KR102296975B1

KR102296975B1 - 패 추출물 또는 디플로르에토하이드록시카르마롤을 이용한 노화로 인한 근감소증 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102296975B1
Application number: KR1020210054834A
Authority: KR
Inventors: 전유진; 류보미
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2021-04-28
Filing date: 2021-04-28
Publication date: 2021-08-31

Abstract

본 발명은 근감소증 노화 모델 동물실험에서 노화에 의한 근력 저하나 근육 감소를 개선시키고 근육 단백질의 합성 관련 인자인 Akt, PI3K나 근육 성장 관련 인자인 TRPV4, A1R의 발현을 촉진시키며, 또한 근육 단백질 합성 저해 인자인 Sirt1나 근육 단백질 분해 관련 인자의 MuRF1, Atrogin1의 발현을 억제시키는 등의 활성을 가진 패 추출물 또는 디플로르에토하이드록시카르마롤(Diphlorethohydroxycarmalol)을 이용한 노화로 인한 근감소증 개선용 조성물을 개시한다.

Description

패 추출물 또는 디플로르에토하이드록시카르마롤을 이용한 노화로 인한 근감소증 개선용 조성물{Compostion for Improving Sarcopenia Using an Extract of Ishige okamurae or Diphlorethohydroxycarmalol}

본 발명은 패(Ishige okamurae) 추출물 또는 디플로르에토하이드록시카르마롤(Diphlorethohydroxycarmalol, Cas No 138529-[0001] 04-1, DPHC)을 이용한 노화로 인한 근감소증 개선용 조성물에 관한 것이다.

근육(skeletal muscle)은 정상인의 체중의 약 40~50% 차지하는 우리 몸에서 가장 큰 조직이며, 운동과 호흡, 심장박동 등과 같은 필수적인 기능을 담당한다(Int J Biochem Cell Biol 37:1985-1996, 2005; Pharmacol Rev 61:373-393, 2009; Calcif Tissue Int 96:183-195, 2015). 이처럼 인체의 활동에 중요한 근육의 양은 사람의 경우, 50세 이상이 되면 해마다 1~2%씩 줄어들기 시작하여 80세가 되면 최대 근육량의 약 절반 정도로 그 양이 크게 감소하여 많은 노인들이 근육감소증(sarcopenia) 또는 근위축증(muscle atrophy)을 겪게 되고, 이에 따른 신체기능의 감소, 장애 및 낙상 등으로 인한 삶의 질의 저하가 빈번히 일어나고 있다(Korean J Food and Nutr 4:133-139, 1991; J Nutr 127:990S-991S, 1997; Curr Aging Sci 1:182-191, 2008) 특히 세계적으로 평균수명이 늘고 노인의 비율이 급증함에 따라 근위축은 중요한 노령질환으로 인식되고 있는 상황이다(Curr Opin Clin Nutr Metab Care 13:1-7, 2010).

인체의 근육량은 정상적으로 단백질의 합성과 분해가 균형을 이루어 일정하게 유지되지만 단백질의 분해가 증가하거나 합성이 감소하는 상황이 발생하면 근위축이 일어나게된다. 근위축은 노화, 영양 결핍, 활동 저하 외에도 암, 당뇨, 요독증, 만성폐질환, 심부전 그리고 AIDS 등과 같은 만성 소모성 질환에서 흔히 관찰되지만 패혈증이나 수술, 외상, 화상같은 급성 질환에서도 나타난다(Int J Biochem Cell Biol 37:2156-68, 2005).

근위축의 발생은 근섬유 단백질(myofibrillar protein)들의 분해를 촉진하는 Atrogin-1 및 Murf-1과 같은 단백질 발현의 증가와 근육 관련 단백질 합성에 관여하는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 억제가 관련된 것으로 보고되었다(Am J Physiol Cell Physiol 287:C834-843, 2004) 구체적으로 근위축 현상에서 마이오신(myosin)을 비롯한 근육 단백질들을 분해하는 유비퀴틴-프로테아좀(ubiquitin-proteasome) 시스템이 활성화 되어 근육을 구성하는 단백질들의 분해가 가속화 되고, 한편으로는 근육 관련 단백질 합성에 관여하는 PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로의 활성이 낮아지면서 근육 단백질 합성의 억제가 함께 일어나는 것으로 확인되었다(Proc Natl Acad Sci USA 98:14440-14445, 2001; J Biol Chem 280: 2737-2744, 2005). 따라서 근위축을 효과적으로 저해하기 위해서는 단백질 분해경로에 관련되는 신호전달 경로를 억제할 뿐 아니라, 근육의 양의 증가와 근육세포의 활성에 필수적인 단백질의 생합성에 관련된 신호전달 경로들을 상승조절(up-regulation)하는 것이 필요하다고 할 수 있다.

