KR102011747B1 - 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물을 이용한 근육 성장 또는 운동 능력 개선용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HS(horse serum)로 분화 유도된 마우스 유래 근원세포(myoblast)인 C2C12에 세포독성을 보이지 않으면서 C2C12의 증식을 촉진하고, 근육 등에서의 에너지 저장 형태인 크레아틴인산 생성에 관여하는 세포 내 크레아틴 키나아제 활성을 증가시키며, 근육 수축에 필요한 ATP를 합성하는데 쓰이는 글리코겐의 레벨을 높일 뿐만 아니라, 근육 성장을 저해하는 인자인 p-Smad2/3과 Smad4의 발현을 억제하고, 근육 성장을 유도하는 인자인 p-Akt, p-FoxO 및 MyoD의 발현을 촉진하는 것으로 확인된, 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물을 이용한 근육 성장 또는 운동 능력 개선용 조성물을 개시한다.

Description

빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물을 이용한 근육 성장 또는 운동 능력 개선용 조성물{Composition for Increas of Muscle Growth or Improvement of Exercise Performance Using Alcalase Hydrolysates of Hippocampus abdominalis}
본 발명은 빅벨리해마(Hippocampus abdominalis) 가수분해물을 이용한 근육 성장 또는 운동 능력 개선용 조성물에 관한 것이다.
근육은 에너지 대사 및 운동 능력에 있어서 매우 중요한 기관이다. 운동선수들은 자신의 운동 능력을 향상시키기 위하여 근육을 성장시키고, 이를 위하여 규칙적인 생활습관 및 운동뿐만 아니라 근육성장 보조제를 섭취한다. 근육성장 보조제는 동화작용제(Anabolic steroids)를 포함하고 있는데, 이는 남성 호르몬인 테스토스테론(testosterone)의 유도체로서 근육을 강화시키는 아나볼릭(anabolic) 효과와 남성 호르몬의 역할을 수행하는 안드로젠 효과(androgenic effect)를 가지고 있는 합성 스테로이드 호르몬이다. 동화작용제(Anabolic steroids)는 체내의 단백질 합성 증가를 통해 근육과 뼈를 강화시킨다. 그러나 동화작용제(Anabolic steroids)를 과다하게 복용할 경우 간종양, 내분비 기능 장애, 황달 등의 부작용을 유발시킬 수 있다. 따라서, 최근에는 천연 화합물을 이용한 근육 성장 소재를 개발하기 위한 연구가 대두되고 있다. 사과껍질 성분인 우르솔산(ursolic acid)과 로즈마리에서 얻은 carnosic acid가 근육 성장을 유도한다고 알려져있다. 그러나, 해양생물을 이용한 근육 성장에 대한 연구는 미비한 실정이다.
근육 성장은 여러 가지 신호 경로에 의해서 일어나며, 그 중에서 대표적으로 두 가지의 신호 경로를 통해 발생한다. 첫 번째는 근육 성장을 저해하는 신호 경로로서, TFG-β(Transforming growth factor beta) protein family인 MSTN(myostatin)이 activin type IIB receptor에 결합하게 되면 Smad2/3가 인산화되어 Smad4와 결합체를 이루고 이 결합체는 핵 내의 근육 성장 인자 발현을 억제하여 근육 성장을 저해하게 된다. 반면, 인슐린유사성장인자인 insulin-like growth factor 1(IGF-1)은 근육 성장의 양성 조절자로 phosphoinositide 3-kinase/Akt 경로의 인산화를 통해 myostatin과 같이 근육 성장을 억제시킬 수 있는 전사 인자들의 신호 전달을 억제시켜서 근육 크기를 조절한다. IGF-1이 IGF-1 receptor에 결합함으로써 Akt와 FoxO의 인산화를 과발현을 유발하여 근육양을 증가시킨다. 또한, MyoD는 근육 성장 전사 인자로서, 근육세포가 분화하면서 과발현된다.
빅벨리해마(Hippocampus abdominalis)는 큰가시고기목(Syngnathiformes), 실고기과(Sygnathidae)에 속하며 온대와 열대해역에 서식하고 해마들 중에서도 크기가 가장 크고 아름다운 체색과 체형을 지니고 있어 관상가치가 높아 국제 해수 관상생물 시장에서도 인기가 많다. 이미 뉴질랜드, 호주, 중국에서 해마 양식이 시도되었고, 최근 제주에서는 식용으로 지정된 빅벨리해마의 완전 양식이 성공하였다. 하지만 이전에 많은 생리활성 연구가 진행된 북해마(Hippocampus kuda Bleeker), 갈귀해마(Hippocampus guttulatus), Shortsnouted seahorse(Hippocampus hippocampus) 종 등에 비해 빅벨리해마는 생리활성 연구가 많이 부족한 상황이다.
