KR102008621B1 - 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물의 분획물 또는 그 유효 펩타이드를 이용한 근육 성장 또는 운동 능력 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물의 분획물 또는 그 유효 펩타이드를 이용한 근육 성장 또는 운동 능력 개선용 조성물을 개시한다.

Description

빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물의 분획물 또는 그 유효 펩타이드를 이용한 근육 성장 또는 운동 능력 개선용 조성물{Composition for Increas of Muscle Growth or Improvement of Exercise Performance Using Fractions of Alcalase Hydrolysates of Hippocampus abdominalis, or Effective Peptides Thereof}

본 발명은 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물의 분획물 또는 그 유효 펩타이드를 이용한 근육 성장 또는 운동 능력 개선용 조성물에 관한 것이다.

근육은 에너지 대사 및 운동 능력에 있어서 매우 중요한 기관이다. 운동선수들은 자신의 운동 능력을 향상시키기 위하여 근육을 성장시키고, 이를 위하여 규칙적인 생활습관 및 운동뿐만 아니라 근육성장 보조제를 섭취한다. 근육성장 보조제는 동화작용제(Anabolic steroids)를 포함하고 있는데, 이는 남성 호르몬인 테스토스테론(testosterone)의 유도체로서 근육을 강화시키는 아나볼릭(anabolic) 효과와 남성 호르몬의 역할을 수행하는 안드로젠 효과(androgenic effect)를 가지고 있는 합성 스테로이드 호르몬이다. 동화작용제(Anabolic steroids)는 체내의 단백질 합성 증가를 통해 근육과 뼈를 강화시킨다. 그러나 동화작용제(Anabolic steroids)를 과다하게 복용할 경우 간종양, 내분비 기능 장애, 황달 등의 부작용을 유발시킬 수 있다. 따라서, 최근에는 천연 화합물을 이용한 근육 성장 소재를 개발하기 위한 연구가 대두되고 있다. 사과껍질 성분인 우르솔산(ursolic acid)과 로즈마리에서 얻은 carnosic acid가 근육 성장을 유도한다고 알려져있다. 그러나, 해양생물을 이용한 근육 성장에 대한 연구는 미비한 실정이다.

근 단백질 합성에 관여하는 인자들은 근 세포 내에서 phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)/Akt pathway의 자극을 기점으로 다운스트림 단백질(downstream proteins)을 인산화시킴으로써 단백질 합성을 유도한다. PI3K/Akt 신호전달에 의한 mammalian target of rapamycin (mTOR)의 활성은 mRNA translation을 개시하는 두 인자, 4E-binding protein(4EBP1)과 phosphorylated 70-kDa ribosomal S6 kinase(p70S6K)를 활성화시킴으로써 근 단백질 합성을 유도하여 근육량 증가에 기여한다(The Korea Journal of Sports Science, 2011, 20(3):1551-1561; The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 2011, 43(9):1267-1276). 반대로 전사 인자(transcription factor)인 forhead box (FoxO)가 세포질에서 핵 내로 이동하면 단백질 분해에 관여하는 E3 ubiquitin ligase인자 atrogin-1과 MuRF-1의 발현이 증가되어(Disease Models and Mechanisms, 2013, 6:25-39) 근육 내의 단백질 분해가 촉진되고 근육량이 줄어들게 된다.

근육세포의 분화와 근육 형성은 다양한 근육 조절 인자(muscle regulatory factors)에 의해 조절된다. 그 중, MyoD는 근육 특이 유전자의 발현을 개시하게 하고 근육위성세포(muscle satellite cells)가 근원세포(myoblast)로 분화하는 것을 유도한다. MyoD의 활성에 의한 myogenin 발현의 유도는 근원세포의 결합(fusion)에 가장 중요한 요소로, 근관세포(myotube)의 형성에 관여한다. 이와 같은 과정을 통해 형성된 근섬유는 다발을 이루어 최종적으로 근육을 형성하게 된다(Cellular and Molecular Life Sciences, 2013, 70:4117-4130).

