KR100994444B1 - 황기 지상부로부터 추출된 다당체 및 이를 함유하는 약학 조성물 - Google Patents
황기 지상부로부터 추출된 다당체 및 이를 함유하는 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 황기(Astragalus membraanaceus Bunge) 지상부로부터 추출된 다당체, 상기 다당체 또는 이를 포함하는 황기 추출물을 유효성분으로 함유하는 생체방어기능 또는 면역증강 활성을 갖는 약학 조성물, 및 황기 지상부로부터 추출하여 상기 다당체를 분리하는 방법에 관한 것이다.
황기, 지상부, 다당체, 생체방어, 면역증강
Description
본 발명은 황기 지상부로부터 추출된 다당체 및 이를 함유하는 약학 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 상기 다당체 또는 이를 포함하는 황기 추출물을 유효성분으로 함유하는 생체방어기능 또는 면역증강 활성을 갖는 약학 조성물 및 황기 지상부로부터 추출하여, 상기 다당체를 분리하는 방법에 관한 것이다.
유아나 고령자 등과 같은 면역능 저하 위험군에 속하는 사람이나 만성관절 류마치즘, 피부근염, 경피증, 다발성 동맥염 등과 같은 교원병, 만성신부전과 악성 종양 등의 환자에게 행하여지는 투석, 임플란트, 장기이식 및 수술 등과 함께 시술되는 면역 억제적 치료에 의해 환자의 감염 억제능이나 면역능이 저하된다. 이로 인하여 합병증을 수반하는 반복 감염이 되풀이되고 약제 내성균의 이차감염에 의해 난치성 감염증으로 이행되고, 환자의 삶의 질의 저하를 초래하고 있다. 고령화 사회에 이미 돌입한 21세기에서의 감염증의 억제에는 적절한 진단법과 항감염증 약제의 개발과 함께 생체방어기구를 부활시키고 면역능을 증대시킬 수 있는 약제와 기 능성 식품의 개발이 요구되고 있다.
일반적인 상태에서 점막 면역계는 많은 병원체의 감염을 막는 장애물로서 작용 하는데 분화된 장 상피세포층은 단단한 방벽을 형성하여 장 내강으로부터 박테리아 및 여러 가지 물질의 침투를 막는다 (Knight and Girling 2003, Lancet. 361: 512-519). 국소점막에 존재하는 점막면역계가 감염방어의 중요한 역할을 담당하고 있는데 오클루딘(occludin), zo-1, 클라우딘(claudin) 같은 tight junction 단백질 (항원의 침입을 막는 구조), 분비성 IgA, 점액소, 디펜신(defensin), 트레포일 펩티드(trefoil peptide), 쇄자연 글리코칼릭스(brush border glycocalyx)가 방벽 기능을 담당한다. 장내 세균이 없는 germ-free 상태에서 항원의 통과가 증가하는 현상은 장내 세균의 정착이 장의 방벽 기능에 필수적 역할을 하는 것을 보여준다. 저산소증, 빈혈, 관류손상에 기인하여 점막의 이러한 장애물이 사라지는 경우 혈액으로 박테리아나 그들의 내생독소(endotoxin) 들이 들어가게 되고 다발성 장기기능부전 (multiple organ dysfunction syndrome)과 전신성 염증반응증후군 (systemic inflammatory response syndrome)이 유도된다 (Meng et al. 2001, Am J Physiol Cell Physiol. 280: C343-351). B세포와 T세포, 마크로파아지에서 인터루킨 6에 의해 IgA의 생성이 억제되고 소화관, 호흡기, 생식기, 외분비선 등 국소점막면역계는 그 조절기구가 파괴되어 기능저하와 이상을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Mestecky et al. 2005, Mucosal Immunology 3rd Ed. pp. 158-181). 장관면역계의 기능저하는 방벽기능을 파괴로 인하여 식품이나 자기항원 단백질이 스스로의 면역계에 인지되어 자기면역질환이 일어나고 장내 미생물 간의 불균형과 장의 방멱 기 능의 감소로 인해 장내 세균에 대한 관용이 소실되어 염증성 장질환이 유발되고 위액의 산도저하, 점막 상피의 미숙, 단백 소화효소의 부족, 분비형 IgA 부족 등의 다양한 장 장벽의 미숙으로 인하여 장관면역계로의 식품 항원 노출이 증가되므로, 유전적 소인을 타고난 영아의 경우 식품 항원은 IgE 매개 혹은 비 IgE 매개 면역반응을 자극하게 된다. 장 장벽이 성숙된 후에도 약 2%의 식품단백은 완벽한 항원성을 유지한 채 흡수되지만 대부분의 사람은 이미 면역관용이 유도되어 있으므로 문제가 되지 않으며 단지 감작된 개체에서는 극소량의 식품 항원에 의하여도 과민반응이 유발되어 피부염, 알러지 등의 알레르기성 질환이 유도된다.
사람은 끊임없는 외부로부터 침입해 오는 세균이나 바이러스와 같은 여러 가지 미생물과 매우 밀접한 관계를 가지면서 생존하게 된다. 병원미생물에 대해서는 자연(innate) 및 획득(acquire) 면역을 작동하여 적극적으로 반응하는 반면 상주 미생물에 대해서는 무반응, 혹은 무시상황을 구축하여 공생관계를 유지한다. 이와 같은 정밀하고 역동적인 관계를 구축하고 있는 생명체의 고차원적 방어시스템이 면역체계이고 그 최전선에서 방어기능으로서 활약을 하고 있는 것이 점막면역(mucosal immunity) 시스템이다. 최근 관심을 받고 있는 신종인플루엔자뿐만 아니라 SARS, AIDS, 대장균, 결핵, 콜레라 같은 감염증을 일으키는 병원 미생물의 침입경로는 체외와 체내의 접점으로 되어 있는 호흡기, 소화기, 비뇨 생식기 등을 덮고 있는 광대한 점막조직으로 이러한 점막면역체의 주요한 특징은 유도조직(Inductive site)과 실행조직(Effective site)으로 구성되는 점막면역순환기로경로(CMIS: Commom Mucosal Immune System)을 통해서 주사면역으로 획득할 수 없었던 광범위한 점막조직과 그 분비액 중에 항원 특이적 면역반응을 유도할 있다. 나이가 들어감에 따라 흉선에서 작용하는 면역 기능을 대신하여 소장의 상피세포에서 T세포가 분화하여 면역기능을 수행할 수 있다는 점이다.
장관면역계에는 파이엘판(peyer's patch)이 중요한 유도조직으로서 기능을 하고 있고, 공통점막면역기구(CMIS)의 유지와 조절에 중심적인 역할을 수행하여, 기관과 호흡기, 비뇨생식기 등 국소의 점막면역계를 조절한다고 알려져 있다 (McGhee et al. 2005, Journal of immunology 175: 1361-1362). 파이엘판에 작용하여 면역세포의 기능을 증강하거나 저하된 면역세포를 부활시킬 수 있는 물질이 국소점막의 생체방어기구를 증강시킬 수 있을 것으로 생각되며 이러한 예는 인비트로(in vitro)상에서 가열처리된 비피더스 균사체가 파이엘판 면역담당세포에서 IgA 생산과 축적을 증대시킴으로써 기도로의 인플루엔자 감염을 방지할 수 있다는 연구결과가 보고되고 있다 (Hiramatsy et al. 2007, Cytotechnology 55: 79-87). 따라서 파이엘판의 면역담당세포의 기능을 부활시키는 것을 지표로 하여 생체방어기구를 부활할 수 있는 물질을 선발할 수 있을 것으로 생각된다.