많은 연구자들이 어류의 살이나 비늘 성분, 혹은 돼지와 같은 포유동물의 껍질로부터 젤라틴과 젤라틴펩티드를 다양한 추출기법을 이용하여 추출함으로 추출효율을 높이고자 노력하고 있다. 뿐만 아니라, 수용성 성분들과 저분자량으로 성분을 가수분해할 수 있는 효소적 추출기법은 환경적으로 유익하고, 저비용과 상당히 높은 추출효율을 이끈다는 점에서 다양한 천연 소재의 연구와 개발에서 이용되고 있다. 효소 가수분해는 세포벽에 있는 섬유질이나 당단백질 혹은 알긴산 고분자물질 등을 분해시키는 작용을 하여 활성물질들이 원활이 추출될 수 있도록 유도하는 작용을 한다. 여러 가지 효소 중 프로테아제(Protease)의 일종인 알칼레이즈(Alcalase)는 다양한 식품 및 산업용 단백질 분해효소 중에서 가격이 저렴하고 가수분해 수율이 높아 산업적으로 자주 이용되고 있다.
본 발명은 빅벨리해마의 알칼레이즈 효소 가수분해물이 높은 수율로 얻어지고 근육 성장 효과를 가짐을 개시한다.
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본 발명의 목적은 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물을 이용한 근육 성장 또는 운동 능력 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명자들은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물이 HS(horse serum)로 분화 유도된 마우스 유래 근원세포(myoblast)인 C2C12에 세포독성을 보이지 않으면서 C2C12의 증식을 촉진하고, 근육 등에서의 에너지 저장 형태인 크레아틴인산 생성에 관여하는 세포 내 크레아틴 키나아제 활성을 증가시키며, 근육 수축에 필요한 ATP를 합성하는데 쓰이는 글리코겐의 레벨을 높일 뿐만 아니라, 근육 성장을 저해하는 인자인 p-Smad2/3과 Smad4의 발현을 억제하고, 근육 성장을 유도하는 인자인 p-Akt, p-FoxO 및 MyoD의 발현을 촉진함을 확인하였다. 상기 마우스 유래 근원세포인 C2C12는 단핵세포로 HS(horse serum) 등에 의하여 분화하여 융합을 통해 다핵의 근관(myotube)을 형성한다(Cells Tissues Organs. 2000;167(2-3):130-7).
전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 일 측면에 있어서 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 근육 성장 또는 운동 능력 개선용 조성물로 파악할 수 있고, 다른 측면에 있어서는 근육 감소를 수반하는 질환의 개선용 조성물로 파악할 수 있다.
본 명세서에서, "빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물"은 빅벨리해마를 프로테아제의 일종인 알칼레이즈로 가수분해하여 얻어진 효소 처리물로 아미노산 및/또는 펩타이드를 포함하는 물질군을 의미한다. 이러한 효소 처리물은 그대로 또는 원심분리 후 상등액을 취하여 이용되거나, 효소 처리물 그대로 또는 그 상등액을 감압농축 및/또는 동결건조시켜 액상 또는 분말상으로 이용되거나, 효소 처리물 그대로 또는 그 상등액을 물이나 에탄올 등의 유기용매로 추출하거나, 그 추출물을 극성이 서로 다른 유기용매를 사용하여 분획하거나, 그 추출물 또는 분획물을 농축하여 이용될 수 있다. 여기서 유기용매는 에탄올을 포함한 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있다.
또 본 명세서에서, "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또 본 명세서에서, "근육 감소를 수반하는 질환"은 노화성 근감소증(age related sarcopenia), 근이영양증(muscle dystrophy), 근위축증(muscle atrophy), 동작 뉴런 질병, 대사성 근육 질병, 염증성 근병증, 신경근 접합부 질병, 내분비성 근병증 등을 포함하는 의미이다.
또 본 명세서에서, "근육 감소를 수반하는 질환 개선"은 해당 질환의 예방과 치료를 포함하는 의미로 해당 질환의 발병 억제, 지연, 증상의 경감 등을 의미한다.
