KR101724591B1

KR101724591B1 - 톳 추출물을 이용한 방사선 방호용 조성물

Info

Publication number: KR101724591B1
Application number: KR1020150054514A
Authority: KR
Inventors: 지영흔; 전유진; 이병걸; 김아름; 빙소진; 조진희; 안긴내; 이지혁
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2015-04-17
Filing date: 2015-04-17
Publication date: 2017-04-07
Also published as: KR20160123825A

Abstract

본 발명은 비장세포에 대해서 특별히 세포 독성을 나타내지 않고(도 1 참조), 방사선 조사에 의하여 억제된 비장세포의 증식을 촉진하며(도 2 참조), 방사선 조사에 의해 유발된 산화적 손상과 DNA 손상을 회복시키는 활성(도 3 및 도 4 참조) 등을 지닌 톳 추출물을 이용한 방사선 방호용 조성물을 개시한다.

Description

톳 추출물을 이용한 방사선 방호용 조성물{Composition for Protecting Radiation Using a Hizikia fusiforme Extract}

본 발명은 톳(Hizikia fusiforme) 추출물을 이용한 방사선 방호용 조성물에 관한 것이다.

방사선 및 방사성 동위원소는 산업 및 의학 등의 여러 분야에서 이용되고 있으며 사용 빈도 또한 지속적으로 증가하고 있는 추세이다. 의학 분야에서의 방사선 및 방사선 동위원소의 이용은 질병의 진단과 치료에 이용되고 있다[1]. 방사선을 이용한 항암치료 시, 방사선은 종양세포뿐만 아니라 주변 조직에도 영향을 미쳐 DNA 손상을 일으키는 직접적인 영향과 세포 내 물 분자의 이온화로 생성된 활성산소(reactive oxygen species, ROS)에 의해 세포 손상을 일으키는 간접적인 영향을 끼치는 것으로 알려져 있다. 이러한 방사선의 직·간접적 영향으로 DNA및 단백질 손상의 정도에 따라 세포의 기능 상실 및 말초면역세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도한다. 또한, 세포 분열 및 증식이 빠른 세포가 방사선에 민감하며 그에 대한 손상으로 인하여 여러 부작용이 나타나게 된다. 따라서 방사선 치료 시 나타나는 부작용을 완화시켜줄 수 있는 방사선 방어 물질의 개발이 중요한 문제로 대두되었으며[2], 방사선 방어 물질에 대한 연구는 1949년 Patt 등[3]에 의해 cystein이 방사선 방어 효과가 있음을 밝힌 연구를 시작으로 합성물질로 이루어진 방사선 방어제에 대한 연구가 다수 보고되었다. 현재 대표적인 방사선 방어 물질인 WR-2721 (Amifostine; S-2-(3-aminopropoylamino) ethylphospherothiotic acid)은 조혈장기에 방사선 방어 효과가 있다고 보고되었으나 일부 장기에서 방사선 방어 효과가 저해되었다는 보고 또한 있었으며, 중간 대사산물로 인한 부작용이 나타나 문제가 제기되었다[4]. 따라서, 현재까지 개발된 방사선 방어제가 갖는 부작용이 나타나지 않으면서 방사선 방어 효과를 가지는 천연물질(natural product)을 찾기 위한 연구가 국내·외에서 활발히 진행되고 있다[5-6]. 천연물질 중 인삼, 오가피, 알로에, 다시마, 미역 등 식물추출물은 DNA회복 기능[6], 지질 과산화 감소[7], 항산화 효과[8], 면역자극효과, 세포증식효과[9], 항염 및 항균효과[10], 글루타메이트 레벨(galutamate levels) 증가 효과[11] 등을 지니며 또한 방사선 방어 효과를 나타내기도 한다고 보고되어 있다[12].

톳 추출물(Hizikia fusiforme extract, HFE)은 갈조류(Phaephta) 모자반과의 바닷말로 뿌리에서 새싹이 돋아 번식을 매년 거듭하는 다년생 해조류이다[13]. 톳은 칼슘, 비타민 A, 철, 요오드, 마그네슘 및 식이섬유소가 풍부하며[14], 미생물 번식 억제 효과 및 항균 효과[15], 혈액 응고 저해[16], 지질 대사 개선 효과[17], 항염 효과, 항암 효과[18], 항산화 효과[19-20]가 보고되었다. 특히, 톳을 포함한 해조류 추출물에서 B세포와 대식세포를 활성화시키고 면역반응을 조절한다고 보고되었다[21].