황기(Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge)는 한국, 일본 등 아시아 지역과 러시아, 불가리아 등 유럽에 이르기까지 널리 분포하는 콩과에 속한 다년생 초본 식물로서 주근은 깊고 길며 막대기 모양이고 약간 목질을 띄고 줄기는 직립하고 지상부에서 많이 분지되며 매끄럽고 광택이 있거나 약간의 털로 덮여 있다. 황기의 생리활성성분으로서 트리테르페노이드 글리코사이드 계통과 플라보노이드 계통이 주를 이루고 있고, 그 외 사포닌 및 폴리사카라이드 성분 등을 함유하고 있어 (Fang et al. 1982, Org. Chem. 30: 26-32; Kitagawa et al. 1983, Chem. Pharm. Bull. 31: 716-722; Chen and Liu 1988, Acta. Pharm. Sin. 23: 20-218; Subarnas et al. 1991, Planta Med. 57: 590; Cui et al. 1992, Chem. Pharm. Bull. 40: 3330-3339, 예로부터 보기제로서 널리 사용되어 왔고 한방에서 이뇨제, 빈혈증, 식욕부진, 지한제, 강장제 등으로 사용되어 왔다 (Sun et al. 1981, Chin. Med. J. 61: 97-101; Tu 1988, Pharmacopoeia of the People's Republic of China, p.109-112). 또한, 황기는 신농본초경에 상약으로 수록되어 있어 우리 나라 한방에서는 보증익기탕, 황기건중방, 황기계지오물방, 십전대보탕, 가미대보탕, 황기육일탕, 팔보회춘탕 등 수 백가지 처방에 황기가 인삼 다음으로 많이 쓰이는 보기약이다 (Song et al. 2004, Planta Med 70: 1222-1227; Chiang Su 1977, Dictionary of Chinese Crude drugs, Shanghai Scientific Technologic Publisher, Shanghai, p. 2036).
천연에서 유래한 다당체는 면역시스템이 영향을 미치는 거대분자로서 면역조절제로서의 잠재성이 있어 광범위한 임상적 적용이 이루어지고 있다. 예를 들면 버섯류로부터 분리된 다당체인 베타글루칸은 대식세포의 활성화를 통한 항암활성을 가진다 (Wasser 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:258-274). 식물체의 세포벽이나 담자균류 박테리아로부터 분리된 베타글루칸은 포도당 중합체로서 항암활성과 항감염활성을 가지고 있다 (Kataoka et al. 2002, J. Biol. Chem. 277:36825-36831; Ohno et al. 2001, Biol. Pharm. Bull. 24:820-828; Brown and Gordon 2003, Immunity 19:311-31). 현재까지 처방되는 한방제제 중, 보재로 분류된 십전 대보탕과 소자호탕 등에 대한 활성검정에서, 이런 한방제제가 각종 면역세포를 부활시키는 효능을 검정하고 그 면역능 증대에 있어 제제에 포함된 고분자성 다당성분에 기인한다는 것이 증명되고 있으며 (Yamada 1999, Pharmacolcgical Research on Traditional Herbal Medicines (eds. H. Watanabe and T. Shibuya) pp. 179-196; Borchens et al. 2000, J. Ethnopharmacolgy, 73: 1-13) 또, 십전대포탕에서 구성 약재 중 창출(Atractylpdes lances DC.의 근경에 포함된 다당성분에 의해 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 감염된 마우스에 대해 감염 방어와 억제 활성이 보고되고 있다 (Inagaki 2001, Planta Medica 67: 428-431). 이런 점에서 한방제제에 포함된 식물성 생약에서 기원하는 고분자 다당성분이 생체방어기구의 저하와 면역능 감소에 의해 유도되는 감염증 치료와 예방에 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
황기는 인삼과 함께 강력한 생체 기능 부활제로 이용되고 있는 한방재의 하나로서 동북황기(Astragalus membranaceus Bunge) 및 내몽고황기(Astragalu mongholicus Bunge) 동속 식물 뿌리를 주피를 제거하여 건조한 것으로 사용하고 있다. 저분자 성분으로는 폴모네틴(formonetin) 및 캘리코신(calycosin)과 같은 플라보노이드(flavonoid)계와 아스트라갈로시드(astragaloside) I-VIII 등의 사포닌(saponin)계 물질이 주요성분으로 함유되어 있고, 아스트라갈로시드 IV가 한약재 감별에서 이화학적 성분 시험에 사용되고 있다. 그러나, 황기의 지상부는 현재 약용으로 사용되지 못하고 있고, 식품으로 분류된 천연소재로 취급되고 있어 유효성분의 분석과 분리가 이루어지지 못하고 있으며, 유용한 이용성에 대한 고찰이 없이 대부분 폐기되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 황기의 지상부에 생체방어기능을 부활하고 면역능을 개선시킬 수 있는 다당 및 다당혼합물이 함유되어 있을 것으로 예상하고 이러한 지상부의 다당체를 분리하여, 구조를 동정하고 공통점막면역기구에 의해 중심적인 역할을 하는 장관 파이엘판에 있는 면역 담당세포의 면역기능 증강에 미치는 효과를 검정하여, 생체방어기구를 부활시킬 수 있는 고분자활성 다당 성분을 제공하고, 동시에 이것을 유효 성분으로 하는 약제 및 건강식품을 제공하는 것을 목표로 하고 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 황기 지상부로부터 추출된 다당체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 다당체 또는 이를 포함하는 황기 추출물을 유효성분으로 함유하는 생체방어기능 또는 면역증강 활성을 갖는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 황기 지상부로부터 추출하여, 상기 다당체를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른, 황기 지상부로부터 추출되어 제조된 다당체 또는 상기 다당체를 포함하는 황기 추출물은 장관 파이엘판 속의 면역담당세포의 기능을 부활시키고, 면역능 증강 작용 및 강력한 장관면역개선 효과를 가질 것으로 기대된다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황기 지상부로부터 추출되고, 아라비노오스(arabinose), 람노오스(rhamnose), 푸코오스(fucose), 자일로오스(xylose), 만노오스(mannose), 갈락토오스(galactose), 글루코오스(glucose), 글루쿠론산(glucuronic acid) 및 갈락투론산(galacturonic acid)으로 구성된 다당체를 제공한다. 상기 다당체는 중량평균분자량(Mw)이 72,000 내지 375,000 달톤(dalton)일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 다당체 또는 이를 포함하는 황기 추출물을 유효성분으로 함유하는 생체방어기능 또는 면역증강 활성을 갖는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 생체방어기능 또는 면역증강 활성을 갖는 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 분획물을 0.02 내지 50 중량%로 포함할 수 있다. 그러나, 추출물 또는 분획물의 함량은 상기한 수치에 한정되지 않으며, 사용방법 및 제형에 따라 적절히 조절하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 추출물 또는 분획물을 포함하는 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 추출물 또는 분획물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 추출물 또는 분획물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 사용방법 및 용도에 따라 적절히 조절할 수 있다. 추출물 또는 분획물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 추출물 또는 분획물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 분획물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 추출물 또는 분획물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 생체방어기능 또는 면역증강 활성 효과를 나타내는 상기 추출물 또는 분획물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 황기 추출물 또는 분획물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 생체방어기능 또는 면역증강 활성 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물 또는 분획물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있으며, 식품의 종류 및 사용방법에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물 또는 분획물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 추출물 또는 분획물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물 또는 분획물들은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러 한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 또는 분획물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 또한,
a) 황기 지상부를 물로 추출하여 조추출물을 얻는 단계;
b) 상기 조추출물을 여과 및 원심 분리하여 건조물을 제조한 후, 유기용매를 첨가하여 용해 분획하여 지질성분을 제거하는 단계; 및
c) 상기 지질성분이 제거된 침전물을 정제수에 용해하여 에탄올 침전 및 투석을 이용하여 다당체 분획을 얻는 단계를 포함하는, 상기 다당체의 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 추출물을 얻기 위하여 통상적으로 이용되는 열수추출, 실온추출, 가온추출 및 초음파추출 등의 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 분획 공정은 통상의 방법으로 수행할 수도 있다 (Harborne, 1998, Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed., Academic Press, New York, pp. 6-7). 바람직하게는 헥산, 에틸 아세테이트, n-부탄올, 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 분획될 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 더욱 바람직하게는 에탄올 침전 및 투석을 이용하는 것이다.