해마는 세계적으로 천식, 심장병, 골절 등에 치료하는 약제로 쓰이며, 특히 빅벨리해마(Hippocampus abdominalis)는 해마류 중에서 크기가 가장 크고 아름다운 체색과 체형을 지니고 있어 관상가치가 높아 국제 해수 관상생물 시장에서도 인기가 많다. 머리는 몸통과 직각을 이루고, 꼬리는 기질에 감아 부착할 수 있으며, 수컷이 알을 보호하는 습성이 있다. 아시아 등지에서는 한약재로 사용되며 독특한 모양 덕분에 인기가 많아 산업적 가치가 매우 큰 어종이다(Technical report series, 2003, 4:15).

그러나 약용 가치로 인해 일부 국가에서 남획하고 있으며 더욱이 지구온난화와 연안의 환경오염 등으로 서식할 수 있는 환경이 축소되면서 자연개체의 수는 점차 감소하고 있다. 호주와 그 주변국, 중국과 한국에서 인공수정을 통한 양식이 되고 있으나, 그 수가 수요에 비해 현저히 부족하다(Aquaculture. 2000, 190:377-388). 북해마(Hippocampus kuda Bleeker), 갈귀해마(Hippocampus guttu-latus), Short-snouted seahorse (Hippocampus hippocampus)등에서 면역반응과 생리적 연구가 진행되고 있으나 빅벨리 해마의 면역생리학적 연구가 아직 미비하다.

이에 본 발명 연구자들은, 빅벨리해마(Hippocampus abdominalis)로부터 추출한 신규 펩타이드의 근원세포 분화능과 근육 성장 조절 인자 활성평가 및 제브라피시의 지구력을 개선능을 확인함으로써, 근력강화 활성을 가지는 새로운 자원으로 활용하고자 한다.

본 발명의 목적은 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물의 분획물과 이로부터 분리한 신규 펩타이드를 이용한 근육 성장 또는 운동 능력 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물과 이 가수분해물의 분자량에 따른 3가지 분획물 그리고 이 분획물의 4가지 겔 여과 분획물을 제조하고 또 겔 여과 분획물에서 9가지 단일 펩타이드가 HS(horse serum)로 분화 유도된 마우스 유래 근원세포(myoblast)인 C2C12에 세포독성을 보이지 않으면서 C2C12의 증식을 촉진하고, 근육 성장을 유도하는 인자인 p-Akt, MyoD 등의 발현을 촉진하며, 제브라피시 동물모델 실험에서 지구력을 개선시킬 뿐 아니라 근육 성장을 저해하는 인자인 p-Smad2/3과 Smad4의 발현을 억제하고, 근육 성장을 유도하는 인자인 p-Akt, Myogenin의 발현을 촉진함을 확인하였다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제시되는 것으로, 본 발명은 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물의 분획물 또는 아래 표 1의 9가지 펩타이드 중 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 근육 성장 또는 운동 능력 개선용 조성물로 파악할 수 있고, 다른 측면에 있어서는 근육 감소를 수반하는 질환의 개선용 조성물로 파악할 수 있다.

본 명세서에서, "빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물"은 빅벨리해마를 프로테아제의 일종인 알칼레이즈로 가수분해하여 얻어진 효소 처리물로 아미노산 및/또는 펩타이드를 포함하는 물질군을 의미한다. 이러한 효소 처리물은 그대로 또는 원심분리 후 상등액을 취하여 이용되거나, 효소 처리물 그대로 또는 그 상등액을 감압농축 및/또는 동결건조시켜 액상 또는 분말상으로 이용되거나, 효소 처리물 그대로 또는 그 상등액을 물이나 에탄올 등의 유기용매로 추출하여 이용될 수 있다.

또 본 명세서에서, "빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물의 분획물"은 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물 또는 이 가수분해물의 물이나 유기용매에 의한 추출물을 극성이 서로 다른 유기용매를 사용하여 얻어진 분획물, 분자량에 따라 분획하여 얻어진 분획물 또는 이들 분획물의 겔 여과 분획물을 의미한다. 상기 유기용매는 에탄올을 포함한 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 겔 여과시 용출 용매는 물 또는 상기 유기용매를 사용할 수 있다.

또 본 명세서에서, 알킬레이즈((Alcalase)는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)에서 분리된, 주로 서브틸리진 A(subtilisin A)로 이루어진 효소로, 세린 엔도펩티다아제(serine endopeptidase) 활성을 갖는 단백질 분해 효소를 말한다.