본 발명은 패 추출물 또는 이로부터 분리한 디플로르에토하이드록시카르마롤(Diphlorethohydroxycarmalol, DPHC)의 노화로 인한 근감소증 개선 활성을 개시한다.

본 발명의 목적은 패 추출물 또는 DPHC를 이용한 노화로 인한 근감소증 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 패 추출물 또는 패 추출물에 분리한 아래 화학식 1의 DPHC(Diphlorethohydroxycarmalol, Cas No 138529-[0001] 04-1)가 근감소증 노화 모델 동물실험에서 노화에 의한 근력 저하나 근감소증을 개선시키고 근육 단백질의 합성 관련 인자인 Akt, PI3K나 근육 성장 관련 인자인 TRPV4, A1R의 발현을 촉진시키며, 또한 근육 단백질 합성 저해 인자인 Sirt1나 근육 단백질 분해 관련 인자의 MuRF1, Atrogin1의 발현을 억제시킴을 확인함으로써 완성된 것이다.

<화학식 1>

전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 패 추출물 또는 상기 <화학식 1>의 화합물인 DPHC를 유효성분으로 포함하는 노화로 인한 근감소증 개선용 조성물로 파악할 수 있다.

본 명세서에서, "패 추출물"이란 추출 대상인 패의 줄기, 잎, 열매, 꽃, 뿌리, 지하부, 지상부 또는 이들의 혼합물을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물, 더 바람직하게는 추출용매로서 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물을 의미한다.

또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, "노화로 인한 근감소증 개선"은 노화로 인한 근력 감소 회복이나 노화로 인한 근육의 감소의 회복을 의미한다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 구체적 용도, 제형, 제품 형태 등에 따라 의도하는 노화로 인한 근력 감소 개선 활성, 노화로 인한 근육 감소의 개선 활성 등을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 노화로 인한 근력 감소의 개선 효과 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구르트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.

또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따른 건강기능식품이거나, 한국 「식품위생법」의 식품공전(식약처 고시 「식품의 기준 및 규격」)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 「식품위생법」임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 「식품첨가물 기준 및 규격」)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.

감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 댓잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔 형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산 칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화 크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.

약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 "대한민국약전"을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유, 에탄올, 글리세롤 등을 들 수 있다. 제제화할 경우 필요에 따라적절한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 희석제 등을 포함시킬 수 있다. 적절한 결합제로서는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 글루코스, 옥수수 감미제, 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 들 수 있고, 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염, 폴리데틸렌글리콜 등을 들 수 있으며, 붕해제로서는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄검, 전분, 알긴산 또는 그것의 소듐 염 등을 들 수 있다. 또 희석제로서는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스, 글라이신 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 수성 등장 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 담체로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.

약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 패 추출물 또는 DPHC를 이용한 노화로 인한 근감소증 개선용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품(특히 건강기능식품) 또는 약품으로 제품화될 수 있다.

도 1은 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC이 몸무게, 제지방 무게(근육 무게) 등에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 2는 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC이 다리 근육에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 3은 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC이 악력과 지구력에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 4는 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC이 비복근의 중량과 두께에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 5는 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC이 비복근의 단백질 합성과 분해 관련 인자의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 6은 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC이 비복근의 근육 성장 촉진과 저해 관련 인자의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 7은 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC이 비복근의 근육 약화 유도 인자의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 8은 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC이 비복근의 염증 관련 인자의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 9는 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC이 가자미근의 중량과 두께에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 10은 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC이 가자미근의 단백질 합성과 분해 관련 인자의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 11은 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC이 가자미근의 근육 성장 촉진과 저해 관련 인자의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 12는 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC이 가자미근의 근육 약화 유도 인자의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 13은 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC이 가자미근의 염증 관련 인자의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 14는 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC이 근감소증 바이오마커인 LDH(Lactate dehydrogenase)의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예> 패 추출물 및 DPHC의 준비

제주도 서귀포시 성산읍에서 채집한 패(ishige okamurae, IO)를 제염 및 건조하고, 여기에 10배 중량의 50% 에탄올(주정)을 가하여 24시간 실온에서 추출한 후 여과하고 추출용매를 제거하여 패 추출물을 제조하였다.