본 발명에서는 추가로 상기 다당 분획을 이온크로마토그래피와 겔여과크로마토그래피를 이용하여 분리하는 단계; 각 분리된 다당체의 구성당과 우론산 함량을 분석하는 단계; 분리된 다당체의 공통 당쇄인 β-D-(1→3,6)-galactan을 효 소(galactanse)로 가수분해하고 이온크로마토그래피를 이용하여 공통 당쇄를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
황기
지상부로부터
열수추출물
분획 취득
황기 지상부 (뿌리를 제외한 나머지 부분) 1 kg에 대해 20 배 부피의 증류수를 첨가하고 분쇄, 교반한 후 처음 첨가된 증류수의 절반이 되는 양까지 가열한다. 다시 동일한 양의 증류수를 이용해 추출하고 추출액을 합하여 흡인 여과한후 여과액을 합하여 감압농축하고 농축된 양의 5배의 에탄올을 첨가하여 침전시키고 남은 침전물을 대상으로 4℃에서 30분간 7,000 rpm으로 원심 분리하여 상등액과 잔사로 분리하였다. 상등액을 다시 동결 건조하여 열수추출물 분획을 얻었다 (AMA-0, 19.42g, 수율; 1.942%).
황기 지상부 열수추출물 분획 (AMA-0, 10.0g)을 정제수 500㎖에 재용해한 후, QAE-Sepharose FF(HCO3) 컬럼(5.6×38cm)에 첨가하여 흡착시키고, 정제수(1.5L)를 사용해 세정해서 미흡착 분획을 제거하였다. 흡착 분획을 0.068M, 0.115M, 0.159M 및 0.582M의 NH4HCO3 용액으로 차례로 용출시켜 각 획분을 투석(Spectra/pore4 with MWCO 3500, 12000-14000), 농축 및 동결 건조하여 4개의 획분, 즉 AMA-1-a 용출분획 (2.0L NH4HCO3, 4.8%), AMA-1-b 용출분획 (1.8L NH4HCO3, 3.2%), AMA-1-c 용출분획 (2.0L NH4HCO3, 3.3%), AMA-1-d 용출분핵 (8.0L NH4HCO3, 33.4%)의 4개 분획을 얻었다.
4개의 분획 중 AMA-1-a에 대하여 0.2 M NaCl 용액으로 평형화된 Sepharose CL-6B 컬럼(2.5×94cm)에서 겔 여과 크로마토그라피(gel filtration chromatogrphay)를 실행하여 1개의 획분을 얻었으며 (AMA-1-a-PS1, 0.54%) AMA-1-b 분획은 0.2 M NaCl 용액으로 평형화된 Sephacryl S-200(1.7×82 cm)에서 겔 여과 크로마토그라피를 행하여 2개의 획분 (AMA-1-b-PS2, 0.13%; AMA-1-b-PS3, 0.52%)을 얻었고 AMA-1-c에서도 Sephacryl S-300(2.6×90 cm)를 이용하여 1개의 획분 (AMA-1-c-PS4, 0.04%)을 얻었다. AMA-1-d에서는 0.2M NaCl로 평형화한 Sephacryl S-300컬럼 (2.6×90㎝)과 Sepharose CL-6B 컬럼 (2.6㎝×85㎝)을 사용해 분획하고, AMA-1-d-PS5 (다당 획분으로 수율 2.4%) 및 AMA-1-d-PS6 (다당 획분으로 수율 2.9%)를 얻었다. 정제된 활성 획분 PS1-6의 순도를 확인하기 위하여 Shodex OHpak SB-805 (8×300 mm, Showa Denko K. K., Tokyo, Japan) 컬럼이 장착된 Waters 2690 HPLC (Waters, Milford, MA)를 0.2 M NaCl 용액으로 용출시키면서 (0.5 mL/min) RI(refractive index) detector를 이용하여 행하였으며, 정제 다당의 중량평균분자량(Mw) 측정을 위해 표준물질로 덱스트란 T-2000(2×106), T-500, T-70 및 포도당을 사용하여 구한 표준곡선과 Kav값을 비교하여 측정하였다.
분리된 총 6개 분획의 다당체의 총당, 산성당 및 단백질 함량은 각각 갈락토스, 갈락투론산 및 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 하여 페놀황산법(phenol-sulfuric acid method), m-hydroxybiphenyl법과 Lowry법으로 각각 정량하였다. 한편, 각각의 분리 및 정제단계에서 얻은 시료에 대하여 중성당의 경우 Jones와 Albersheim의 방법으로 2.0 M TFA(trifluoroacetic acid)로 121℃에서 1.5시간 동안 시료를 가수분해시킨 후 NaBH4를 이용하여 중성당을 알디톨(alditol)로 환원시키고, (CH3CO)2O를 이용하여 알디톨 아세테이트(alditol acetate) 유도체로 전환시켜 SP-2380 컬럼(0.2 μm film, 0.25 mm i.d×30 m, Supelco, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas-liquid chromatography(HP-6890 II GLC, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA)로 구성당을 분석하였다. 또한 산성당의 경우에 있어서는 0.1 M TFA로 100℃에서 1시간 동안 가수분해시킨 후 NaBD4를 이용하여 중성당의 경우와 유사한 조건으로 알디톨 아세테이트 유도체로 전환시켜 GLC를 실시하였다. 구성당 분석을 위한 GLC의 온도조건은 injector 250℃, detector 250℃이었고 컬럼은 60℃에서 1분이 경과하면 30℃/분의 속도로 220℃ 까지 상승시킨 후 12분간 유지하고, 다시 8℃/분의 속도로 250℃까지 상승시켜 15분을 유지하는 조건이었으며, 표준 당류의 retention time과 비교하여 시료 중의 구성당을 분석하였고 구성당의 mol%는 각 피크들의 면적비와 구성당의 알디톨 아세테이트 유도체의 중량평균분자량(Mw)으로부터 계산한 후 몰비(molar ratio)로 표기하였다. 우론산 함량을 m-hydroxybiphenol 법에 의해 각각 측정하였다. 그 결과 분리된 6개의 다당 분획체의 당구성과 단백질함량, 우론산 함량은 다음과 같았다.