또 본 명세서에서, "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, "근육 감소를 수반하는 질환"은 노화성 근감소증(age related sarcopenia), 근이영양증(muscle dystrophy), 근위축증(muscle atrophy), 동작 뉴런 질병, 대사성 근육 질병, 염증성 근병증, 신경근 접합부 질병, 내분비성 근병증 등을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, "근육 감소를 수반하는 질환 개선"은 해당 질환의 예방과 치료를 포함하는 의미로 해당 질환의 발병 억제, 지연, 증상의 경감 등을 의미한다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 근육 성장 효과, 운동 능력 개선 효과, 근육 감소를 수반하는 질환의 개선 효과 등을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 근육 성장 효과, 운동 능력 개선 효과, 근육 감소를 수반하는 질환의 개선 효과 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분 이외에, 근육 성장 효과, 운동 능력 개선 효과 등의 상승·보강 등을 위하여 또는 피로 개선 활성 등 유사활성의 부가를 통한 복용이나 섭취의 편리성을 증진시키기 위하여, 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 "대한민국약전"), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 "건강기능식품 기준 및 규격"임) 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 "약사법"임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조·판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 「건강기능식품에관한법률」임)에 따라 기능성이 인정된 화합물 또는 추출물이 포함된다. 예컨대 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따라 '운동 수행 능력 향상'으로 기능성이 인정된 마카 젤라틴화 분말, 크레아틴, 헛개나무 과병 추출 분말, 동충하초 발효 추출물 등과, '피로 개선'으로 기능성이 인정된 발효 생성 아미노산 복합물, 헛개나무 과병 추출물, 홍경천 추출물 등이 이러한 화합물 또는 추출물에 해당할 것이다.

이러한 화합물 또는 천연 추출물은 본 발명의 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다. 본 발명의 조성물이 식품 조성물로 파악될 경우 그 용도는 피부 과민 반응 억제 또는 과민 반응 억제로 이해될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구르트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.

또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따른 건강기능식품이거나, 한국 「식품위생법」의 식품공전(식약처 고시 「식품의 기준 및 규격」)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 「식품위생법」임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 「식품첨가물 기준 및 규격」)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.

감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산 칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화 크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.

약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 "대한민국약전"을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유, 에탄올, 그리세롤 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라적절한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 희석제 등을 포함시킬 수 있다. 적절한 결합제로서는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페리스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 글루코스, 옥수수 감미제, 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 들 수 있고, 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염, 폴리데틸렌글리콜 등을 들 수 있으며, 붕해제로서는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 검, 전분, 알긴산 또는 그것의 소듐 염 등을 들 수 있다. 또 희석제로서는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스, 글라이신 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 수성 등장 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 담체로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.

약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 빅벨리해마 알칼레이즈 가수분해물의 분획물과 이로부터 분리한 신규 펩타이드를 이용한 근육 성장 또는 운동 능력 개선용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 식품, 약품 등으로 제품화될 수 있다.

도 1은 빅벨리해마의 알킬레이즈 가수분해물(HAA)과 그 가수분해물의 3가지 분자량에 따른 분획물(HAA-Ⅰ~Ⅲ) 중 분획물 HAA-Ⅲ(MW ≤5 kDa)의 4가지 겔 여과 분획물(HAA-Ⅲ-a~d)의 용출 프로파일이다.
도 2는 4가지 겔 여과 분획물(HAA-Ⅲ-a~d) 중 HAA-Ⅲ-b 분획에 대해 RP-HPLC를 통해 9가지 펩타이드를 분리·확인한 결과이다.
도 3 내지 도 11은 9가지 펩타이드의 Q-TOF ESI mass spectrometer에 의한 서열 분석 결과이다.
도 12 내지 도 20은 9가지 펩타이드의 Q-TOF ESI mass spectrometer에 의한 분자량 분석 결과이다.
도 21 내지 도 23는 빅벨리해마의 알킬레이즈 가수분해물(HAA)의 분획물과 9가지 펩타이드의 세포독성 평가 결과이다.
도 24 내지 도 26은 빅벨리해마의 알킬레이즈 가수분해물(HAA) 분획물과 9가지 펩타이드의 세포 증식 효능 평가 결과이다.
도 27 내지 도 29는 세포 내 근육 성장 조절 인자 발현 평가 결과이다.
도 30 및 도 31은 제브라피시의 생존율과 체중 변화 측정 결과이다.
도 32는 제브라피시 지구력 개선 측정 결과이다.
도 33은 제브라피쉬 근육 조직 내 근육성장 조절 인자 발현 평가 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예> 해마 효소 가수분해물 유래 펩타이드 분리 및 동정

