믹스사에서 구입한 10~15 주령, 24 ~ 30 g의 C57BL/6 마우스(Jackon사, USA)를 사용하였다. 사육 조건은 온도 23 ± 3℃, 습도 50 ± 5%를 맞추어 주었으며, 마우스 전용사료와 음수를 자유급식 하였다. 동물실험에서 시료는 물층의 분획물을 사용하였고, 시료는 방사선 조사 17, 1시간 전과 방사선 조사 후 5일 후에 각각 400 mg/mouse을 경구 투여하였고, 대조군은 동량의 PBS를 각각 경구 투여하였다.

b) 방사선 조사

C57BL/6 마우스는 perspex box(3 × 3 × 11 cm)에 넣어 상온에서 0.69 Gy/min의 선량률로 ⁶⁰Co 감마선 (Theratron-780 teletherapy unit, 방사선응용과학연구소, 제주대학교)을 이용하여 7 Gy의 선량으로 조사하였다.

< 실험예 3-2> 실험 방법

7 Gy 방사선 전신조사 후 10일째에 마우스를 희생시킨 후 비장을 분리하여 각각 5 × 10⁴/㎖의 비장세포를 얻었다. 이후 비장세포(5×10⁴/group)를 1000 ml의 DPBS로 세척을 한 다음, 0.7% Low melting point aparose(LMPA)와 골고루 섞은 후 1% normal melting point agarose (NMPA)가 코팅되어 있는 슬라이드 위에 75 ml을 loading하여 4℃ 냉장고에 넣어 굳힌 후 그 위에 다시 0.7% LMPA 용액 75ml를 올려 굳힌 뒤, lysing solution(2.5 M NaCl, 100 mM Na₂-EDTA, 10mM Tris-HCl pH 10, 1% DMSO, 1% Triton X-100, and 1% N-lauroulsarcosinate)에 slide를 넣고 4℃, 암실에서 1시간 동안 침지시켜 용해시켰다. 그 후 슬라이드를 전기영동장치에 배열하고 4℃ unwinding buffer(300 mM NaOH, 10 mM Na₂-EDTA pH 8)를 채워 20분 동안 unwinding 시킨 후 25 V/300 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하고, 전기영동이 끝난 슬라이드는 neutralization buffer(0.4 M Tris, pH 7)로 15분씩 세척하였다. DNA 손상 정도를 분석하기 위해 ethidium bromide로 nucleotide를 염색하여 형광현미경에서 관찰하고 각각의 세포핵 이미지를 Comet image analyzing program인 Komet 5.5 프로그램(Kinetic Image Co. UK)으로 분석하였다.

DNA 손상정도는 tail DNA%, olive tail movement(mm) 그리고 tail lengh(mm)로 측정하였고 각각의 마우스 당 100개의 세포를 관찰하여 측정하였다.

각 실험결과는 평균값 표준편차로 나타내었고 student t-test를 이용하였고 통계처리한 후 *p<0.05과 **p<0.01 수준에서 유의성을 검정하였다.

< 실험예 3-3> 실험 결과

실험 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3을 참조하여 보면 레드비트의 병행 처리군에서는 방사선 대조군에 비하여 tail DNA%, olive tail movement 및 tail length가 거의 정상 대조군 수준으로 회복됨을 보여준다. 도 3에서 A는 ethidium bromide로 nucleotide를 염색하여 촬영한 정상 대조군의 전자현미경 사진이고, B는 방사선 대조군의 전자현미경 사진이며, C는 시료의 병행 처리군의 전자현미경 사진이다. 그리고 D는 tail DNA%, E는 Olive tail movement, F는 tail length 결과이다.

< 실험예 4> 방사선 조사 후 억제된 면역세포에 레드비트가 나타내는 세포증식 효과 측정

< 실험예 4-1> 실험 재료

a) 동물처치

본 실험에 이용된 동물은 바이오제노믹스사에서 구입한 10~15 주령, 24 ~ 30 g의 C57BL/6 마우스(Jackon사, USA)를 사용하였다. 사육 조건은 온도 23 ± 3℃, 습도 50 ± 5%를 맞추어 주었으며, 마우스 전용사료와 음수를 자유급식 하였다. 동물실험에서 시료는 물층의 분획물을 사용하였고, 시료는 방사선 조사 17, 1시간 전과 방사선 조사 후 5일 후에 400 mg/mouse을 각각 경구 투여하였고, 대조군은 동량의 PBS를 각각 경구 투여하였다.

b) 방사선 조사

< 실험예 4-2> 실험 방법

방사선 조사 후 억제된 말초 면역세포인 비장세포의 DNA손상 억제뿐만 아니라 증식능에도 레드비트가 미치는 영향을 알아보기 위해, ³H-thymidine incorporation 실험을 수행하였다. 방사선을 전신 조사 후 10일째 마우스를 희생시켜 비장을 얻었다.