표 1. DEAE-Sepharose FF, Sepharose CL:6B 및 Sephacryl S-200 상에 황기(Astragalus membranaceus Bunge) 지상부 추출물 각 분획의 물리화학적 성질
| Fraction1 ) | AMA -1-a- PS1 | AMA -1-b- PS2 | AMA -1-b- PS3 | AMA -1-c- PS4 | AMA -1-d- PS5 | AMA -1-d- PS6 |
| Yield (%) | 0.54 | 0.13 | 0.52 | 0.04 | 2.4 | 2.9 |
| Molecular weight ( Da ) | 75000 | 345000 | 87000 | 345000 | 129000 | 88000 |
| Contents (%) | ||||||
| Cabohydrate | 96.2 | 92.1 | 91.8 | 91.5 | 72.6 | 54.1 |
| Uronic acid | 3.5 | 3.2 | 3.6 | 3.3 | 25 | 43.2 |
| Protein | 0.3 | 4.7 | 4.6 | 5.2 | 2.4 | 2.6 |
| Component sugar( 몰비 ) | ||||||
| Arabinose | 19.1 | 12.8 | 35.4 | 15.2 | 25.3 | 9.9 |
| Fucose | 0.8 | 4.5 | 0.6 | 4 | 0.3 | 0.2 |
| Galactose | 36 | 25.6 | 46.3 | 24.1 | 26.2 | 11.8 |
| Glucose | 14.8 | 23.6 | 4.1 | 17.6 | 3.9 | 4.1 |
| Mannose | 17.8 | 24.8 | 4.6 | 28.5 | 4.6 | 5.2 |
| Rhamnose | 4.1 | 5.1 | 2.5 | 5.3 | 9 | 6.1 |
| Xylose | 6.1 | 0.7 | 3.5 | 0.4 | 2.3 | 1 |
| Galacturonic acid | 0.5 | 1.5 | 0.5 | 2.4 | 24.9 | 58.6 |
| Glucuronic acid | 0.8 | 1.4 | 2.5 | 2.5 | 3.5 | 3.1 |
|
1)
PS1
:
AMA
-1-a의 0.2 M
NaCl
용액으로 평형화된
Sepharose
CL
-6B에 의해 얻은 획분;
PS2
및
PS3
:
AMA
-1-b의
Sephacryl
S-200에 의해 얻은 획분;
PS4
:
AMA
-1-c의
Sephacryl
S-300 에 의해 얻은 획분;
PS5
및
PS6
:
CUI
-3
IIb
의
Sephacryl
S-300 및
Sepharose
CL
-6B에 의해 얻은 획분.
2)탄수화물 함량: 페놀-황산법 (갈락토스로서). 3) 우론산 함량: m- hydroxydiphenyl 법 ( 갈락투론산으로서 ). 4)단백질 함량: Lowry 법 ( BSA 로서). |
||||||
1) PS-1
DEAE-Sepharose FF의 0.0686 M NaCl 용출액을 통하여 얻은 활성 획분인 AMA-1-a에 대하여 0.2 M NaCl 용액으로 평형화된 Sepharose CL-6B 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)를 이용하여 겔여과(gel filtration)를 실시하여 1개의 획분 (AMA-1-a-PS1)을 얻었다. 이 분획의 중량평균분자량(Mw)은 75,000 Da으로 당함량은 96.2%를 당표준물질인 아라비노스(arabinose), 만노스(Mannnose), 갈락토스(Galctose), 포도당(Glucose)의 몰비가 1.4:1.3:2.6:1.0 (Ara:Man:Gal:Glc=1.4:1.3:2.6:1.0)을 나타내었고, 산성당은 1.3% 단백질은 0.3%, 우론산 함량은 3.5% 로 구성된 다당류가 주 구성성분인 획분이었다.
2) PS-2
DEAE-Sepharose FF의 0.115 M NaCl 용출액을 통하여 얻은 활성 획분인 AMA-1-b 분획을 0.2 M NaCl 용액으로 평형화된 Sephacryl S-200(1.7×82 cm)에서 겔 여과 크로마토그라피를 행하여 2개의 획분 (AMA-1-b-PS2, AMA-1-b-PS3)를 얻었으며 AMA-1-b-PS2의 중량평균분자량(Mw)을 검정하여 본 결과 345000 Da, 당함량은 92.1%, 당표준물질 아라비노스, 만노스, 갈락토스, 포도당의 몰비가 0.5:1.1:1.1:1.0로 나타났고 산성당은 2.9%, 단백질은 4.7%, 우론산 함량은 3.2%로 구성된 다당류가 주 구성성분인 획분으로 나타났다.
3) PS-3
AMA-1-b-PS3 획분은 모분획인 AMA-1-b로부터 PS-2를 얻는 과정과 동일하게 적용하여 중량평균분자량(Mw) 87000 Da의 PS-3를 획득하였다, PS-3에서 당표준물질인 아라비노스, 갈락토스 몰비가 1.3:1로 나타났고 산성당은 3.0%, 단백질은 4.6%, 우론산 함량은 3.6%로 구성된 다당류가 주 구성성분인 획분으로 나타났다.
4) PS-4
DEAE-Sepharose FF의 0.159 M NaCl 용출액을 통하여 얻은 활성 획분인 AMA-1-c 분획을 0.2 M NaCl 용액으로 평형화된 Sephacryl S-300(2.6×90 cm)에서 겔 여과 크로마토그라피를 행하여 1개의 획분 (AMA-1-c-PS4)을 얻었다. AMA-1-c-PS4의 중량평균분자량(Mw)은 345000 Da, 당표준물질 아라비노스, 만노스, 갈락토스, 포도당의 몰비가 0.9:1.6:1.4:1로 나타났고, 산성당은 4.9%, 단백질은 5.2%, 우론산 함량은 3.3%로 구성된 다당류가 주 구성성분인 획분으로 나타났다.
