KR102054597B1 - 패 추출물을 이용한 운동수행능력 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 패(Ishige okamurae) 추출물을 이용한 운동수행능력 개선용 조성물을 개시한다. 패 추출물은 근수축과 운동성 향상에 필요한 칼슘 이온의 세포 내 흡수를 촉진하고 이러한 근수축 등에 필요한 에너지원인 글루코오스 흡수를 유도하며, 또 제브라피시를 이용한 동물실험에서도 에너지 소비능을 촉진시키고 세포 내로의 글루코오스 유입을 유도하는 활성을 갖는다.

Description

패 추출물을 이용한 운동수행능력 개선용 조성물{Composition for Improvement of Exercise Performance Using an Extract of Ishige okamurae}

본 발명은 패(Ishige okamurae) 추출물을 이용한 운동수행능력 개선용 조성물에 관한 것이다.

골격근의 주된 역할은 골근육의 수축과 이완을 일으키는 것이며, 이 때 골격근 세포의 세포질 내 칼슘 이온이 골격근의 수축과 이완 과정을 매개하는 핵심적인 이차전달 물질로 작용한다. 칼슘 이온은 인체에서 세포 내외 중요한 역할을 하며 다양한 조직에서 적절한 기능을 유지하기 위해 세밀하게 조절된다. 세포 외 칼슘은 연골과 골격의 주요 구성분일 뿐만 아니라 심장과 근육에서는 흥분 수축 결합, 신경계에서는 시냅스 전달 등에 관여한다. 세포 내 칼슘은 세포 외 칼슘보다 10,000배 낮은 농도를 유지하면서 세포 분열, 근육 수축, 세포 이동, 막 전달과 분비 등에 있어서 신호 전달자로서 중요한 역할을 한다(Clin J Am Soc Nephrol. 2010. 5 Suppl 1:S23-30; Nephro Physiol. 2011. 118:22-7; Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.2003.4:517-29).

안정시의 세포 내 유리 칼슘이온 농도는 세포 외액에 비해 매우 낮으나 신경 자극에 따른 근세포 막의 탈분극으로 세포 외액이나 세포 내 저장 장소로부터 칼슘이온이 유입 또는 유리되어 일정 수준에 이르면 근 수축이 유발되는 것으로 알려져 있다. 특히 골격근 수축은 근세포 밖의 칼슘을 제거하였을 때에도 오랫동안 지속되기 때문에 근육은 세포 내 중요한 칼슘 공급처인 것으로 여겨진다(Annul. Rev. Physiol. 1976. 38:293-313; Physio. Rev. 1977. 71-108).

또 세포 내 증가된 칼슘은 미토콘드리아를 통한 호흡과 ATP 생산을 유도한다고 알려져 있다(Am J Physiol Cell Physiol. 2004. 287:817-833; Biochemistry. 2013. 52:2793-2809). 근육이 자극을 받으면, SR(sarcoplasmic reticulum) Ca2+ pumps(SERCA, 소세포체 표면에 존재하는 칼슘 펌프로, 세포질에 존재하는 칼슘을 소포체내로 이동시킴으로써 세포 내 칼슘농도 항상성을 조절한다)를 통해 칼슘이 SR 안으로 들어오고, 이로 인하여 액틴-미오신 결합이 형성되어 근육의 수축이 일어난다. 근 수축 후에는 ATP을 이용한 능동수송으로 칼슘은 다시 원위치(SR을 통한 세포 바깥)로 이동하게 되며, ATP가 미오신과 결합하면 액틴-미오신 결합은 끊어지고 근육은 이완하게 된다.