빅벨리해마(Hippocampus abdominalis)는 (주)해천마(제주)로부터 양식 종을 제공 받았으며, 내장을 포함한 해마 전체를 동결건조한 후 곱게 갈아 1g을 취한 후, 100mL 증류수에 섞고, 알칼레이즈(Alcalase 2.4L FG, Novozyme Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)의 최적 활성 조건(pH 8.0, 50℃)에서 1%(w/w)의 기질 대 효소비로 효소 가수분해를 수행하였다. 가수분해 반응 후 효소 불활성화를 위해 100℃에서 10분간 끓이고, 원심분리(3,500 rpm, 10분) 및 감압여과를 수행하여 상층액을 분리한 후 이를 동결건조하여 실험에 사용하였다(얻어진 가수분해물을 편의상 HAA라 함).

동결건조된 효소 가수분해물은 Millipore's Lab scale TFF system (Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, USA)를 이용하여, 분획 분자량(molecular weight cut-off, MWCO)이 각각 5 kDa 및 10 kDa인 한외여과막으로 4℃에서 분획을 수행하여 3개의 분획물 HAA-Ⅰ(MW ≥10 kDa), HAA-Ⅱ(MW 5~10 kDa), HAA-Ⅲ(MW ≤5 kDa)을 얻었다.

이 중 근원세포 증식 효능이 가장 우수한 세번째 분획물 HAA-Ⅲ에 대해서, 겔 여과를 수행하여 수행하였다. 겔 여과는 세파덱스 G-10 컬럼(Sephadex G-10 column)(φ2.5 X 100 cm)에 세번째 분획물 HAA-Ⅲ을 DW을 이용하여 100mg/mL로 용해시켜 주입한 후 증류수를 2mL/min의 유속으로 흘려주어 용출시키고 220nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도에 따라 용출된 4개의 분획물들(HAA-Ⅲ-a~d)을 회수하고(도 1), 근원세포 증식 효능이 가장 우수한 두번째 분획물(HAA-Ⅲ-b)에 대해서, ODS C18 칼럼(Waters, Atlantis T3 column, 3.0 Х 150 mm, 3 μm)이 장착된 HPLC를 이용하고 아세토니트릴과 증류수 용액으로 선형상 농도구배법((0 min-30 min: 0:100 v/v-40:60 v/v, 30-40 min: 50:50 v/v, 40-50 min: 100:0 v/v 및 50-60 min: 100:0 v/v)을 사용하여 0.3 mL/min의 유속으로 용출시키고 220nm와 280nm에서 흡광도를 측정하여 모니터링한 결과 1개의 강한 피크와 8개의 약한 피크를 확인하여(도 2) 총 9개의 단일 펩타이드들(P1~P9)을 분획하였다.

9개의 단일 펩타이드들에 대해서 Q-TOF ESI mass spectrometer(Bruker Daltonics, 255748 Germany)로 아미노산 서열을 분석하여 아래의 표 1에 나타내었으며, 각 분석 결과는 도 3 내지 도 11에 나타내었다. 또 Q-TOF ESI mass spectrometer(Bruker Daltonics, 255748 Germany)로 측정한 분자량(도 12 내지 도 20)과 이론값의 분자량을 비교한 결과, 9개 펩타이드 모두 일치함을 확인하였다.

<실험예> 근육 성장 활성 및 운동 능력 개선 활성의 평가

1. 실험 방법

1.1 근원세포 배양

마우스 유래 근원세포인 C2C12 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 세포를 10% FBS(Corning Incorporated, NY, USA) 와 1% antibiotics(Gibco-BRL, Burlington, Ont, Canada)를 함유한 DMEM(Gibco-BRL, Burlington, Ont, Canada) 배지에 현탁하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다.

1.2 근원세포 분화 유도

C2C12 세포를 48 well plate에 각 well 당 5 × 10⁴ cells을 동일하게 분주하고 48시간 동안 배양하여 plate에 80% 차지하였을 때 분화를 유도하였다. 분화 유도는 6일 동안 2일 간격으로 2% horse serum(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 및 1% antibiotics를 함유한 DMEM 배지로 교체하면서 시행하였다.