5) PS-5
DEAE-Sepharose FF의 0.582 M NaCl 용출액을 통하여 얻은 활성 획분인 AMA-1-d 분획을 0.2 M NaCl 용액으로 평형화된 0.2 M NaCl 용액으로 평형화된 Sepharose CL-6B 컬럼 크로마토그래피와 Sephacryl S-300(2.6×90 cm)를 이용한 겔 여과 크로마토그라피를 행하여 2개의 획분 (AMA-1-d-PS5, AMA-1-d-PS6)을 얻었다. AMA-1-d-PS5의 중량평균분자량(Mw)은 129000 Da, 당표준물질 아라비노스, 갈락토스, 갈락투론산 몰비가 1.0:1.0:1.0로 나타났고, 산성당은 28.4%, 단백질은 2.4%, 우론산 함량은 25.0%로 구성된 다당류가 주 구성성분인 획분으로 나타났다.
6) PS-6
AMA-1-d-PS6 획분은 모분획인 AMA-1-b로 부터 PS-5를 얻는 과정과 동일하게 적용하여 중량평균분자량(Mw) 88000 Da의 PS-6를 획득하였다, AMA-1-d-PS6의 갈락토스, 갈락투론산 몰비는 5.0:1.0으로 나타났고, 산성당은 61.7%, 단백질은 2.6%, 우론산 함량은 43.2%로 구성된 다당류가 주 구성성분인 획분으로 나타났다.
실시예
2.
PS1
-
PS6
다당 성분에 공통
당쇄인
β-D-(1→3,6)-galactan
상기 실시예 1로부터 얻어진 다당 성분의 미세한 당쇄구조를 검토하기 위하여 구조 특이적인 당쇄분해효소인 exo-β-D-(1→3)-galactanase 및 endo-β-D-(1→6)-galactanase를 처리하여 다당 성분으로부터 효소가수분해에 의해 얻어진 올리고당 구성성분을 고속 음이온교환크로마토그래피를 이용하여 검정하였다. 표준올리고 당에 대하여 동일한 효소처리 이후에 각각의 얻어진 올리고당 구성 성분간 머무름 시간(rentention time)을 비교하였다.
본 발명에 이용한 exo-β-D-(1→3)-galactanase는 보통 기계충버섯에서 분리시킨 다당분해효소로써 β-D-(1→3)-에 결합되어 있는 갈락토스를 비환원말단에서 순차적으로 분해해가는 효소로, 만약 β-D-(1→3)-결합한 갈락토스이고 이 구조에 6번째 위치에 여러 종류의 당쇄가 측쇄로 결합한 경우 (β-D-(1→3,6)-galactan쇄 라고 불린다)에 주 연결구조의 β-D-(1→3)-결합되어 있는 갈락토스를 절단할 수 있는 특이성을 가지고 있다. 대개의 β-D-(1→3,6)-galactan 연결쇄 등에서는 구성된 갈락토스에 Arabinofurase가 측쇄로서 결합해 있는 경우가 많이 관찰되고 있으며, Arabinofurase 측쇄가 exo-β-D-(1→3)-galactanase에 의한 β-D-(1→3)-galactan쇄의 효소반응에 있어 그 효율을 저하시키는 것으로 보고되고 있다 (Taguchi 등 2004, Carbohydrate Research 339: 763-770). 이 경우 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 등에서 유래한 exo-α-L-arabinofuranosidase를 exo-β-D-(1→3)-galactanase와 함께 효소처리하면 exo-β-D-(1→3)-galactanase의 효소가수분해의 효율이 상승하여진다고 보고되고 있다 (Yu 등 1998, Planta Medica 64: 714-719).
또한, endo-β-D-(1→6)-galactanase는 트리코델마 비리데(Trichoderma viride)에서 유래되는 더 정제된 다당연결쇄 분해효소로, β-D-(1→6)-에 결합한 Gal이 3개 이상 직선상태의 연결쇄 상태로 결합하여 있는 올리고당 또는 다당연결쇄를 절단하고, 최종생성물로서 단당의 주 연결쇄에서 갈락토스를 분해하여 내고 측쇄에 연결된 β-D-(1→6)-결합한 갈락토스를 분해하도록 하는 것이다 (Okemoto 등 2003, Carbohydrate Research 338: 219-230).
본 발명에서는, 상기 기술한 2종의 효소를 이용해서 본 발명에서 다당성분 연결구조를 검정하였다. 6종의 황기 지상부 다당성분 (PS-1∼PS-7)과 아라비노갈락탄(Arabinogalactan) UF Powder (Larex Inc., White Bear Lake, MN, USA). 표준품 1 mg을 각각 50mM 아세테이트 버퍼 (pH 4.2, 2.0ml)에 용해한 후, exo-β-D-(1→3)-galactanase (0.1U, 10μL) 및 exo-α-L-arabinofuranosidase (0.01U, 10μL)를 이용하여 효소가수분해를 수행하였다 (37℃, 2일간). 얻어진 가수분해액을 AG50W-X8 (H+형) 수지 컬럼(resin column)으로 탈염 후, 동결 건조하여, exo-β-D-(1→3)-galactanase 가수분해산물을 획득하였다. 상기 가수분해물을 50mM 아세테이트 버퍼 (pH 4.2) 1mL에 용해하고, endo-β-D-(1→3)-galactanase (0.1U, 5μL)를 가해 가수분해 하고 (37℃, 8시간), 얻어진 가수분해산물을 다시 AG50W-X8 (H+형) 수지 컬럼을 이용하여 탈염하고 동결건조하여 최종 가수분해물을 얻었다.
exo-β-D-(1→3)-galactanase 및 exo-α-L-arabinofuranosidase를 효소처리 하여 생성된 6종의 황기 지상부의 다당 성분을 고속 음이온교환 크로마토그래피에 의해 분석한 결과, 아라비노갈락탄(Arabinogalactan) 표준품은 exo-β-D-(1→3)-galactanase 처리에 따라 아라비보스(arabibose)와 갈락토스가 분해되어 검출되었으며 갈락토스는 G2~G18당까지 분해되어 나왔고 endo-β-D-(1→6)-galactanase 처리에 의해 G3∼G8당의 올리고당은 거의 소실되고 G2당의 올리고당은 증가하는 경향이 관찰되었다. 황기 지상부의 6종 다당 성분에서도 아라비노갈락탄 표준품을 exo- β-D-(1→3)-galactanase와 endo-β-D-(1→6)-galactanase를 처리한 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 따라서 황기 지상부의 다당성분 6종은 모두 아라비노갈락탄을 공통구조로 하는 당쇄구조를 가지고 있는 것으로 확인되었다.
실시예
3.
AMA
-1-b-
PS2
에 대한 효소처리 가수분해 산물에 대한
TLC
분석
6종의 황기 지상부 다당성분 중 AMA-1-b-PS2를 대상으로 하여 exo-β-D-(1→3)-galactanase (0.1U, 10μL) 및-L-arabinofuranosidase (0.01U, 10μL)를 이용하여 효소가수분해를 exo-α수행하고 (37℃, 2일간), 얻어진 가수분해액을 실리카겔판을 이용한 박층크로마토그래피(thin layer chromatography)를 수행하여 다양한 단당류 표준품과 비교하였으며 전개 특성에 따라 효소처리 이후 분해된 단당의 구성이 확인하였다. 전개용매는 부탄올:에탄올:클로로포름:암모니아 (4:5:2:8) 용액을 사용하였으며 1% 바닐린(vanilin)이 함유된 황산용액(sulphuric acid)으로 발색시켰다.