이때 필요한 ATP의 생성은 이원질 시스템(phosphagen system), 해당과정(glycolysis), ATP 분해과정의 3가지 방법에 이루어 지며, 특히 운동할 때 필요한 포도당 생산의 가장 중요한 역할을 하는 것은 글루카곤 분비의 증가이다(J Clin Invest. 1984. 74(4):1404-13). 운동이 세포막에 발현되는 포도당 수용체4(GLUT4)의 수를 증가시키며 세포조직에서의 GLUT4의 농도도 증가시킨다는 보고가 있으며(JAMA. 1991. 266:1535-42; J Clin invest. 1979. 64:1011-15; Am J Physiol. 1987. 252:E170-175), 이는 운동 중 근육의 포도당 섭취가 증가하므로 ATP의 재생을 증가시켜 포도당 수송 속도를 증가시킨다는 주장을 뒷받침 한다.

또한, 운동시 근육과 간의 글리코겐 고갈은 피로의 주요 원인이며, 골격근의 ATP는 근수축시 미토콘드리아에서 생성되는 즉각적인 에너지원이다. 때문에, 세포실험 또는 실험동물의 간과 근육조직을 통한 골격근 내 글리코겐 함량 또는 근육 내 ATP 함량 측정은 운동수행능력 향상 기능성 평가의 바이오마커로 사용된다(대한민국 식약처, 2016, 건강기능식품 기능성 평가 가이드).

이에, 이에 본 발명의 발명자들은, 패(Ishige okamurae)로부터 분리·동정한 신규물질인 HdP이 근육 내로의 칼슘 유입을 촉진하고 글루코오스의 흡수를 유도하여 근수축을 유도하고 근육의 운동성을 증가시킬 수 있음을 제시하였다.

본 발명의 목적은 패 추출물을 이용한 운동수행능력 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 패 추출물이 근수축과 운동성 향상에 필요한 칼슘 이온의 세포 내 흡수를 촉진하고 이러한 근수축 등에 필요한 에너지원인 글루코오스 흡수를 유도하며, 또 제브라피시를 이용한 동물실험에서도 에너지 소비능을 촉진시키고 세포 내로의 글루코오스 유입을 유도함을 확인하였다.

전술한 바의 실험 결과를 고려할 때, 본 발명은 패 추출물을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 개선용 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서, "패 추출물"은 추출 대상인 패 전초, 잎, 줄기, 지상부, 뿌리, 지하부 또는 이들의 혼합물을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물, 특히 추출용매로서 물과 에탄올의 혼합용매를 사용하여 추출물을 의미한다.

또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 조성물에서 그 유효성분은 운동수행능력 개선 효과 등 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 운동 능력 개선 효과 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분 이외에, 운동수행능력 개선 효과 등의 상승·보강을 위하여 또는 피로 개선 활성 등 유사활성의 부가를 통한 복용이나 섭취의 편리성을 증진시키기 위하여, 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 "대한민국약전"), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 "건강기능식품 기준 및 규격"임) 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 "약사법"임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조?판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 「건강기능식품에관한법률」임)에 따라 기능성이 인정된 화합물 또는 추출물이 포함된다. 예컨대 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따라 '운동 수행 능력 향상'으로 기능성이 인정된 마카 젤라틴화 분말, 크레아틴, 헛개나무 과병 추출 분말, 동충하초 발효 추출물 등과, '피로 개선'으로 기능성이 인정된 발효 생성 아미노산 복합물, 헛개나무 과병 추출물, 홍경천 추출물 등이나, 또 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따라 '피로 개선'으로 기능성이 인정된 발효 생성 아미노산 복합물, 헛개나무 과병 추출물, 홍경천 추출물 등이 이러한 화합물 또는 추출물에 해당할 것이다.

이러한 화합물 또는 추출물은 본 발명의 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류(乳類), 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다. 또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 "건강기능식품에관한법률"에 따른 건강기능식품이거나, 한국 "식품위생법"의 식품공전(식약처 고시 "식품의 기준 및 규격"임)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조?유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 "식품위생법"임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 "식품첨가물 기준 및 규격)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.

감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 식품 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위한 용도로 사용되는 것으로, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제로서는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로서는 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등이 사용될 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충·보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 법률에 따른 식품공전이나 식품첨가물공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약제학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코오스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 점안제, 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제, 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 점안제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 식염수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있으며 필요에 따라 염화벤잘코늄, 메필파라벤, 에틸파라벤 등을 방부 목적으로 첨가할 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.