또 DPHC(Diphlorethohydroxycarmalol, Cas No 138529-04-1)는 본 발명자들이 패(ishige okamurae, IO)에서 분리·동정하여 자체 보관하고 있던 것을 실험에 사용하였다.

<실시예> 패 추출물 또는 DPHC의 노화에 의한 근감소증 개선 활성 실험

1. 실험 방법

1.1 근감소증 노화 모델과 그 실험군 설정

14개월 된 B6 마우스 (사람 나이로 50세 중후반, female)를 아래와 같이 4 그룹으로 나누어서 악력과 지구력을 측정하고 각 그룹의 몸무게, 근육, 다리 근육, 비복근, 가자미근의 무게, 근육 합성이나 분해 등 관련 인자의 mRNA 발현 정도를 측정하는 실험을 수행 하였다.

① 제1 그룹(Saline 투여군): 살린(saline) 을 28일간 1회/1일 투여시킨 그룹.

② 제2그룹(패 추출물 100 mg/Kg/day 투여군): 패 추출물 (100 mg/Kg/day)을 28일간 1회/1일 투여한 그룹.

③ 제3그룹(DPHC 2.5 mg/Kg/day 투여군): DPHC (2.5 mg/Kg/day)을 28일간 1회/1일 투여한 그룹.

④ 제4그룹(Decanoate 5 mg/Kg/day 투여군): 대조 약물로서 경구용 근육 증가 스테로이드제인 데카노에이트(Decanoate) (5 mg/Kg/day)을 28일간 1회/1일 투여한 그룹.

1.2 몸무게 및 근육 무게의 측정

28일의 시험을 수행한 후, 활용된 동물의 몸무게를 재고, 희생시켜 총 근육을 채취하여 그 무게를 재었다.

1.3 악력의 측정

Grip strength meter를 이용하여 앞다리의 측정은 동물이 발가락으로 bar를 잡게 하여 확실히 잡은 것을 확인한 후, 동물의 꼬리 기시부위를 잡고 몸체를 수평으로 유지하여 일정속도(초당 2.5 cm)로 당겨 bar를 놓는 시점의 gauge에 표시된 수치를 기록하였다. 후지(後肢)의 측정은 동물의 배부 부위를 잡고 꼬리방향으로 당겨 위와 같은 방법으로 실시하였다. 뒷다리와 앞다리를 각각 3회씩 측정하여 기록하고 평균치를 평가하였다.

1.4 지구력 측정(Ladder climbing)

각 동물의 몸무게에 해당하는 추를 꼬리에 달아 사다리를 타서 끝까지 올라가는데 소요되는 시간을 측정하였다. 각각 3회씩 측정하여 기록하고 평균치를 평가하였다.

1.5 비복근과 가자미근의 중량과 두께의 측정

희생된 동물의 다리 근육 중 비복근과 가자미근을 채취하여 그 무게를 재고 가장 두꺼운 두께의 지름을 여러번 재어 평균치를 활용하였다.

1.6 mRNA 발현 정도 측정

막대사발을 이용하여 잘게 부순 근육조직에 트라이졸(Trizole) 1.0ml을 첨가하고, 실온에서 10분간 방치한 후, 0.2ml의 크로로포름을 첨가하고 15초 동안 강하게 볼텍싱하여 완전히 용해(Lysis)시켰다. 이를 실온에서 10분간 방치한 다음, 14,000 xg, 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 다음, 0.5ml 아이소프로필 알코올을 첨가하고 실온에서 10분간 방치한 후, 14,000 x g, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 제거 후, 1.0ml의 75% 알코올로 펠렛을 세척한 후 DEPC 처리된 멸균 증류수 30㎕을 넣어 펠렛을 녹인 뒤 이후의 시험에서 사용하였다.

분리한 각각의 RNA를 주형으로 PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit 을 이용하여 제조사의 지침에 따라 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA를 주형으로 하여 실시간 중합효소연쇄반응을 다음과 같이 수행하였다. 올리고뉴클레오티드와 SYBR Green I 이 포함하여 95℃에서 30초간 변성 과정, 58 ℃에서 30초간 어닐링 과정, 72℃에서 30초간 신장 과정의 조건으로 실시간 중합효소연쇄반응 수행하였다.