황기 지상부 다당성분 중 AMA-1-b-PS2를 대상으로 exo-β-D-(1→3)-galactanase 및 exo-α-L-arabinofuranosidase를 효소처리 수행하고 분해되어 형성된 단당류의 종류를 살펴본 결과 황기 다당성분은 그 단당류의 구성이 갈락토스임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 고속 음이온교환크로마토그래피를 이용하여 검정한 결과와 같은 결과를 나타내었으며 황기를 구성하는 다당체 중에 많은 양의 갈락토스를 포함하는 갈락탄(galactan)계열임을 확인하였다.
실시예
4.
황기
지상부 다당성분(
PS1
-
PS6
)의 장관
파이엘판
림프구에 대한 증식촉진효과 검정
(1) 실험동물
생후 5주령의 건강상태가 양호한 C3H/He의 암컷 마우스를 (주)대한실험동물센터(충북, 음성군)로부터 구입하여 사용하였다. 사료는 실험동물용 사료를(삼양사료, 인천), 물은 정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였으며 환경은 항온, 항습 조건(온도 22±0.5℃, 상대습도 55±5%) 및 인공조명에서 명암교대 1일 12시간씩(오전 9시~오후 9시) 유지하였다.
(2) 실험방법
Hong 등 (1998, Phytomedicine 5: 353-360)의 방법에 의거하여 측정하였다. 즉, C3H/He 마우스의 소장벽 상에 존재하는 파이엘판을 조심스럽게 잘라내어 HBSS(Hank's balanced salt solution)이 담겨진 petri dish에 옮기고 조직을 파괴하여 파이엘판으로부터 세포를 방출시킨다. 세포현탁액을 금속체(No. 200)로 여과한 후 RPMI 1640-FBS(5% FBS 함유된 RPMI-1640)로 세척하고 2×106 세포/mL RPMI 1640-FBS로 세포농도를 조정한 후 96-well 플레이트에 180 μL씩 분주하고 활성을 측정하고자 하는 시료를 적당한 농도로 희석하여 20 μL씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 5일간 배양한 후 상등액을 회수하여 골수세포 증식 활성 측정용으로 사용하였다. 골수세포는 동일종 마우스의 대퇴부 뼈를 이용하여 회수하였는데, 즉 주사기를 이용하여 뼈 속으로 HBSS를 주입하여 골수세포를 시험관에 받은 후 상기와 같이 여과, 세척하여 2.5×105 세포/mL RPMI 1640-FBS로 세포농도를 조정하고 96-well 플레이트에 100 μL씩 분주한다. 다음으로 위에서 얻은 골수세포 증식활성 측정용 상등액과 RPMI 1640-FBS를 각각 50 μL씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 6일간 배양한다. 직접적인 장관면역 활성도는 시료와 파이엘판 세포와의 반응 후 회수한 상등액을 골수세포와 반응시켜 골수세포가 증식되는 정도로서 나타내는데, 증식도 측정은 Alamar BlueTM의 형광시약이 살아 있는 골수세포의 전자전달계에서 방출되는 전자에 의해 환원되어 발색되는 측정법을 사용하였다. 즉, 골수세포와 위에서 얻은 배양 상등액과의 배양종료 12시간 전에 Alamar BlueTM 20 μL를 첨가한 다음 형광도를 SpectroFluor Plus(Tecan, Durham, NC)를 이용하여 excitation 544 nm와 emission 590 nm에서 측정하여, 생리식염수를 시료 대신 사용한 대조구와 골수세포의 증식도를 비교하여 정량화하였다.
본 발명의 6종류 다당 성분에 있어서 골수세포증식효과를 통해 장관면역 활성을 검정하여 본 결과 다당성분 6개 모두 50㎍/mL의 농도 이상에서 골수세포 증식효과를 나타내었으며 특히 AMA-1-b 분획에서 Sephacryl S-200(1.7×82 cm)에서 겔 여과 크로마토그라피를 통하여 분리된 행하여 AMA-1-b-PS2 (100㎍/mL 처리 시, 대조군에 2.42배)와 AMA-1-d 분획으로부터 Sepharose CL-6B 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)와 Sephacryl S-300(2.6×90 cm)를 이용한 겔 여과 크로마토그라피(gel filtration chromatogrphay)를 행하여 2개의 획분인 AMA-1-d-PS5 (100㎍/mL 처리 시, 대조군에 1.98배)과 AMA-1-d-PS6 (100㎍/mL 처리 시, 대조군에 2.26배)에서 높은 활성을 나타내었다 (도 4).
AMA-1-b-PS2 다당성분은 총당 92.1%와 산성당 3.9%, 단백질 4.7%로 구성되어있으며 중성당으로는 아라비노스, 만노스, 갈락토스, 포도당의 몰비가 0.5:1.1:1.1:1.0로 포함되었고, 글루쿠론산과 갈락투론산으로 구성된 산성당이 2.9%로 구성되어 중성당이 주 구성물질인 반면 AMA-1-d-PS5와 AMA-1-d-PS6는 총당이 각각 72.6%, 54.1%, 단백질이 2.4, 2.6%, 우론산 함량이 25.3, 43.2로 구성되어 있고 산성당이 28.4, 61.7%로 구성되어 주로 산성당이 활성에 관여하는 물질로서 함유된 다당성분인 것으로 추정되었다.
상기 6개의 다당성분에 대하여 장관면역 활성을 파이엘판을 매개로 하는 기작을 이용하는지를 동시에 확인할 수 있는 활성방법을 통하여 비교하였다. 그 결과, AMA-1-b-PS2에서 파이엘판을 매개로 한 기작을 통하여 가장 높은 활성(시료농도 10μg/mL, 대조군의 11배, 시료농도 50 μg/mL 이상의 경우, 대조군의 60 배)을 나타내었으며, 골수세포 증식에서 효과가 그다지 크지 않았던 AMA-1-c-PS4 의 경우에서도 (시료농도 10μg/mL, 대조군의 11배, 시료농도 50μg/mL 이상의 경우, 대조군의 45 배)을 나타내어 AMA-1-b-PS2와 AMA-1-c-PS4의 경우 장관면역의 활성기작이 직접적으로 활성획분이 골수세포의 증식에 영향을 미치는 것이 아니고 파이엘판의 세포를 활성성분이 자극한 후 이러한 활성화된 세포에서 생산된 사이토카인(cytokine) 및 림포카인(lymphokine)류가 골수세포 증식에 영향을 끼치는 것으로 추정할 수 있었다. 반면 산성당 함량이 높게 나타난 AMA-1-d-PS5과 AMA-1-d-PS6의 경우에서는 파이엘판을 매개로 하는 기작을 이용하지 않고 직접적인 골수세포증식효과를 나타내는 것으로 생각된다.