본 발명은 톳 추출물의 방사선 방호 효과를 개시한다.

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본 발명의 목적은 톳 추출물을 이용한 방사선 방호용 조성물을 제공하는 데 있다.

기타 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 톳 추출물이 비장세포에 대해서 특별히 세포 독성을 나타내지 않고(도 1 참조), 방사선 조사에 의하여 억제된 비장세포의 증식을 촉진하며(도 2 참조), 방사선 조사에 의해 유발된 산화적 손상과 DNA 손상을 회복시킴을 확인할 수 있다(도 3 및 도 4 참조). 나아가 방사선 조사에 의한 비장세포의 세포자멸사를 억제할 뿐만 아니라(도 5 참조) 세포자멸사를 유도하는 인자인 p53 및 bax의 발현을 억제하고 세포자멸사를 억제하는 bcl-2의 발현을 증가시킴을 확인할 수 있었다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 톳 추출물을 유효성분으로 포함하는 방사선 방호용 조성물로 파악할 수 있고, 구체적으로는 톳 추출물을 유효성분으로 포함하는 방사선에 의한 비장세포 장해 방호용 조성물로 파악할 수 있다.

본 명세서에서, "방사선 방호"는 방사선에 의한 인체 장해를 회복한다는 의미이며, 구체적으로는 방사선에 의한 인체 면역세포의 기능, 증식 억제의 회복, 방사선에 의한 인체 산화적 손상의 회복, 방사선에 의한 인체 DNA 손상의 회복 및/또는 방사선에 의한 인체 세포자멸사의 회복을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, "방사선에 의한 비장세포 장해 방호"는 방사선에 의한 비장세포의 기능 억제, 증식 억제, 산화적 손상, DNA 손상 및/또는 세포자멸사를 회복시킨다는 의미이다.

또 본 명세서에서, "톳 추출물"이란 추출 대상인 톳을 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도 등을 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방식을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 상기 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물을 포함하고, 상기 추출물을 상기 용매들을 극성이 증가 또는 감소하는 순으로 사용하여 순차적으로 분획하여 얻어진 분획물을 포함하며, 나아가 크기, 전하, 소수성, 친화성 등의 성질을 이용한 크로마토그래피에 의하여 얻어진 분획물을 포함한다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 아래의 실시예를 참조할 때, 바람직하게는 열수 추출물을 의미한다.

또 본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어는 국어사전적 의미나 당업계에서 통용되고 있는 의미에 따른다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 방사선 방호 효과를 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게서, 방사선 방호 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등) 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 아토피성 피부염 조성물처럼 경우에 따라서는 국소적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

또한 향미나 기호성을 향상시키고 다른 기능성을 추가하기 위하여 한약재가 추가될 수 있는데, 추가될 수 있는 한약재로서는 두충 추출물, 속단 추출물, 녹용 추출물, 홍화인 추출물, 토사자 추출물, 숙지황 추출물, 별갑 추출물, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 감초 추출물, 당귀 추출물, 갈근 추출물, 강진향 추출물, 합환피 추출물, 산두근 추출물, 괴화 추출물, 고삼 추출물 등이 예시될 수 있다.

전술한 바와 같이 본 발명에 따르면, 톳 추출물을 이용한 방사선 방호용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 식품 조성물 또는 약품 조성물로 제품화될 수 있다.

도 1은 비장세포에 대한 톳 추출물의 세포독성 실험 결과이다.
도 2는 톳 추출물이 방사선 조사에 의해 억제된 비장세포의 증식능을 회복시키는 활성을 보여주는 실험 결과이다.
도 3은 톳 추출물이 방사선 조사에 의한 비장세포의 산화적 손상을 억제하는 활성을 보여주는 실험 결과이다.
도 4은 톳 추출물이 방사선 조사에 의한 비장세포의 DNA 손상을 억제하는 활성을 보여주는 실험 결과이다.
도 5는 톳 추출물이 방사선 조사에 의해 유도되는 비장세포의 세포자멸사를 억제하는 활성을 보여주는 실험 결과이다.
도 6은 톳 추출물이 방사선 조사에 의해 유도되는 비장세포의 세포자멸사의 초기 단계 및 말기 단계에 미치는 영향을 보여주는 실험 결과이다.
도 7은 톳 추출물이 비장세포에서 세포자멸사 관여 인자인 p53, Bcl-2, Bax 발현에 미치는 영향을 보여주는 실험 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 톳 추출물의 제조