1.7 통계처리

그룹간 유의성 검증에는 크루스칼-왈리스 테스트(Kruskal-Wallis test)와 만-휘트니 유 포스트-혹 테스트(Mann-Whitney U post-hoc test)를 이용하였으며, SPSS version 22 소프트웨어(IBM Corporation, Armonk, NY, USA)를 이용하여 유의성을 산출하였다($$ p<0.01, $ p<0.05).

2. 실험 결과

2.1 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC가 근육 무게 및 다리 근육 두께에 미치는 영향

근감소증 노화 모델에서 패 추출물, DPHC 투여에 따른 몸무게, 지방 무게(Fat mass)와 제지방 무게(Lean mass)의 무게 변화를 확인하였다. 그 결과 각 그룹간의 몸무게의 변화는 유의적이지 않았다. 다만, 시료를 투여한 그룹에서 지방 무게가 다소 감소하고 제지방무게가 증가하는 경향을 보였으나 유의적인 결과는 아닌 것으로 나타났다(도 1).

그러나 다리 근육의 두께는 패 추출물, DPHC 및 대조 약물 투여 그룹에서 개선 효과를 보였다(도 2).

2.2 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC가 악력과 지구력에 미치는 영향

패 추출물, DPHC 투여로 인해 노화로 인한 외형적 근육 변화와 더불어 근력 감소에도 영향을 미치는지 확인하기 위하여 악력과 지구력을 확인한 결과, 노화에 의해 저하된 악력 (grip strength)과 지구력 (ladder climbing)이 시료와 대조 약물 투여 그룹에서 유의적으로 증가됨을 확인하였다(도 3). 이에 따라 이에 따라 패 추출물 또는 DPHC 투여로 노화로 의한 악력과 지구력의 저하를 유의적으로 억제시켜 근력의 손실을 막을 수 있음을 확인하였다.

2.3 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC가 비복근에 미치는 영향

근감소증 노화 모델에서 시료인 패 추출물, DPHC 투여에 의한 근력 손실의 회복은 비복근의 무게와 두께 변화에서도 관찰되었다. 비복근은 강한 힘 즉, 악력을 낼때 사용하는 근육이다. 노화에 의해 감소된 비복근의 무게 및 두께가 시료 및 대조 약물을 투여한 모든 그룹에서 유의적인 개선 효과가 확인되었다(도 4).

또한, 근감소증 노화 모델에서 비복근의 단백질 합성 관련 인자인 Akt, PI3K의 mRNA 발현 수준과 분해 관련 인자인 MuRF1, Atrogin1의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 확인한 결과, 패 추출물, DPHC를 투여한 그룹에서 유의적으로 비복근 단백질 합성 인자의 mRNA의 발현이 증가하고, 분해 관련 인자의 mRNA의 발현이 감소함을 확인하였다(도 5). 이에 따라, 노화에 의해 저하된 비복근 단백질 합성 촉진과 분해 억제가 패 추출물, DPHC 투여에 의해 개선될 수 있음을 확인하였다.

또한, 근감소증 노화 모델에서 비복근의 근육 성장 촉진 관련 인자인 TRPV4, A1R의 mRNA 발현 수준과 저해 관련 인자인 Sirt1의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 확인한 결과, 패 추출물, DPHC를 투여한 그룹에서 유의적으로 비복근 근육 성장 촉진 관련 인자의 mRNA의 발현이 증가하고, 저해 관련 인자의 mRNA의 발현이 감소함 확인하였다(도 6). 이에 따라, 노화에 의해 저하된 비복근 근육 성장 촉진과 저해 억제가 패 추출물, DPHC 투여에 의해 개선될 수 있음을 확인하였다.

그리고, 근감소증 노화 모델에서 비복근의 근육섬유 성장과 분화의 negative 인자로서 근육의 약화를 유도하는 Myostatin, TGF-β, GPX4, iNOS의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을 확인한 결과, 패 추출물 및 DPHC를 투여한 그룹에서 관련 mRNA의 발현을 유의적으로 감소시킴을 확인하였다(도 7). 이에 따라, 패 추출물 및 DPHC 투여에 의해 노화로 인해서 비복근에서 과도하게 분비되는 근섬유 약화 유도인자들을 억제하여 불필요한 근손실을 억제할 수 있음을 확인하였다.