AMA-1-b-PS2와 AMA-1-c-PS4의 경우 단백질 함량은 매우 낮았고, 중성당을 주 구성당으로서 하고 있으며 아라비노스와, 갈락토스 간의 교호적인 결합으로 이루어진 주쇄에 다양한 종류의 중성당이 측쇄로 결합되어 있는 형태의 펙틴 계통의 다당류일 것으로 추정되나, 보다 확실한 활성 획분의 구조를 밝히기 위해서는 화학적인 활성물질의 수식을 통한 활성본체의 구조분석이 이루어져야만 하기 때문에 구조분석을 통하여 활성본체를 구체적으로 밝히기 위한 연구를 진행하고 있다.
실시예
5. 분리된
황기
지상부의 다당 성분의 골수세포증식 촉진인자의 생산 증가효과 검정
상기 실시예 4에 의해 얻어진 파이엘판 면역담당세포를 배양하고 상등액으로부터 상등액에서의 골수세포 증식촉진 인자량 및 인터루킨 (IL-6)이 생산되는 양을 검정하였다.
IL-6의 함량 측정은 sandwich ELISA법을 이용하였다. 분석 하루전 ELISA용 플레이트 (Immunoplate, Maxisorp, NUNC)에 50mM의 carbonate-bicarbonate buffer(pH9.6)에서 1μg/mL로 희석한 마우스 IL-6 항체(100μL/well, Pharmingen)를 분주하여, 4℃에서 하루 동안 반응시켜 well 표면에 흡착시켰다. 다음날 플레이트를 0.05% Tween 20 함유 PBST (PBS-Tween 20)으로 3회 세척 후, assay diluent (PBS-10% FBS)를 200μL 씩 분주하고 실온에서 1시간 방치하여 항체가 붙지 않은 well의 표면을 blocking 하였다. 이후 플레이트를 PBST로 각 well을 3회 세척하고 표준물질인 IL-6를 연속 희석한 용액 또는 5일간 배양한 파이엘판 반응 상등액인 시료와 assay diluent를 50μL씩 분주하여 실온에서 90분 동안 배양하였다. 반응 상등액을 제거하고 assay diluent를 50μL 씩 분주하여 Well 표면을 30분 동안 blocking 시킨 후에 PBS로 5회 세척하였다. 이렇게 처리된 플레이트에 bitinylate anti-IL-6와 avidin-horseradish peroxidaase의 conjugation을 assay diluent에 희석하여 분주하고 1시간 동안 반응시켰다. 이 각 well에 존재하는 상등액을 제거하고 PBST로 7회 세척한 후 TMB substrate를 첨가하여 30분 배양하였으며 50 μL의 2N H2SO4를 첨가하여 반응을 중지하고 405nm에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
본 발명에서 6종의 황기 지상부 기원의 다당 성분에 대한 장관 파이엘판 면역담당세포에서 IL-6등의 골수세포 증식촉진인자의 생성 촉진 여부를 검정한 결과 AMA-1-b-PS2와 AMA-1-c-PS4에서 높은 수준으로 interlekin-6의 세포증식 촉진인자를 높은 수준으로 생성하였다. AMA-1-b-PS2의 경우에서는 IL6의 생성을 대조군에 비하여 시료농도 100μg/mL 처리 시 3.5배, AMA-1-c-PS4의 경우 시료농도 100μg/mL 처리 시 4.2배를 나타내었으며 골수세포 증식 시 직접적인 효과를 나타내었던 AMA-1-d-PS5과 AMA-1-d-PS6는 IL-6의 생성에 크게 영향을 미치지 못하였다. 파이엘판을 매개로 하는 림프구 활성 측정에서 AMA-1-b-PS2가 AMA-1-c-PS4 보다 높은 활성을 나타낸 반면 세포증식촉진인자 중 IL-6의 생성에 있어서는 AMA-1-c-PS4가 AMA-1-b-PS2 보다 더 높은 효과를 나타내었다 (도 6). 이러한 것은 AMA-1-b-PS2의 경우 다른 IL-6 이외에 다른 세포증식 촉진인자를 활성화시키는 것으로 생각되며 이후 다른 사이토카인 및 림포카인류에 대한 생성 촉진 효과를 검정하여야 할 것으로 생각된다.
본 발명의 다당 획분 및 다당성분들은 황기 식물의 지상부에서 상기 기술된 방법으로 단독 혹은 조합하여 추출, 분리, 정제해 조제할 수 있다. 예를 들어 황기의 지상부를 그대로 혹은 분쇄해서, 10배 정도의 수성용매로 실온 또는 열수를 가하여 추출하고, 추출 후 여과해서 얻은 여액을 원심 분리해, 상등액을 동결 건조해 건조물을 얻는다. 이 건조물을 아세톤, 메탄올, 에탄올 등의 유기용매에 용해해, 경우에 따라서 환류한 후, 원심분리해서 지질성분을 제거한 침전물을 정제수에 용해한 후, 거기에 에탄올 침전과 투석을 실시하고, 비투석물을 동결 건조해 다당 획분을 얻는다. 이 다당 획분을 정제수에 용해하여, 이온교환크로마토그래피와 겔여과 크로마토그래피를 이용하여 다당성분을 얻을 수 있다.
일반적으로 식물체 기원의 다당 성분은 생리활성에 관여하는 특정 당쇄구조가 존재하는 것으로 보고되고 있고 효소 또는 화학적인 활성물질의 수식을 통한 활성본체의 구조분석이 이루어져 당쇄구조를 결정하고 활성이 발현되는 당쇄구조와 또 다른 당쇄구조를 포함하여 다당 전체구조가 형성되고, 이 전체구조에서 개개의 활성 다당성분을 정의할 수 있다.
본 발명의 다당 성분에서도 특정 당쇄 구조가 그 생체방어기능 부활화 활성에 관여하고 있는 것이 명확히 구명되었다.
본 발명의 생체방어기능부활제 및 면역 증강제는 황기 지상부의 다당 성분 혼합체 전체와 각 개별로 분리된 6개의 다당성분, 다당성분을 함유한 수용성 엑기스와 동결 건조물을 그 자체 또는 이를 활용한 제제용의 부형제, 결합제, 희석제와 혼합해서 이룬 것을 포함하고, 분말, 과립, 정제, 캡슐제 등의 형태로 가공된 것을 포함한다.
생체방어기능부활제 및 면역증강제는 경구적으로 투여할 수 있으며, 필요에 의해 다른 약제를 조합 또는 혼합할 수 있다. 또, 본 발명의 생체 방어 기능 부활제는, 지속적으로 생체에 작용되는 것에 의해 스트레스와 피로 등까지 일상적으로 일어나는 가벼운 생체방어기구의 저하상태를 회복시키는 것에도 적절한 것으로 일상적으로 섭취할 수 있는 식품을 포함한다. 투여량 또는 섭취량은 연령, 체중, 병의 상태에 의해 서로 다르지만, 보통 성인, 1일, 다당 성분으로 0.1~30000mg이 권장된다. 본 발명의 영역은 황기 지상부 기원의 다당성분과 제제상의 보조성분으로 구성된 모든 제제를 포함하며 상기 기술한 용량으로 1회 및 수회로 나누어 복용 또는 섭취하는 투여 형태를 포함한다.