톳(Hizikia fusiforme)은 2013년 2월 ~ 4월 사이에 한국 제주도 연안에서 채집하였고, 염분과 기타 불순물을 제거하기 위하여 수세하였다. 수세한 톳은 동결 건조한 후 곱게 갈아 1 g을 취한 후, 100 ml 증류수에 섞어 100℃에서 12시간 동안 추출하여 여과하였다. 여과된 상층액을 감압농축하고 동결건조하여 아래의 실험에 사용하였다.

< 실험예 > 톳 추출물의 방사선 방호 활성 실험

< 실험예 1> 비장세포에 대한 세포독성 평가

< 실험예 1-1> 마우스의 비장세포 부유액 준비

7 ~ 10주령 C57BL/6 마우스의 비장을 적출하여 세포 여과기를 통해 단일세포 부유액을 얻었다. 이렇게 얻은 세포는 염화암모늄(ammonium chloride, ACK) 용액과 함께 10 분간 실온에서 배양한 뒤 인산완충용액(Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS, Gibco BRL, Paisley, UK)로 세척하였다. 다음 10% 소태아 혈청(Gibco BRL)과 1% 항생제(100U/ml penicillin-streptomycin, Gibco BRL)가 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL)에 부유시켰다.

C57BL/6 마우스 비장 세포의 방사선 조사는 제주대학교 원자력과학기술연구소의 ⁶⁰Co 감마선 조사기(Theratron-780 teletherapy unit)를 이용하여 1.5 Gy, 100 cm 거리에서 조사하였다.

< 실험예 1-2> 실험 방법

방사선을 조사한 말초면역세포에서 톳에 의한 세포독성이 나타나는지 알아보기 위하여 MTT assay 실험법으로 말초면역세포의 생존률을 측정하였다.

비장세포를 단일세포로 분리한 부유액을 정상대조군, 방사선 조사 대조군, 방사선 조사 후 톳 추출물을 처리한 실험군으로 나누어 96-well plate에 1×10⁵cells/well로 넣었고, 실험군에는 3.1, 6.3, 12.5, 25 ㎍/ml의 농도로 톳 추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후 MTT 용액(5 mg/ml)을 각각의 well에 15 ㎕씩 넣고 4시간 배양하였다. 이후 버퍼(solubilzation buffer, pH 4.7) 100 ㎕를 첨가하여 formazan 결정을 녹인 후, 570nm과 630nm에서 흡광도를 측정하고, 결과는 대조군(0 ㎍/ml)의 OD 값에 대한 비율로 표현하였다. 각 실험결과는 평균값±표준편차로 나타내었고 student t-test를 이용하여 통계 처리하였다.

< 실험예 1-3> 실험 결과

상기 실험결과는 도 1에 나타내었다.

도 1을 참조하여 보면, 방사선을 조사하지 않은 정상 대조군에서 톳 추출물 3.1 ㎍/ml에서 25.0 ㎍/ml까지의 농도에서 말초면역세포에 대한 독성을 나타내지 않았으며, 또 1.5 Gy의 방사선을 조사한 말초면역세포에 대해서도 독성을 나타내지 않았다.

< 실험예 2> 비장세포의 세포증식능에 미치는 영향 측정

< 실험예 2-1> 마우스의 비장세포 부유액 준비 및 방사선 조사

마우스 비장세포 부유액 준비와 방사선 조사는 상기 <실험예 1>과 동일한 방식으로 이루어졌다.