또한, 근감소증 노화 모델에서 비복근의 염증 관련 인자들의 변화에 대해 관찰하였다. 근감소증 노화 모델에서 과도하게 증가된 비복근의 염증 관련 인자인 IL-1β와 TNF-α의 mRNA의 발현이 패 추출물 및 DPHC를 투여한 그룹에서 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 8).

이상과 같이 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC에 의해 비복근의 유의적인 개선을 유도함에 따라 노화에 의한 근감소증의 개선이 가능할 것으로 확인되었다.

2.4 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC가 가자미근에 미치는 영향

근감소증 노화 모델에서 지근인 가자미근에 있어서도 패 추출물 및 DPHC의 투여에 의해 중량과 두께의 유의적인 변화가 관찰되었다. 가자미근의 몸의 균형 및 지구력을 요할때 사용하는 근육이다. 노화에 의해 감소된 가자미근의 두께는 시료 및 대조 약물을 투여한 모든 그룹에서 유의적인 개선 효과가 확인되었다(도 9). 이러한 결과는 노화에 의한 가자미근의 저하를 패 추출물 또는 DPHC가 억제시킬 수 있음을 시사한다.

또한, 근감소증 노화 모델에서 가자미근의 단백질 합성 관련 인자인 Akt, PI3K의 mRNA 발현과 분해 관련 MuRF1, Atrogin1의 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, 패 추출물 및 DPHC를 투여한 그룹에서 유의적인 가자미근 단백질 합성 관련 인자의 mRNA 발현은 증가하고 분해 관련 인자의 mRNA 발현은 감소함이 확인되었다(도 10). 이에 따라, 노화에 의해 저하된 가자미근 단백질 합성 촉진과 분해 억제가 패 추출물, DPHC 투여에 의해 개선될 수 있음을 확인하였다.

또한, 근감소증 노화 모델에서 가자미근의 근육 성장 촉진 관련 인자인 TRPV4, A1R의 mRNA 발현과 저해 관련 인자인 Sirt1의 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, 패 추출물 및 DPHC를 투여한 그룹에서 유의적인 가자미근 근육 성장 촉진 관련 인자의 mRNA 발현이 촉진되고, 저해 관련 인자의 mRNA 발현이 억제됨이 확인되었다(도 11). 이에 따라, 노화에 의해 저하된 가자미근 근육 성장과 저해능이 패 추출물, DPHC 투여에 의해 개선될 수 있음을 확인하였다.

그리고, 근감소증 노화 모델에서 가자미근의 근육 섬유 성장과 분화의 negative 인자로서 근육의 약화를 유도하는 Myostatin, TGF-β, GPX4, iNOS의 mRNA에 미치는 영향을 확인한 결과, 패 추출물 및 DPHC를 투여한 그룹에서 관련 인자의 mRNA의 발현이 유의적으로 감소됨을 확인하였다(도 12). 이에 따라, 패 추출물 및 DPHC 투여에 의해 노화로 인해서 비복근에서 과도하게 분비되는 근섬유 약화 유도 인자들을 억제하여 불필요한 근손실을 억제할 수 있음을 확인하였다.

또한 근감소증 노화 모델에서 가자미근의 염증 관련 인자들의 변화에 대해 관찰하였다. 노화에 의해 과도하게 증가된 가자미근의 염증 관련 인자인 IL-1β와 TNF-α의 mRNA의 발현이 패 추출물 및 DPHC를 투여한 그룹에서 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 13).

이상과 같이 패 추출물 및 DPHC에 의해 악력에 영향을 미치는 지근인 가자미근의 유의적인 개선을 유도함에 따라 노화에 의한 근감소증의 개선이 가능할 것으로 확인되었다.

2.5. 근감소증 노화 모델에서 패 추출물 및 DPHC가 근감소증 바이오마커에 미치는 영향

혈액내 근력 및 근소모 바이오마커인 LHD(Lactate dehydrogenase)의 mRNA 발현 정도를 확인한 결과, 근감소증 노화 모델에서 근력의 평가 지표인 LHD가 패 추출물 및 DPHC에 의해 유의적으로 증가한 것이 관찰되었다(도 14).

Claims

패(ishige okamurae) 추출물 또는 디플로르에토하이드록시카르마롤(Diphlorethohydroxycarmalol)을 유효성분을 포함하는 노화로 인한 근감소증 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻은 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는조성물.