본 발명에서의 다당성분의 안전성은 다당 성분의 독성은 BALB/c마우스 (암컷, 7주령)에 1g/kg의 투여량을 7일간, 1일 1회 연속 투여한 경우에도 이상함이 전혀 확인되지 않는 점 (자료 미제시)과 본 발명에서 발견한 다당성분의 일반적인 구조가 유사한, 다당 성분이 펙틴의 부분 분해산물로 요쿠르트 등에 첨가된 경우 무독하거나 극히 저독성을 나타내는 것으로 증명된다(Maeda et al. 1998, United States Patent US571020270).
장관, 호흡기, 비뇨생식기와 외분비선등의 각종 국소점막은 외부에서의 세균 과 바이러스 및 정상세포 균총에서 나온 세균 군에 대하여 작용한다. 이런 국소점막면역계는 전신면역계와는 기능적으로 구별되고 분비형 IgA의 생성 및 분비에 의해 방어 장벽을 형성하고, 이런 외래성 및 내인성 미생물군의 생체 내에서 이행(transiocation)되는 것을 막아 감염에 대한 방어기작으로 작용하고 있다. 이 점막면역계는 광범위한 항생물질의 투여, 스테로이드 등의 면역억제제, 항암제의 투여, 방사선치료법, 수술 등에 의해 저하하는 것으로 알려져 있고 그 결과로 호흡기에서의 외래성 병원미생물의 감염, 소화관에서의 헬리코박터 파일로리와 병원성 대장균 등의 감염과 장관 내 정상 장내세균의 transiocation에 의한 내인성 감염증의 발현으로 연결된다.
국소점막면역기구에서 장관에 존재하는 장관면역계속의 파이엘판은 유도조직으로서 중요한 역할을 하고 있고, 파이엘판은 다른 국소점막과 장관점막에 림프구를 생성 공급하고 있다. 공급된 림프구는 국소점막에서 IgA 생성을 억제하여 상대적으로 파이엘판에서의 B림프구의 IgA 생산 기능을 증가시켜 다른 국소점막에서의 IgA 증가에 의한 감염 방어능이 증가된다고 생각된다. 이러한 것은 in vitro 상에서 비피더스균 증가열사균체가 파이엘판 면역담당세포에서 IgA 생산을 증가시켜 기도에서의 인플루엔자의 감염을 방어할 수 있다는 보고에 의해 증명되고 있다 (Zuercher et al. 2002, Journal of Immunology 169: 3920-3925).
특히 장관면역계의 기능저하에 의해 식품과 자기 항원단백이 자기 면역계에 인지되어 발생하는 자가면역질환, 염증성 장질환과 아토피성 피부염, 식물알레르기 등의 알레르기성 질환과 노화 등의 병을 일으키는 것이 보고되었고 (Tlaskalova-Hogenova et al. 2002, International Archives of Allergy and Immunology 128: 77-89), 파이엘판속 면역담당세포의 기능을 강화하는 것은 위에서의 질환억제와 예방으로 이어진다고 생각된다. 이 개념은 유산균과 비피더스균 등의 경구 투여에 의해 아토피성 피부염과 염증성장질환 등의 알레르기성 질환의 발현이 억제되는 보고 예에서 증명되었다 (Yasui and Ohwaki 1991, Journal of Dairy Science 74: 1187-1195). 따라서 본 발명에서 황기 지상부 다당성분은 생체방어기능 부활화작용에 있어서 장관 파이엘판속의 면역담당세포를 활성화하고, 림프구 세포증식에 필요한 IgA 생산의 증가, 항체 생산에 관여하는 사이토카인인 인터루킨(interleukin) 6 등의 인자 생산을 증대할 수 있을 것으로 생각된다. 황기 지상부의 다당성분은 국소점막에서 분비형 IgA 생산과 사이토카인 등 각종 인자의 생산을 증가 또는 조절하고, 저하한 국소점막의 바이러스에 대한 방어기능을 강화하고, 각종 감염증, 아토피성 피부염, 염증성장관질환과 식물 알레르기 등의 알레르기성질환, 자기면역질환, 암, 노화 등의 방어와 억제하는 작용을 나타낸다고 할 수 있다.
도 1은 황기 지상부의 다당체인 아라비노글루칸(arabinogalactan)이 파이엘판을 매개로 하여 M세포를 경유 대식세포(Macrophage)를 활성화하고 림프구( lymphocyte)세포 증식을 촉진하고 활성화된 림프구 세포에서 사이토카인(cytokine)과 림포카인(lymphokine) 생성이 촉진되고 장관면역을 활성화시키는 메커니즘을 보여준다.
도 2는 다당 성분 AMA-1-b-PS2의 exo-β-D-(1→3)-galactanase 및 endo-β-D-(1→6)-galactanase 가수분해물의 고속 음이온 교환 크로마토그래피에서의 용출도이다. (A 및 B: 표준 β-D-(1→6)-Gal의 올리고당과 단당인 Ara 및 Gal의 용출위치를 나타낸 것; C 및 D: 각각 AMA-1-b-PS2의 exo-β-D-(1→3)-galactanase 및 본 소화물의 endo-β-D-(1→6)-galactanase 가수분해물. *: endo-β-D-(1→6)-galactanase에 의해 소실 혹은 감소한 피크(peak).
도 3은 다당 성분 AMA-1-b-PS2의 exo-β-D-(1→3)-galactanase 및 endo-β-D-(1→6)-galactanase 가수분해물의 박층크로마토그래피의 결과를 보여준다. 가수분해산물은 다양한 단당류, A)람노오스, B)푸코오스, C)자일로오스 D)아라비노오스, E)만노오스, F)글루코오스, G)갈락토오스와 비교하여 본 결과 AMA-1-b-PS2의 가수분해 산물은 주로 갈락토스로 구성되어 있음을 확인할 수 있다
도 4는 다당 성분인 파이엘판 면역담당세포의 활성화를 통해 골수세포증식에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 다당 성분인 파이엘판 림프구에 대한 세포증식촉진효과를 나타낸 것 이다.
도 6은 다당 성분인 파이엘판 면역담당세포의 활성화를 통해 골수세포증식에 미치는 효과에 있어 촉진인자 IL-6의 생산에 증강효과를 나타낸 것이다.
Claims (4)
- 황기(Astragalus membraanaceus Bunge) 지상부로부터 추출되고, 아라비노오스(arabinose), 람노오스(rhamnose), 푸코오스(fucose), 자일로오스(xylose), 만노오스(mannose), 갈락토오스(galactose), 글루코오스(glucose), 글루쿠론산(glucuronic acid) 및 갈락투론산(galacturonic acid)으로 구성된 다당체를 포함하는 면역증강 활성을 갖는 황기 지상부 추출물.
- 제1항에 있어서, 상기 다당체는 중량평균분자량(Mw)이 72,000 내지 375,000 달톤(dalton)인 것을 특징으로 하는 황기 지상부 추출물.
- 제1항에 따른 황기 지상부 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강 활성을 갖는 약학 조성물.
- 삭제
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