본 발명의 조성물은 그 유효성분을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 근육 성장 효과, 운동 능력 개선 효과, 근육 감소를 수반하는 질환의 개선 효과 등을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 근육 성장 효과, 운동 능력 개선 효과, 근육 감소를 수반하는 질환의 개선 효과 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분 이외에, 근육 성장 효과, 운동 능력 개선 효과 등의 상승·보강 등을 위하여 또는 피로 개선 활성 등 유사활성의 부가를 통한 복용이나 섭취의 편리성을 증진시키기 위하여, 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 "대한민국약전"), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 "건강기능식품 기준 및 규격"임) 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 "약사법"임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조·판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 「건강기능식품에관한법률」임)에 따라 기능성이 인정된 화합물 또는 추출물이 포함된다. 예컨대 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따라 '운동 수행 능력 향상'으로 기능성이 인정된 마카 젤라틴화 분말, 크레아틴, 헛개나무 과병 추출 분말, 동충하초 발효 추출물 등과, '피로 개선'으로 기능성이 인정된 발효 생성 아미노산 복합물, 헛개나무 과병 추출물, 홍경천 추출물 등이 이러한 화합물 또는 추출물에 해당할 것이다.
이러한 화합물 또는 천연 추출물은 본 발명의 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다. 본 발명의 조성물이 식품 조성물로 파악될 경우 그 용도는 피부 과민 반응 억제 또는 과민 반응 억제로 이해될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구르트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.
또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따른 건강기능식품이거나, 한국 「식품위생법」의 식품공전(식약처 고시 「식품의 기준 및 규격」)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 「식품위생법」임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 「식품첨가물 기준 및 규격」)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.
감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.
보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.
점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.
그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산 칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화 크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.
약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 "대한민국약전"을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유, 에탄올, 그리세롤 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라적절한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 희석제 등을 포함시킬 수 있다. 적절한 결합제로서는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페리스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 글루코스, 옥수수 감미제, 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 들 수 있고, 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염, 폴리데틸렌글리콜 등을 들 수 있으며, 붕해제로서는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 검, 전분, 알긴산 또는 그것의 소듐 염 등을 들 수 있다. 또 희석제로서는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스, 글라이신 등을 들 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 수성 등장 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 담체로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.
약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물을 이용한 근육 성장 또는 운동 능력 개선용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 식품, 약품 등으로 제품화될 수 있다.
도 1은 세포 독성 평가 결과이다.
도 2는 세포 증식 평가 결과이다.
도 3은 세포 내 크레아틴 키나아제 활성 평가 결과이다.
도 4는 세포 내 글리코겐 레벨의 평가 결과이다.
도 5 내지 도 10는 근육 성장 저해 인자인 p-Smad2/3 및 Smad4와 근육 성장 유도 인자인 p-Akt, p-FoxO 및 MyoD를 정량한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예> 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물의 근육 성장 활성 평가
1. 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물의 제조 및 실험방법
1.1 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물의 제조
빅벨리해마(Hippocampus abdominalis)는 (주)해천마(제주)로부터 양식 종을 제공 받았으며, 내장을 포함한 해마 전체를 동결건조한 후 곱게 갈아 1g을 취한 후, 100mL 증류수에 섞고, 알칼레이즈(Alcalase 2.4L FG, Novozyme Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)의 최적 활성 조건(pH 8.0, 50℃)에서 1%(w/w)의 기질 대 효소비로 효소 가수분해를 수행하였다. 가수분해 반응 후 효소 불활성화를 위해 100℃에서 10분간 끓이고, 원심분리(3,500 rpm, 10분) 및 감압여과를 수행하여 상층액을 분리한 후 이를 동결건조하여 실험에 사용하였다(얻어진 가수분해물을 편의상 HAA라 함).
1.2 수율 및 단백질 함량 평가
HAA의 수율은 HAA의 일부의 무게를 100℃ 드라이오븐에서 수분을 제거한 나머지 고형분 함량을 기준으로 측정하였다. HAA의 총 단백질 함량은 PierceTM BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 측정하였으며, 단백질의 정량의 표준물질은 BSA를 사용하였다.
1.3 근육 성장 활성 평가
1.3.1 근원세포 배양
마우스 유래 근원세포인 C2C12 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 세포를 10% FBS(Corning Incorporated, NY, USA) 와 1% antibiotics(Gibco-BRL, Burlington, Ont, Canada)를 함유한 DMEM(Gibco-BRL, Burlington, Ont, Canada) 배지에 현탁하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
1.3.2 근원세포 분화 유도
C2C12 세포를 48 well plate에 각 well 당 5 × 104 cells을 동일하게 분주하고 48시간 동안 배양하여 plate에 80% 차지하였을 때 분화를 유도하였다. 분화 유도는 6일 동안 2일 간격으로 2% horse serum(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 및 1% antibiotics를 함유한 DMEM 배지로 교체하면서 시행하였다.