< 실험예 2-2> 실험 방법

방사선을 조사한 말초면역세포에서 톳에 의한 증식능을 알아보기 위하여 ³H-thymidine incorporation 실험을 수행하였다. 비장세포를 단일세포로 분리한 부유액을 정상 대조군, 방사선 조사 대조군, 방사선 조사 후 톳 추출물을 처리한 실험군으로 나누어 96-well plate에 4×10⁵cell/well로 넣었고, 실험군에는 3.1, 6.3, 12.5, 25 ㎍/ml의 농도로 톳 추출물을 처리하여 54시간 배양하였다. 그 후 ³H-thymidine (42 Ci/mmol; Amersham, USA)을 각각의 well에 1 μCi씩 넣어 18시간 배양시킨 후 유리섬유 여지에 세포를 포획하였고 유리섬유 여지를 건조시킨 다음 방사능 측정기 (TriLux, USA)를 통하여 방사성 동위원소의 양을 측정하였다.

< 실험예 2-3> 실험 결과

상기 실험결과는 도 2에 나타내었다.

방사선을 조사하지 않은 정상 대조군에서 톳 추출물을 처리하지 않았을 때 2,747±646 cpm, 3.1 ㎍/ml의 톳 추출물을 처리하였을 때는 4,422±1,567 cpm, 6.3 ㎍/ml의 톳 추출물을 처리하였을 때는 8854±820 cpm으로 저농도에서도 톳 추출물을 처리하였을 때 말초면역세포의 증식능이 유의적으로 증가함을 보였다. 특히, 톳 추출물 처리 실험군의 경우 6.3 ㎍/ml의 농도에서 정상 대조군에 비하여 말초면역세포의 증식능이 3.2배 증가함을 보였다(도 2A, p<0.001). 또한 1.5 Gy의 방사선을 조사한 말초면역세포에 톳 추출물을 처리한 결과, 방사선 대조군에 비해 말초면역세포의 증식능을 유의성 있게 증가시켰다. 톳 추출물을 6.3 ㎍/ml의 농도 처리군에서 2,209±310 cpm으로 정상 대조군 (2,418±145 cpm)과 비슷한 수치를 보였다(도 2B, p<0.05).

이상의 결과로부터 저농도의 톳 추출물 처리에 의해 말초면역세포의 증식능이 유의성 있게 증가함을 확인하였다. 따라서 이후 실험에서는 6.3 ㎍/ml 농도의 톳 추출물을 사용하였다.

< 실험예 3> 비장세포에서 산화적 손상의 억제 효과 측정

< 실험예 3-1> 마우스의 비장세포 부유액 준비 및 방사선 조사

< 실험예 3-2> 실험 방법

방사선을 조사한 말초면역세포에서 톳 추출물이 산화적 손상에 미치는 영향을 알아보기 위하여 DCF-DA assay를 수행하였다. 비장세포를 단일세포로 분리한 부유액을 정상대조군, 방사선 조사 대조군, 방사선 조사 후 톳 추출물을 처리한 실험군으로 나누어 96-well plate에 1±10⁵cell/well로 넣었고, 실험군에는 6.3 ㎍/ml의 농도로 톳 추출물을 처리하여 2시간 배양하였다. 그 후 25 μM의 DCF-DA를 처리한 후 30분간 배양한 다음 DPBS 200 ㎕로 세척한 후 485nm, 520nm에서 형광강도를 측정하였다.

< 실험예 3-3> 실험 결과

실험 결과를 도 3에 나타내었다.

DCF-DA assay는 DCF-DA가 세포내에서 활성산소에 의하여 산화되면서 나타나는 형광 광도를 측정하여 활성산소의 생성량을 판단할 수 있는 실험법이다. 이를 통하여 방사선에 의해 생성된 활성산소가 일으키는 말초면역세포의 산화적 손상에 대한 톳 추출물의 효과를 평가하였다. 방사선을 조사하였을 때 147.0±13.98 % 로 방사선을 조사하지 않은 정상 대조군 100.0±15.09 % 에 비하여 형광 광도가 증가함을 확인하였고, 톳 추출물을 6.3 ㎍/ml의 농도 처리군에서는 92.5±4.22 % 로 톳 추출물을 처리한 말초면역세포의 활성산소 생성량이 유의성 있게 감소함을 보였다(도 3, p<0.05).

이상의 결과로부터 방사선을 조사한 말초면역세포에 톳 추출물을 처리하였을 때 활성산소의 생성량이 감소한 것으로 미루어 볼 때, 톳 추출물이 말초면역세포의 산화적 손상의 억제를 확인할 수 있었다.