약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 패 추출물을 이용한 운동수행능력 개선용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 식품 또는 약품으로 제품화될 수 있다.

도 1은 패 추출물이 근원세포인 C2C12 세포에서 글루코오스의 흡수를 유도함을 보여주는 결과이다.
도 2는 패 추출물이 근원세포인 C2C12에서 세포 내 칼슘 이온(Ca2+) 농도를 상승시킴을 보여주는 결과이다.
도 3은 제브라피시 배아에서의 패 추출물의 독성 데스트 결과이다.
도 4는 패 추출물이 제브라피시 배아에서 에너지 소비능을 촉진함을 보여주는 결과이다.
도 5는 패 추출물이 제브라피시 근육 내로의 글루코오스 유입을 유도함을 보여주는 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예> 패 추출물의 제조

패(Ishige okamurae)는 제주 성산 지역에서 채집되어 담수에서 2회를 씻어 염분을 제거하여 자연건조 하였다. 건조된 패를 믹서기에 갈아서 분말화하고 이 분말 100g을 2L의 50% 에탄올에 24시간 실온에서 추출한 뒤, 여과하고 감암농축하여 추출용매를 제거하고 분말상의 추출물을 얻었다.

<실험예> 패 추출물의 운동수행능력 향상 활성

1. 실험 방법

1.1 생체 외(in-vitro) 실험

1.1.1 C2C12 세포 배양과 분화

마우스 유래 근원세포인 C2C12 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)는 10% FBS와 항생제가 포함된 DMEM(Dulbeccos Modified Eagle's Media) 배지에 현탁하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양기에서 배양했다. 세포 밀도가 80%가 되면, C2C12세포는 2% 마혈청(horse serum)과 저농도 글루코오스가 포함된 DMEM 배지에서 5일 동안 분화시켰으며 배지는 3일마다 교체하였다. 분화된 세포는 저농도의 글루코오스가 포함된 무혈청 DMEM 배지에서 12시간 동안 기아 상태(starvation)를 유지시키고, PBS 용액으로 세척한 후, 저농도의 글루코오스가 포함된 새로운 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 동안 시료(패 추출물)와 반응시켰다.

1.1.2 유세포분석기(FACS)를 이용한 C2C12세포의 당 흡수 측정

마우스 유래 C2C12 근원세포의 당 흡수 측정은 2-NBDG((2-(N-(7-Nitrobenz-2 oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) 분석법(Cell Death Dis. 2017 Oct 5. 8(10):e3078)를 사용하여 유세포분석장치(FACS)로 측정하였다. 상기 배양된 세포를 10μM 농도의 2-NBDG(Invitrogen)와 함께 37℃에서 10분 동안 반응 시킨 후, BD FACS CantoII(BD　Biosciences, NJ, USA)로 분석을 수행하였고, 2-NBDG의 형광은 FITC 채널에서 검출하였다.

1.1.3 C2C12 세포에서 Fluo4를 이용한 세포 내 칼슘 농도 측정

세포 내 칼슘 농도는 칼슘 민감성 프로브 Fluo4를, 칼슘 미포함된 1X PSS 버퍼(140mM 염화나트륨, 5.9mM 염화칼륨, 1.8mM 염화마그네슘, 10mM HEPES, 11.5mM 글루코오스, 1.2mM 인산수소나트륨, 5mM 탄산수소나트륨 포함 생리식염수)에 희석하여 사용하였다. C2C12세포를 Fluo4와 37℃에서 30분간 반응시키고, 0.1% BSA가 포함된 1X PSS 버퍼를 첨가하였다. 처음 5분 동안의 기저 형광을 기록하고, 0.1% 소혈청 알부민과 함께 1X PSS 버퍼와 시료(패 추출물)를 처리하였다. 10분 동안 형광을 다시 기록한 후, 세포에 바로 고농도 포타슘 용액(100mM KCl), 칼슘(2mM CaCl2)이 포함된 1X PSS 버퍼를, 0.1% 소혈청 알부민과 함께 첨가하여, 세포막 전압을 탈분극시켜 칼슘 통로를 활성화 시켰다. 시간에 따른 형광 강도를 현미경으로 관찰하였다. 이때 형광 강도는 세포내 칼슘 이온 농도를 반영한다.