1.3.3 세포 독성 평가
C2C12 세포를 48 well plate에 각 well 당 5 × 104 cells을 동일하게 분주하고 16시간 경과 후, HAA를 처리하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 이후 100㎕의 MTT 용액(2 mg/mL)을 각 well에 첨가하여 4시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 반응시켰다. 이후 상층액을 완전히 제거하고 DMSO를 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 살아있는 세포의 양을 측정하였였다.
1.3.4 세포 증식 효능 평가
C2C12 세포를 48 well plate에 각 well 당 5 × 104 cells을 동일하게 분주하고 48시간 동안 배양하여 plate에 80% 차지하였을 때 상기와 동일한 방법으로 분화를 유도하였다. 분화 유도하는 C2C12 세포에 분화 배지로 교체할 때 HAA를 처리하였다. 세포 증식은 5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU)를 처리한 후 면역조직화학염색법(BrdU assay)(Millipore, Billerica, MA, USA)를 통하여 확인하였다.
1.3.5 세포 내 생화학적 지표 평가
C2C12 세포를 48 well plate에 각 well 당 5 × 104 cells을 동일하게 분주하고 48시간 동안 배양하여 plate에 80% 차지하였을 때 상기와 동일한 방법으로 분화를 유도하였으며 분화 유도하는 C2C12 세포에 분화 배지로 교체할 때 HAA를 처리하였다.
골격근에서 발견되는 효소인 크레아틴 키나아제(creatine kinase)는 크레아틴(creatine)과 ATP에 의하여 크레아틴인산(creatine phosphate)을 생성하는 반응을 촉매하는 효소로 Creatine Kinase Activity Colorimetric Assay Kit (BioVision, Inc., Milpitas, California)를 통하여 확인하였다.
골격근에서 근육 수축에 필요한 ATP를 합성하는데 쓰이는 글라이코겐(glycogen)은 Glycogen Assay Kit(Abcam, Cambridge, MA, USA)를 통하여 확인하였다.
1.3.6 세포 내 근육성장 조절 인자 발현 평가
근육성장 조절 인자는 p-Smad2/3, Smad4, p-Akt 및 MyoD의 발현량을 western blot을 통하여 분석하였다. C2C12 세포를 6 well plate에 각 well 당 5 × 104 cells을 동일하게 분주하고 48시간 동안 배양하여 plate에 80% 차지하였을 때 상기와 같은 방법으로 분화를 유도하였다. 분화 유도하는 C2C12 세포에 분화 배지로 교체할 때 HAA를 처리하였다. 이후 상층액을 모두 제거하고 세포를 회수하여 lysis buffer[50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)]로 세포 내 단백질을 용해하였다. PierceTM BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 통해 단백질 정량 후 동일한 단백질 양을 SDS-PAGE에 loading 하여 크기에 따라 분리한 뒤 nitrocellulose membrane으로 transfer 하였다. membrane에 p-Smad2/3, Smad4, p-Akt 및 MyoD의 1차 항체를 반응시킨 후 2차 항체를 결합시켜 western blotting detection solution(Cyanagen, Bologna, Italia)를 사용한 chemiluminescence 방법을 통하여 단백질의 발현량을 가시화하였다.
1.3.7 통계 분석
실험결과의 통계처리는 각각의 시료에 대한 평균 ± 표준편차로 나타내었다. SPSS 프로그램(SPSS Inc. Ver. 12.0)을 사용하여 One-way ANOVA-test를 실시하여 조사 항목들간의 유의성 검증은 Turkeys multiple range test로 실시함. P-value는 control 군과 비교하여 *; p<0.05, **; p<0.005로 나타내었다.
2. 결과
2.1 수율 평가
알칼레이즈(Alcalase) 가수분해물(HAA)의 수율을 확인하기 위하여, DW 추출물(HAD)의 수율과 비교한 결과, HAD의 추출 수율은 약 37.45%이고, HAA의 추출 수율은 약 78%로 알칼레이즈(Alcalase) 가수분해를 통해 추출 수율이 약 40% 증가함을 확인하였다(표 1).