< 실험예 4> 비장세포에서 DNA 손상의 억제 효과 측정

< 실험예 4-1> 마우스의 비장세포 부유액 준비 및 방사선 조사

< 실험예 4-2> 실험 방법

방사선을 조사한 말초면역세포에서 톳 추출물이 DNA 손상에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Comet assay를 수행하였다. 비장세포를 단일세포로 분리한 부유액을 정상대조군, 방사선 조사 대조군, 방사선 조사 후 톳 추출물을 처리한 실험군으로 나누어 24-well plate에 5±10⁴cell/well로 넣었고, 실험군에는 6.3 ㎍/ml의 농도로 톳 추출물을 처리하여 배양한 후 세포를 수확하였다. 수확한 세포를 1 ml의 DPBS로 세척하고 0.7% low melting point agarose (LMPA, Invitrogen, CA, USA)와 섞어준 후 1% normal melting point agarose (NMPA, Sigma, MO, USA)가 코팅된 슬라이드 위에 75 ㎕를 도포하여 굳혀 lysing solution (2.5 M NaCl, 100 mM Na-EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 10, 1% DMSO, 1% Triton X-100, 1% N-lauroulsarcosinate)에 슬라이드를 넣고 4℃ 암실에서 1시간 동안 침지하여 용해시켰다. 용해시킨 다음 슬라이드를 전기영동장치에 배열하고 unwinding buffer (300 mM NaOH, 10 mM Na₂-EDTA, pH 8)를 넣어 20분 동안 unwinding 시킨 후 25 V/300 mA에서 20분 동안 전기영동 시켰다. 전기영동이 끝난 슬라이드를 neutralization buffer (0.4 M Tris, pH 7)로 15분 동안 세척하고 ethidium bromide로 슬라이드의 nucleotide를 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다. 세포핵 이미지는 Komet 5.5 program (Kinetic Image Co. UK)을 사용하였고, 각각의 슬라이드 당 100개 세포의 tail DNA %, olive tail movement (mm), tail length (mm)를 측정하여 분석하였다.

< 실험예 4-3> 실험 결과

결과를 도 4에 나타내었다.

Comet assay는 DNA 손상을 비교적 간단한 방법으로 측정할 수 있어 다양한 연구에 사용되고 있다. 방사선에 의한 DNA 손상에 대한 톳 추출물의 효과를 평가하기 위하여 Comet assay를 실시하였다(도 4). DNA 분열 정도를 나타내는 tail의 길이를 분석한 결과 방사선 조사를 하였을 때 정상 대조군에 비하여 tail의 길이가 길어짐을 확인할 수 있었고 방사선 조사 후 톳 추출물을 처리하였을 때 tail의 길이가 정상 대조군과 비슷한 길이로 짧아지는 것을 관찰할 수 있었다(도 4A~C). 또한, 방사선을 조사한 마우스의 말초면역세포의 tail DNA%, olive tail movement, tail length는 각각 31.9±5.20%, 50.0±10.69 ㎛, 243.6±38.71 ㎛으로 정상 대조군에 비하여 크게 증가한 반면, 방사선 조사 후 톳 추출물 처리군에서는 15.3±3.06%, 16.5±4.69 ㎛, 98.5±15.37 ㎛로 유의성 있게 감소하였다(도 4D~F, p<0.005).

이상의 결과로부터 방사선 조사 후 톳 추출물을 처리하였을 때 방사선으로 인한 DNA 손상이 유의적으로 감소하는 것으로 보아, 톳 추출물이 방사선에 민감한 말초면역세포의 DNA 손상 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

< 실험예 5> 비장세포에서 세포자멸사에 미치는 효과 측정

< 실험예 5-1> 마우스의 비장세포 부유액 준비 및 방사선 조사

< 실험예 5-2> 실험 방법

방사선을 조사한 말초면역세포에서 세포자멸사에 톳 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 PI (propidium iodide) staining을 수행하였다. 비장세포를 단일세포로 분리한 부유액을 정상대조군, 방사선 조사 대조군, 방사선 조사 후 톳 추출물을 처리한 실험군으로 나누어 24-well plate에 2×10⁶cell/well로 넣었고, 실험군에는 6.3 ㎍/ml의 농도로 톳 추출물을 처리하여 배양하였다. 배양한 후 세포를 수확하여 DPBS로 세척한 뒤 차가운 70% 알코올로 세포를 고정시켜 PI reagent (20 ㎍/ml Propidium iodine, 200 ㎍/ml RNase)를 각각 500 ㎕씩 넣고 30분 동안 배양하여 Flow cytometry (FACS Calibur, BD bioscience)를 이용하여 측정하였다.