1.3 세포 독성 평가

C2C12 세포를 48 well plate에 각 well 당 5 × 10⁴ cells을 동일하게 분주하고 16시간 경과 후, HAA를 처리하고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 이후 100㎕의 MTT 용액(2 mg/mL)을 각 well에 첨가하여 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에서 반응시켰다. 이후 상층액을 완전히 제거하고 DMSO를 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 살아있는 세포의 양을 측정하였다.

1.4 세포 증식 효능 평가

C2C12 세포를 48 well plate에 각 well 당 5 × 10⁴ cells을 동일하게 분주하고 48시간 동안 배양하여 plate에 80% 차지하였을 때 상기와 동일한 방법으로 분화를 유도하였다. 분화 유도하는 C2C12 세포에 분화 배지로 교체할 때 HAA를 처리하였다. 세포 증식은 5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU)를 처리한 후 면역조직화학염색법(BrdU assay)(Millipore, Billerica, MA, USA)를 통하여 확인하였다.

1.5 세포 내 근육성장 조절 인자 발현 평가

세포를 100 mm 배양용기에 2×10⁶ 개의 세포를 부착시키고, 시료를 25, 50, 100㎍/mL로 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 모두 수거하여 세포 침전물을 세포 용해액(Nonidet P-40, Sodium dodecyl sulfate, 0.1 M Tris-HCl(pH 7.2), 100 mM PMSF, 10 ㎍/㎖ aprotinin, 10 ㎍/㎖l eupeptin)에 용해시킨 후 13,000 rpm에서 20분 간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 총 단백질량은 BCA Protein assay kit(Cat no. #23227) 용액을 이용하여 정량하였고, 30㎍ 단백질과 6X sample buffer(1 ㎖ of glycerol, 0.5 ㎖ of β-mercaptoethanol, 3 ㎖ of 10% SDS, 1.25 ㎖ of 1 M Tris-HCl, 1~2 ㎍ of bromophenol blue)를 혼합한 후 12 % SDS polyacrylamidegel에서 전기영동을 수행하였다. PVDF (Polyvinylidene Difluoride)에 전이시키고 5% non-fat skim milk로 blocking시킨 후, AKT, pAKT, P38MAPK, pP38MAPK, GAPDH의 일차항체를 각각 희석하여 실온에서 3시간 반응시켰다. TBST로 3회 세척한 후, 2차 antibody를 1:5000으로 희석하여 실온에서 30분 반응시켰다. TBST로 세척한 후, ECL solution으로 발광시킨 후 band를 얻었다.

또 근육 강화 활성을 탐색하기 위하여 근육 세포가 분화하면서 성장하는 정도를 확인하기 위해 C2C12 세포를 분화 유도한 후 시료를 농도별로 처리하여 세포 내 근육 성장 관련 인자인 MyoD과 Myogenin(MyoG) 발현 정도를 확인하였다. 즉 Myotube 분화에 따라 MyoD 발현 양과 MyoG 발현 양에 변화가 생기므로 MyoD 발현과 Myogenin발현 정도를 확인 하였다.

1.5 제브라피시를 이용한 동물모델 실험

1.5.1 실험군의 구성

성체 제브라피시(Zebrafish)는 시중(제주 아쿠아리룸, 제주도, 한국)에서 구입하였으며, 28.5±1℃ 온도 및 14/10시간 명암 주기 조건의 3.5L 아크릴 탱크에서 관리하며 1일 2회 식이(Tetra GmgH D-49304 Melle, made in Germany)를 급여하였으며, 2주간 적응시켜 실험에 사용하였다. 제브라피시 실험은 제주대학교 동물실험윤리위원회의 승인하에 이루어 졌다.

실험군은 제브라피시 성체 12마리씩 무작위로 음성대조군, 펩타이드(서열 QIGFIW) 저농도 섭이군(50 ㎍/mL), 펩타이드(서열 QIGFIW) 고농도 섭이군(100 ㎍/mL) 및 양성대조군(Octacosanol, 25 ㎍/mL)으로 나누고 2주간 주 3회 시료를 섭이시켰다.

1.5.2 제브라피쉬 생존율 및 체중 측정

제브라피쉬의 개체 수는 매일 측정하여 섭이 시작 전과 2주의 섭이 후의 생존율 변화를 측정하였으며, 체중은 주 1회 제브라피쉬의 표면에 묻어있는 물을 제거한 후 측정하여 섭이 시작 전과 2주 후의 섭이 후의 체중 변화를 측정하였다.