Figure 112017044991267-pat00001
2.2 단백질 함량 평가
알칼레이즈(Alcalase) 가수분해물(HAA)의 단백질 함량을 확인하기 위하여, DW 추출물의 단백질 함량과 비교한 결과, DW 추출물(HAD)의 단백질 함량은 약 9.3%이고, HAA의 단백질 함량은 약 17.9%로 알칼레이즈(Alcalase) 가수분해를 통해 단백질 함량이 약 8% 증가함을 확인하였다(표 2).
Figure 112017044991267-pat00002
2.3 세포 독성 평가
세포 독성 평가 결과를 시료 무처리군 대비 세포 생존율을 백분율로 구하여 도 1에 나타내었는데, 특별한 세포독성을 나타내지 않았다.
2.4 세포 증식 평가
세포 증식 평가 결과를 시료 무처리군 대비 세포 생존율을 백분율로 구하여 도 2에 나타내었다. 빅벨리해마 효소 가수분해물은 농도 의존적으로 유의성 있게 세포 증식을 촉진하였다.
2.5 생화학적 지표 활성 평가
2.5.1 Creatine Kinase Activity 평가
시료 무처리군의 Creatine Kinase Activity를 1로 하였을 때의 결과를 도 3에 나타내었다. 300㎍/mL의 HAA를 처리하였을 때, 유의적으로 세포 내 Creatine Kinase Activity가 증가함을 확인하였다.
2.5.2 Glycogen level 평가
시료 무처리군의 Glycogen level을 1로 하였을 때의 결과를 도 4에 나타내었다. 100㎍/mL, 200㎍/mL 및 300㎍/mL의 HAA를 처리하였을 때, 유의적으로 세포 내 Glycogen level이 증가함을 확인하였다.
2.6 성장 조절 인자 발현 평가
2.6.1 p-Smad2/3의 발현 평가
시료 무처리군의 p-Smad2/3의 발현량을 1로 하였을 결과를 도 5에 나타내었다. 100㎍/mL, 200㎍/mL 및 300㎍/mL의 HAA를 처리하였을 때, 유의적으로 세포 내 p-Smad2/3의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
2.6.2 Smad4의 발현 평가
시료 무처리군의 Smad4의 발현량을 1로 하였을 때의 결과를 도 6에 나타내었다. 100㎍/mL 및 200㎍/mL의 HAA를 처리하였을 때, 유의적으로 세포 내 Smad4의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 그리고 300㎍/mL의 HAA를 처리하였을 때, 시료 무처리군과 유의적인 차이를 보이지 않음을 확인하였다.
2.6.3 p-Akt의 발현 평가
시료 무처리군의 p-Akt의 발현량을 1로 하였을 때의 결과를 도 7에 나타내었다. 100㎍/mL 및 200㎍/mL의 HAA를 처리하였을 때, 유의적으로 세포 내 p-Akt의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
2.6.4 p-FoxO의 발현 평가
시료 무처리군의 p-FoxO의 발현량을 1로 하였을 때의 결과를 도 8에 나타내었다. 100㎍/mL의 HAA를 처리하였을 때는 무처리군과 유의적인 차이를 보이지 않으나 200㎍/mL 및 300㎍/mL의 HAA를 처리하였을 때, 유의적으로 세포 내 p-FoxO의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
2.6.5 MyoD의 발현 평가
시료 무처리군의 MyoD의 발현량을 1로 하였을 때의 결과를 도 9에 나타내었다. 100㎍/mL, 200㎍/mL 및 300㎍/mL의 HAA를 처리하였을 때, 유의적으로 세포 내 MyoD의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

Claims (4)

  1. 빅벨리해마의 알칼레이즈 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 근육 성장용 식품 조성물.
  2. 빅벨리해마의 알칼레이즈 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 운동 능력 개선용 식품 조성물.
  3. 빅벨리해마의 알칼레이즈 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 근육 감소를 수반하는 질환의 개선용 약제학적 조성물로서,
    상기 질환은 노화성 근감소증(age related sarcopenia), 근이영양증(muscle dystrophy), 근위축증(muscle atrophy), 동작 뉴런 질병, 대사성 근육 질병, 염증성 근병증, 신경근 접합부 질병 또는 내분비성 근병증인 것을 특징으로 하는 조성물.

  4. 삭제
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74 해마과(실고기과)에 속하는 해마(Hippocampus), 현대한의학의 눈으로 읽기! (네이버 블로그, https://blog.naver.com/lefhod0706/220264635097) (2015.02.06.)
강나래 외 3명, ‘Anti-fatigue activity of a mixture of seahorse(Hippocampus abdominalis) hydrolysate and re ginseng’, Fisheries and Aquatic Science 20:3, 2017.3.17.*

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