이후 비장세포를 분리하여 각각의 비장세포를 96well plate의 각 well에 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% streptomycin과 penicillin이 포함되어 있는 RPMI 배지 200ml에 well당 5 × 10⁵개로 세포를 3배수로 분주하였다. 이후, 36.5℃, 5% CO²가 있는 incubator에서 72시간 배양 후,³H-thymidine(42 Ci/mmol; Amersham, USA)를 1 uCi/well를 첨가한 후 18시간 후에 유리섬유 여지에 포획하고 건조한 후 방사선 측정기(TriLux, USA)를 이용하여 방사선 동위원소 양을 측정하였다.

< 실험예 4-3> 실험 결과

상기 실험결과는 도 4에 나타내었다.

즉, 방사선 조사 후 10일째 얻은 비장세포에서 레드비트 병행 투여군은 511 ±84cpm으로 방사선 조사 대조군이 152 ± 20cpm에 비해 약 3.3배 증가를 나타내었다. 이는 레드비트가 말초 면역세포의 DNA 손상을 억제시킬 뿐만 아니라 증식을 촉진시킴을 의미한다 할 수 있다.

< 실험예 5> 방사선 조사 후 억제된 골수세포에 대해 레드비트가 세포 수에 미치는 효과측정

< 실험예 5-1> 실험 재료

a) 동물처치

b) 방사선 조사

< 실험예 5-2> 실험 방법

7 Gy의 방사선 조사 후 10일째 희생된 각 군의 마우스의 대퇴골로부터 골수세포를 얻어 세포 여과기를 통해 단일세포 부유액을 얻었다. 이후 10% 소태아 혈청(Gibco BRL, Paisely, UK)과 1% 항생제(100U/ml penicillin-strepto mycin, Gibco BRL)가 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL)에 부유시켜, hemocytometer(Superior, Marienfeld, Germay)를 이용하여 골수세포의 수를 측정하였다.

각 실험결과는 평균값 표준편차로 나타내었고 student t-test를 이용하였고 통계처리한 후 *p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.

< 실험예 5-3> 실험 결과

결과를 도 5에 나타내었다.

도 5를 참조하여 보면, 방사선 조사 대조군에서는 정상 대조군에 비해 골수세포의 수가 크게 감소하였고 레드비트 병행 투여군은 이를 뚜렷하게 회복시킴을 알 수 있다. 이는 레드비트가 방사선 조사에 의한 골수세포의 손상에 대해 보호 효능을 나타낸다는 것을 의미한다.

< 실험예 6> 방사선 조사 후 억제된 골수세포에 대해 레드비트가 세포주기에 미치는 영향 측정

< 실험예 6-1> 실험 재료

a) 동물 처치

b) 방사선 조사

< 실험예 6-2> 실험 방법

7 Gy의 방사선 조사 후 10일 째 희생된 각 군의 마우스의 대퇴골로부터 골수세포를 얻어 세포 여과기를 통해 단일세포 부유액을 얻었다. 이후 70% 알콜로 세포를 고정하고 세척한 세포(1×10⁶)의 DNA는 (20 g/ml Prophidium iodine, 200g/ml RNase) 500㎕로 36.5℃, 5% CO²가 있는 incubator에서 30분간 반응 후 flow cytometry (FACS Calibur, BD bioscience)를 이용하여 측정하였다.

각 실험결과는 평균값 표준편차로 나타내었고 student t-test를 이용하였고 통계처리한 후 *p<0.05,**p<0.01 수준에서 유의성을 검정하였다.

< 실험예 6-3> 실험 결과

상기 실험결과를 도 6에 나타내었다.