1.5.3 제브라피쉬의 지구력 개선 측정

2주간의 섭이가 끝난 후 16°의 경사와 0.3 cm/sec의 flow rate를 가지는 behavior tank에 물을 채운 후 제브라피쉬의 지구력을 측정하였다. 지구력 테스트 tank는 2개의 공간으로 나뉘며, Section A는 경사와 물의 흐름에 대하여 제브라피쉬가 지구력을 가지며 유영하는 공간이고, Section B는 경사와 물의 흐름을 견디지 못하고 낙하하는 공간이다. 제브라피쉬의 지구력을 측정하기 위하여 300초의 시간 동안 Section A에서의 제브라피쉬의 개체 수를 측정하였다.

1.5.4 제브라피쉬 근육 조직 내 근육성장 조절 인자 발현 평가

근육성장 조절 인자는 p-Smad2/3, Smad4, p-Akt, 및 Myogenin의 단백질 발현량을 western blot을 통하여 분석하였다. 제브라피쉬의 근육 조직을 얻어 lysis buffer[50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)]로 세포 내 단백질을 용해하였다. Pierce^TM BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 통해 단백질 정량 후 동일한 단백질 양을 SDS-PAGE에 loading 하여 크기에 따라 분리한 뒤 nitrocellulose membrane으로 transfer 하였다. membrane에 p-Smad2/3, Smad4, p-Akt 및 MyoD의 1차 항체를 반응시킨 후 2차 항체를 결합시켜 western blotting detection solution(Cyanagen, Bologna, Italia)를 사용한 chemiluminescence 방법을 통하여 단백질의 발현량을 가시화하였다.

1.5.5 통계 분석

실험결과의 통계처리는 각각의 시료에 대한 평균 ± 표준편차로 나타내었다. SPSS 프로그램(SPSS Inc. Ver. 12.0)을 사용하여 One-way ANOVA-test를 실시하여 조사 항목들간의 유의성 검증은 Turkeys multiple range test로 실시함. P-value는 control 군과 비교하여 *; p<0.05, **; p<0.005로 나타내었다.

2. 실험 결과

2.1 세포독성 평가 결과

빅벨리해마의 알칼레이즈 가수분해물의 3가지 분자량에 따른 분획물(HAA-Ⅰ~Ⅲ)의 세포독성 평가 결과를 도 21에 나타내었고, 분획물 HAA-Ⅲ(MW ≤5 kDa)의 4가지 겔 여과 분획물(HAA-Ⅲ-a~d)의 세포독성 평가 결과를 도 22에 나타내었으며, 겔 여과 분획물(HAA-Ⅲ-b)에서 분리한 9가지 펩타이드(P1~P9)의 세포독성 평가 결과를 도 23에 나타내었다. 이들 분획물과 펩타이드 모두 특별한 세포독성을 나타내지 않았다.

2.2 세포 증식 효능 평가 결과

빅벨리해마의 알칼레이즈 가수분해물의 3가지 분자량에 따른 분획물(HAA-Ⅰ~Ⅲ)의 세포 증식 효능 평가 결과를 도 24에 나타내었고, 분획물 HAA-Ⅲ(MW ≤5 kDa)의 4가지 겔 여과 분획물(HAA-Ⅲ-a~d)의 세포증식 효능 평가 결과를 도 25에 나타내었으며, 겔 여과 분획물(HAA-Ⅲ-b)에서 분리한 9가지 펩타이드(P1~P9)의 세포 증식 효능 평가 결과를 도 26에 나타내었다.

분자량에 따른 분획물 중에서는 분획물 HAA-Ⅲ(MW ≤5 kDa)이 가장 활성이 우수하였고, 겔 여과 분획물 중에서는 HAA-Ⅲ-b이 가장 활성이 우수하였으며, 9가지 펩타이드 분획물 중에서는 P4, P6이 우수하였고, 그 중 P6이 가장 우수하였다.