< 실험예 5-3> 실험 결과

상기 실험결과는 도 5에 나타내었다.

톳 추출물이 방사선에 의한 말초면역세포에 대한 세포자멸사를 분석하기 위하여 PI 염색을 실시하였다. 핵을 염색시키는 PI는 정상세포의 경우 세포막에 가로막혀 염색되지 않지만, 세포자멸사가 일어나 세포막에 구멍이 생긴 세포의 핵은 PI에 염색되게 된다. 이러한 원리를 통하여 세포자멸사를 알아보기 위해 세포자멸사를 나타내는 sub-G1기를 분석하였다. 방사선을 조사한 마우스의 말초면역세포에서 세포사멸을 나타내는 sub-G1의 비율이 19.0%를 나타내었고, 방사선 조사 후 톳 추출물 처리군에서는 11.2%로 정상대조군의 12.3%와 비슷한 수치를 나타내었다(도 5).

이상의 결과로부터 방사선 조사 후 톳 추출물을 처리하였을 때 sub-1기의 비율이 감소하는 것으로 보아, 톳 추출물이 방사선에 민감한 말초면역세포의 세포자멸사를 억제함을 확인할 수 있었다.

< 실험예 6> 비장세포에서 세포자멸사 초기 및 말기 단계에 미치는 효과 측정

< 실험예 6-1> 마우스의 비장세포 부유액 준비 및 방사선 조사

< 실험예 6-2> 실험 방법

방사선을 조사한 말초면역세포에서 세포자멸사 초기 단계(early apoptosis) 및 세포자멸사 말기 단계(late apoptosis)에 톳 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 annexin V/7AAD assay를 수행하였다. 비장세포를 단일세포로 분리한 부유액을 정상대조군, 방사선 조사 대조군, 방사선 조사 후 톳 추출물을 처리한 실험군으로 나누어 24-well plate에 2×10⁶cell/well로 넣었고, 실험군에는 6.3㎍/ml의 농도로 톳 추출물을 처리하여 배양한 후 세포를 수확하였다. 수확한 세포를 1 ml의 차가운 DPBS로 두 번 세척한 뒤 1×binding buffer에 다시 부유시켜 5 ml culture tube에 1×10⁵cell/tube로 분주하였다. 그 후 annexin V (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA)와 7-AAD (BD Pharmingen)를 각각 2.5 ㎕, 5 ㎕씩 처리한 후 실온 (25℃) 암실에서 15분 동안 반응시킨 뒤 400 ㎕의 1×binding buffer를 첨가하였다. 측정 및 분석은 FACS Calibur™flow cytometer와 Cell-Quest™software (BD Biosiences)를 이용하였다.

< 실험예 6-3> 실험 결과

결과를 도 6에 나타내었다.

톳 추출물이 방사선에 의한 말초면역세포의 세포자멸사 초기 단계(early apoptosis) 및 세포자멸사 말기 단계(late apoptosis)를 억제하는지 확인하기 위하여 annexin V, 7AAD 이중염색을 실시하였다. annexin V는 세포자멸사 초기 단계에 세포막의 변성으로 인해 세포 내막에 있던 인지질이 세포막 표면에 노출되는데 이 때, annexin V와 결합하며 7-AAD는 세포자멸사 말기 단계에 핵막이 파괴되면서 핵에 염색된다. 때문에 annexin V 양성/7-AAD 음성인 세포는 세포자멸사 초기단계 세포, annexin V 양성/ 7-AAD 양성인 세포는 세포자멸사 말기 단계 및 괴사(necrosis) 세포로 분석하여 백분율로 나타내었다.

방사선 조사 후 톳 추출물 처리군은 방사선 조사 대조군에 비해 세포자멸사 초기단계가 다소 감소하는 경향을 보였으며, 말기 단계 역시 방사선 조사 대조군에 비하여 약 3.7배 감소하였으나 유의성은 없었다(도 6).