즉, 방사선 조사로 인해 세포자멸사가 유도된 세포는 DNA가 분절화 되어 DNA함량이 적어 Prophidium iodine에 의한 염색량이 적으므로 세포주기 분석을 이용한 유세포 분석에서 G0/G1기의 세포보다 적게 염색되어 sub-G1기 peak를 형성하는 것으로 알려져 있다(Carlo Riccardi & Ildo Nicoletti, Nature Protocols 2006; 1:1458). 따라서 세포자멸사가 일어난 Sub-G1기의 세포는 방사선 대조군에서 정상대조군(3.4 ± 0.8%)에 비해 10.7 ± 4.3%로 증가하는 반면, 시료 병행 투여군은 1.1 ± 0.1%로 정상대조군 보다도 낮은 수준으로 감소한 것으로 보아, 레드비트가 방사선 조사에 의해 생기는 골수세포의 세포자멸사 DNA 분절현상을 효과적으로 억제시킨다는 것을 알 수 있었다. 또한 세포주기 중 DNA의 복제 및 분열시기를 나타내는 S phase와 M phase의 세포가 레드비트의 투여에 의해 방사선 대조군 보다 각각 1.63배, 1.56배 증가한 것으로 보아, 레드비트가 골수세포의 세포자멸사 억제효과뿐만 아니라 골수세포의 증식과 분열에 효과를 미친다는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 7> 방사선 조사 후 억제된 골수세포에 대해 레드비트가 분화능에 미치는 영향 측정

< 실험예 7-1> 실험 재료

a) 동물처치

b) 방사선 조사

< 실험예 7-2> 실험 방법

골수세포의 분화능에 레드비트가 미치는 영향을 알아보기 위하여 CFC(colony forming cell) assay를 실시하였다. 7 Gy의 방사선이 조사된 후 10일째에 분리한 골수세포의 단일세포 부유액을 조혈기계의 증식인자인 IL-3, IL-6, EPO 등이 함유된 methylcellulose media(R&D systems, MN, USA)에 12일간 배양 후 적혈구, 과립구 및 대식세포의 증식을 평가하였다. 평가방법으로는 BFU-E(burst forming unit-erythroid), CFU-GM(colony forming unit-granulocyte, macrophage), CFU-G(colony forming unit-granulocyte), CFU-M(colony forming unit-macrophage), CFU-GEMM(colony forming unit- granulocyte, erythrocyte, macrophage, megakaryocyte)의 각 colony가 형성된 개수를 count하였다.

< 실험예 7-3> 실험 결과

실험결과를 도 7에 나타내었다.

즉, CFC assay를 이용하여 각 군의 마우스에서 분리된 골수세포를 12일간 배양 후 적혈구, 과립구 및 대식세포의 증식을 평가한 결과, 대식세포(macrophage)의 전구세포들이 형성한 집락인 CFU-M과 과립구 (granulocyte)의 전구세포가 형성한 집락인 CFU-G, 그리고 이상의 전구세포가 혼재되어 형성되는 CFU-GM은 방사선 조사 대조군, 레드비트 병행 투여군 간의 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 그러나 적혈구의 전구세포가 형성한 집락인 BFU-E은 레드비트 병행 투여군에서 방사선 조사로 인하여 감소된 적혈구 전구세포의 집락의 형성이 약 2.1배 증가되었다. 이 결과를 통하여 볼 때, 레드비트는 방사선 조사로 인해 감소된 혈구세포의 분화능 중 특히 적혈구계 전구세포의 분화능을 촉진하는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 8> 방사선 조사 후 억제된 골수세포에 대해 레드비트가 조혈세포 성장 촉진인자의 생성량에 미치는 영향 측정

< 실험예 8-1> 실험 재료

a) 동물처치

b) 방사선 조사

< 실험예 8-2> 실험 방법

조혈세포의 성장 촉진 인자인 IL-3 또는 GM-CSF의 생성량에 레드비트가 미치는 영향을 ELISA를 통하여 평가하였다. 7 Gy의 방사선이 조사된 후 10일째에 분리한 골수세포의 단일세포 부유액을 96 well plate의 각 well에 10% FBS와 1% streptomycin과 penicillin이 포함되어 있는 RPMI 배지 200 와 함께 well당 1×10⁶개로 분주하고 37℃, 5% CO₂, 포화습도가 있는 배양기에서 48시간 배양하였다. 이 후 상층액을 분리하여, IL-3와 GM-CSF의 생성량 변화를 ELISA (Invitrogen, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.