2.3 세포 내 근육 성장 조절 인자 발현 평가 결과

9가지 펩타이드 중 세포 증식 효능이 가장 우수한 펩타이드(P6, QIGFIW)의 근육성장 조절 인자의 웨스턴 블럿에 의한 발현 평가 결과를 도 27 내지 도 29에 나타내었다. 상기 펩타이드는 대체로 모두 농도 의존적으로 근육 성장을 유도하는 인자인 p-FoxO1, MyoD 및 MyoG의 발현을 촉진하고 근육 성장을 저해하는 인자인 p-Smad2/3 등의 발현을 억제하였다.

2.4 제브라피시의 생존율과 체중 변화 측정 결과

상기 세 가지 펩타이드 중 가장 활성이 우수한 P6 펩타이드에 대해 제브라피시의 생존율과 체중을 확인한 결과를 도 30 및 도 31에 나타내었다. P6 펩타이드는 모든 처리 농도에서 특별히 제브라피시의 생존율과 체중에 영향을 미치지 아니하였다.

2.5 제브라피시 지구력 개선 측정 결과

P6 펩타이드가 제브라피시의 지구력 개선에 미치는 영향을 평가한 결과를 도 32에 나타내었다. P6 펩타이드는 농도 의존적으로 제브라피시의 지구력을 개선시켰다.

2.6 제브라피쉬 근육 조직 내 근육성장 조절 인자 발현 평가 결과

P6 펩타이드가 제브라피시 근육 조직 내 근육성장 조절 인자인 p-Smad2/3, Smad4, p-Akt 및 Myogenin의 발현에 미치는 영향을 평가한 결과를 도 23에 나타내었다. P6 펩타이드는 근육 성장을 저해하는 인자인 p-Smad2/3과 Smad4의 발현을 억제하고, 근육 성장을 유도하는 인자인 p-Akt 및 Myogenin의 발현을 촉진함을 확인하였다.

<110> YOU JIN, JUN <120> Composition for Increase of Muscle Growth or Improvement of Exercise Performance Using Fractions of Alcalase Hydrolysates of Hippocampus abdominalis, or Effective Peptides Thereof <130> PP18-224 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-III-b-P1 <400> 1 Gln Ile Gly Ile Gly Gly Val Gly Gln 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-III-b-P2 <400> 2 Ala Gly Ser Met Trp Asn Leu Lys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-III-b-P3 <400> 3 Gln Ile Gly Phe Ile Gly Gly Asp Gln 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-III-b-P4 <400> 4 Gly Ile Ile Gly Pro Ser Gly Ser Pro 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-III-b-P5 <400> 5 Ile Gly Thr Gly Ile Pro Gly Ile Trp 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-III-b-P6 <400> 6 Gln Ile Gly Phe Ile Trp 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-III-b-P7 <400> 7 Ile Gly Ile Gly Pro Ser Gly Ala Ser 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-III-b-P8 <400> 8 Thr Ser Ile Gly Ile Gly Thr Gly Ile Pro 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-III-b-P9 <400> 9 Gln Gly Ile Gly Asn Ile Gly Phe Ala Asn 1 5 10

Claims (10)

1. 아래 표 1의 9가지 펩타이드 중 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 근육 성장용 식품 조성물.
   [표 1]
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 상기 표 1의 3번, 4번 및 6번 내지 9번 펩타이드 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 상기 표 1의 4번, 6번 및 7번 펩타이드 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 아래 표 1의 9가지 펩타이드 중 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 운동 능력 개선용 식품 조성물.
   [표 1]
   

   
5. 제4항에 있어서,
   상기 펩타이드는 상기 표 1의 3번, 4번 및 6번 내지 9번 펩타이드 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제4항에 있어서,
   상기 펩타이드는 상기 표 1의 4번, 6번 및 7번 펩타이드 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 아래 표 1의 9가지 펩타이드 중 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 근육 감소를 수반하는 질환의 개선용 약제학적 조성물로서,
   상기 질환은 노화성 근감소증(age related sarcopenia), 근이영양증(muscle dystrophy), 근위축증(muscle atrophy), 동작 뉴런 질병, 대사성 근육 질병, 염증성 근병증, 신경근 접합부 질병 또는 내분비성 근병증인 것을 특징으로 하는 조성물.
   [표 1]
   

   

   
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 펩타이드는 상기 표 1의 3번, 4번 및 6번 내지 9번 펩타이드 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 제7항에 있어서,
   상기 펩타이드는 상기 표 1의 4번, 6번 및 7번 펩타이드 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
   
   
   
   
10. 삭제

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