< 실험예 7> 비장세포에서 세포자멸사 관여 인자인 p53 , Bcl -2, Bax 발현 양상 평가

< 실험예 7-1> 마우스의 비장세포 부유액 준비 및 방사선 조사

< 실험예 7-2> 실험 방법

방사선을 조사한 말초면역세포에서 세포자멸사(apoptosis) 를 촉진하는 p53, Bcl-2, Bax의 발현에 톳 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 western blotting을 수행하였다. 비장세포를 단일세포로 분리한 부유액을 정상대조군, 방사선 조사 대조군, 방사선 조사 후 톳 추출물을 처리한 실험군으로 나누어 1×10⁸cell/well로 넣었고, 실험군에는 6.3 ㎍/ml의 농도로 톳 추출물을 처리하여 배양한 후 세포를 수확하였다. 세포를 수확한 후 용해액 (lysis buffer, 40 mM Tris, 120 nM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 ㎍/ml leupeptin, 2 mM sodium orthovanadate, 10 ㎍/ml aprotinin (Sigma-Aldrich, MO, USA))에 넣어 12,000 rpm으로 20분 동안 원심 분리하여 단백질을 추출하였고 추출한 단백질을 정량하여 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (10% SDS PAGE)를 이용하여 전기영동하였다. 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스 막 (nitrocellulose membrane)에 25 V에서 10분 동안 전이시킨 후 비특이적 반응을 방지하기 위하여 2% 탈지우유(skim milk)를 사용하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. Horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-mouse를 사용하여 실온에서 45분 동안 반응시키고 단백질 밴드는 ECL detection kit (Amersham, UK)로 발현시켜 Fusion Solo®(Vilver Lourmat, France)를 이용하여 이미지를 얻었다. 각각의 밴드는 Bio-1D®program (Vilber Loumat)을 이용해 분석하였다.

< 실험예 7-3> 실험 결과

상기 실험결과를 도 7에 나타내었다.

방사선 조사 조사 후 세포자멸사에 관련된 단백질인 p53, Bcl-2, Bax의 변화를 western blot을 통하여 확인하였다(도 7).

세포자멸사를 유도하는 분자인 p53의 발현이 방사선을 조사한 마우스의 말초면역세포에서 0.69±0.14%로 정상 대조군의 0.55±0.20% 보다 다소 증가하는 경향을 보였으며, 방사선 조사 후 톳 추출물 처리군에서는 0.36±0.16%로 감소하는 경향을 보였다(도 7A 및 B). 세포자멸사를 유도하는 또 다른 분자인 bax의 발현 또한 p53과 비슷한 경향을 보였다(도 7A 및 C). 세포자멸사를 억제하는 기능을 가진 bcl-2의 발현은 정상대조군 0.26±0.06% 보다 방사선을 조사한 마우스의 말초면역세포에서 0.22±0.06%로 다소 감소하는 경향을 보였으며, 방사선 조사 후 톳 추출물 처리군에서는 0.64±0.02%로 유의성있게 증가하는 경향을 보였다(도 7A 및 D). Bax와 bcl-2의 비율을 측정한 결과 정상 대조군과 방사선 조사군에서는 큰 차이를 보이지 않았으나, 방사선 조사 후 톳 처리군에서 크게 감소하는 경향을 보였다(도 7E).

이상의 결과로부터 방사선 조사 후 톳 추출물을 처리하였을 때 세포자멸사를 유도하는 분자인 p53과 bax의 발현이 감소함을 확인할 수 있었고, 세포자멸사를 억제하는 분자인 bcl-2의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다.

통계처리

상기 각각의 실험결과는 평균값±표준편차로 나타내었다. Microsoft®Office Excel®2010을 이용하 여Student t-test를 실시하였으며 * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.005의 수준에서 유의성을 검정하였다.

Claims

톳 추출물을 유효성분으로 포함하되,
상기 톳 추출물은 수세한 톳을 동결건조하여 얻은 톳 분말에 톳 1g 당 100㎖의 증류수를 가하고 100℃에서 12시간 동안 추출하여 얻은 추출물인 것을 특징으로 하는 방사선에 의한 비장세포 장해 방호용 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.