각 실험 결과는 평균값 표준편차로 나타내었고 student t-test를 이용하였고 통계처리한 후 **p<0.01 수준에서 유의성을 검정하였다.

< 실험예 8-3> 실험 결과

상기 실험결과를 도 8에 나타내었다.

도 8을 참조하여 보면, 비장세포(도 8의 A 및 B)와 골수세포(도 8의 C 및 D)에서 방사선 조사에 의하여 저하된 면역조혈인자(IL-3 및 GM-CSF)의 생성량을 레드비트 추출물이 회복시킴을 보여준다.

< 실험예 9> 방사선 조사 후 억제된 말초혈구세포의 수에 대해 레드비트가 미치는 영향측정

< 실험예 9-1> 실험 재료

a) 동물처치

b) 방사선 조사

< 실험예 9-2> 실험 방법

7 Gy의 방사선이 조사된 후 10일째에 혈액학적 변화를 확인하기 위해 에테르 마취하에 심장에서 혈액을 채취하였다. 채혈한 혈액은 혈액학적 검사를 하기 위해 EDTA-2K가 처리된 CBC 채혈병(BD Microtainer, USA)에 넣고 roller mix에서 혼합하여 응고를 방지하였다.

채혈 후 하루 이내에 자동혈구계측장치(Coulter Counter, pocH-100iv, sysmex corp., Japan)를 사용하여 WBC(White Blood Cell, ×10³/㎕), RBC(Red Blood Cell, ×10⁶/㎕), HGB(Hemoglobin, g/dL), HCT(Hematocrit, %), MCV(Mean Corpuscular Volume, fL), MCH(Mean Corpuscular Hemoglobin, pg), MCHC(Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, g/dL), PLT(Platelet Count, ×10³/㎕)의 변화를 측정하였다.

< 실험예 9-3> 실험 결과

상기 실험결과를 도 9에 나타내었다.

이온화 방사선의 한 종류인 감마선을 이용한 혈액학적 변화는 방사선 조사 시 발생하는 활성산소(Reactive Oxygen Species, ROS)에 의해 지질과산화를 야기하여 적혈구 막에 손상을 가져오고 적혈구의 생존을 감소시켜 혈구 내 변화를 야기한다.

방사선 조사 10일 경과 후 마우스의 혈액학적 변화를 측정한 결과, WBC, MCV, MCH, MCHC, PLT 수치는 방사선 조사 대조군과 레드비트 병행 투여군에서 차이를 보이지 않았으나(결과는 도시되어 있지 않음), RBC는 방사선 조사대조군에서 6.6 ± 0.3 × 10⁶/인 반면 레드비트 병행 투여군에서 7.2 ± 0.2 × 10⁶/로 1.1배 증가하였다. 또한 적혈구용적률과 헤모글로빈(Hemoglobin) 수치 역시 레드비트 병행 투여군에서 방사선 조사 대조군에 비해 각각 1.1배씩 증가하였다. 이를 통해 레드비트에 의한 중추 조혈기관인 골수세포 중 적혈구계 모세포의 분화 및 증식의 촉진 효과가 말초 혈액세포의 변화에 반영되어 방사선 조사로 손상된 적혈구의 수 및 기능을 증가시키는 것으로 사료된다.

Claims

(i) 레드비트 지상부 물 추출물 또는 (ii)레드비트 지상부의 70% 에탄올 추출물을 물에 현탁시키고 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하였을 때 얻어지는 잔여 물층의 분획물을 유효성분으로 포함하는 방사선에 의한 면역 기능 장해 방호용 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 방사선에 의한 면역 기능 장해 방호용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 방사선에 의한 면역 기능 장해 방호용 조성물.
(i) 레드비트 지상부 물 추출물 또는 (ii)레드비트 지상부의 70% 에탄올 추출물을 물에 현탁시키고 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하였을 때 얻어지는 잔여 물층의 분획물을 유효성분으로 포함하는 방사선에 의한 비장세포 장해 방호용 조성물.
삭제
제5항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 방사선에 의한 비장세포 장해 방호용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 방사선에 의한 비장세포 장해 방호용 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제