1.2 동물실험

성체 제브라피시(Zebrafish)는 시중(제주 아쿠라이룸, 제주도, 한국)에서 구입하여 실험에 사용하였으며, 28.5±1℃ 온도 및 14/10시간 명암 주기 조건의 3.5L 아크릴 탱크에서 관리하며 1일 2회 식이(Tetra GmgH D-49304 Melle, made in Germany)를 급여하였다. 실험은 제주대학교 동물실험윤리위원회의 승인하에 이루어졌다.

1.2.1 제브라피시 배아에서의 독성 테스트

수정 후 4시간이 경과한 배아(n=15)를 배아 배지(60 ppm의 염을 포함하는 증류수) 950㎕와 시료(패 추출물) 용액 50㎕이 함유된 12 웰 플레이트의 각 웰에 옮기고, 수정 후 168시간 동안 시료(패 추출물)에 노출된 제브라피시 배아의 생존율을 측정하였다.

1.2.2 제브라피시의 에너지 소비능의 측정

수정후 3일이 지난 제브라피쉬 배아에 시료(패 추출물)를 24시간 동안 28℃에서 처리한 후, 웰당에 3마리의 제브라피쉬를 넣고, 배아 배지에 자체 제조한 alamar blue reagent(1% DMSO, 1% almarblue, 4mM sodium biocarbonate)를 100 ㎕씩 처리하여, 1시간 이후부터 24시간까지 시간대별로, excitation 530nm 그리고 emission 590nm에서 측정하였다.

1.2.3 제브라피시의 혈중 글루코오스 농도 측정

야생형 성체 제브라피시를 2mg/ml의 알록산(alloxan)에 1시간 동안 반응시킨 후, 인슐린이 없는 상태에서 1% 글루코오스에 1시간 반응시켰다. 이후 반응용액을 물로 바꾸고 1시간 동안 반응시킨 후, 시료(패 추출물), 메트포르민(Metformin), BAPTA-AM을 90분 동안 처리하였다. 실험군은 무처리군, 알록산 처리군(control), 알록산과 시료(패 추출물)(0.3 ㎍/g body weight) 처리군, 알론산과 메트포르민(5 ㎍/g body weight) 처리군, 알록산과 BAPTA-AM(3 ㎍/g body weight) 처리군, 및 알록산과 BAPTA-AM(3 ㎍/g body weight) 그리고 시료(패 추출물)(0.3 ㎍/g body weight) 처리군으로 구성하였다.

2. 실험 결과

2.1 C2C12세포의 당 흡수 측정 결과

분화된 C2C12 세포에서, 패 추출물에 의한 글루코오스 흡수능을 측정하여 결과를 도 1에 나타내었다. FACS는 세포의 불균질 혼합물로부터 다수의 형광이 부착된 세포를 단리하는 장치이다. 형광이 표지된 글루코오스 유사체인 2-NBDG와 반응시킨 C2C12세포에서 FITC 필터에 의해 2-NBDG의 검출이 많을수록 형광 강도는 강해지며, 그래프는 오른쪽으로 움직이게 된다. 도 1을 참조하여 보면, 패 추출물을 처리한, C2C12 세포 내의 글루코오스 흡수가 패 추출물의 처리 농도에 의존적으로 유의하게 증가함을 알 수 있다. 이는 패 추출물이 근수축에 필요한 에너지원인 포도당 흡수를 촉진할 수 있음을 보여주는 결과라 할 수 있다.

2.2 C2C12세포의 세포 내 칼슘이온 레벨 측정 결과

5일 분화된 C2C12 세포에 패 추출물을 처리하여 세포 내 칼슘 이온 증가를 측정한 결과를 도 2에 나타내었다. 패 추출물에 의한 세포 내 칼슘 이온 농도 증가 확인을 위해 5일간 분화한 C2C12 세포에 패 추출물을 처리하여 60분 동안 동안 칼슘 이온의 농도를 확인한 결과, 패 추출물 처리에 의하여 농도 의존적으로 유의한 세포 내 칼슘 이온 농도의 증가가 관찰 되었다.

2.3 제브라피시 배아에서의 독성 테스트 결과

독성이 없는 패 추출물의 농도를 확인하고자 제브라피시 배아에 대해 생존율을 평가하고 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보여지는 바와 같이 100㎍/ml 이하에서 약 90% 이상의 생존율을 보였다.

2.4 제브라피시 배아의 에너지 소비능의 측정 결과

제브라피시 배아의 NADH2 생성을 측정하여 패 추출물의 처리 유무에 따른 에너지 소비능을 측정한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 알 수 있듯이, 패 추출물 처리에 의해 제브라피시 배아의 에너지 소비능이 촉진되었음을 관찰 할 수 있었다. 또한 패 추출물의 에너지 소비 촉진능이 세포내 칼슘 이온에 의한 것인지 여부를 확인하기 위해, 칼슘 이온 킬레이트제인 BAPTA-AM를 단독 및 패 추출물(IO)과 함께 처리한 결과, 패 추출물을 BAPTA-AM와 함께 처리한 경우 에너지 소비능이 촉진되지 않았다. 따라서 제브라피시 배아의 에너지 소비능의 촉진은 패 추출물에 의한 세포 내 칼슘 이온의 농도 상승에 의한 것임을 확인할 수 있었다.

2.5 제브라피시의 혈중 글루코오스 농도 측정 결과

패 추출물(IO)이, 세포 내 칼슘 이온의 농도 상승에 따른, 근수축 등에 필요한 글루코오스 흡수를 유도하는지 확인하기 위해, 알록산 처리에 의해 인슐린 분비가 감소된 제브라피시 성체에 글루코오스를 주입하여 패 추출물에 의한 근육 내로의 글루코오스 유입 유도 여부를 혈중 농도로 확인한 결과를, 도 5에 나타내었다. 에너지원인 글루코오스의 혈중 농도의 감소는 근육 등의 조직으로의 포도당 유입이 지표로 알려져 있다(Diabetes 30 (1981) 1000-1007; Biochemical and Biophysical Research Communications 420 (2012) 576-581; Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (2006) 85-96; Eur. J. Cell Biol. 87 (2008) 337-351).

알록산을 처리한 제브라피시 성체의 혈중 글루코오스는 패 추출물에 의해 유의적으로 감소하였으며, 이러한 효과는 혈당 조절을 위해 시중에서 사용되는 메트포르민(metformin)과 비교하였을 때 유사한 수준로 나타났다.

또한 패 추출물의 글루코오스 유입 유도 효과가 세포 내 칼슘 농도의 상승과 관련이 있는지 확인하기 위해, 칼슘 킬레이트제인 BAPTA-AM을 함께 처리한 결과, 알록산 처리군과 BAPTA-AM 단독 처리군 및 패 추출물과 BAPTA-AM 혼합 처리군 사이에 글루코오스의 농도가 큰 차이가 없음이 관찰되어, 패 추출물에 의해 세포 내 칼슘 농도가 상승함에 따라 제브라피시 성체의 글루코오스 흡수가 촉진되었음을 확인할 수 있었다.

Claims (4)

1. 패 추출물을 유효성분으로 포함하되, 상기 패 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물인, 운동수행능력 개선용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 패 추출물은 50% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 운동수행능력 개선용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 운동수행능력 개선용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 운동수행능력 개선용 조성물.
   
   

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