KR101787082B1 - 유효 사포닌 함량이 증가된 도라지 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
유효 사포닌 함량이 증가된 도라지 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유효 사포닌 함량이 증가된 도라지(Platycodon grandiflorum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 도라지 추출물은 유의적인 류마티스 관절염 치료효과를 나타내고, 특히, 위에서의 손상 및 부작용을 최소화하며 적은 용량으로도 약효를 극대화할 수 있도록, 약물이 위에서 녹지 않고 장에서 녹아 흡수될 수 있도록 특수하게 코팅하는 장용 코팅하여 투여한 결과, 현저한 류마티스 관절염 치료효과를 나타내므로, 상기 도라지 추출물을 류마티스 관절염에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 유효 사포닌인 플라티코딘(Platycodin) 함량이 증가된 도라지(Platycodon grandiflorum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 치료용 약학적 조성물, 및 건강기능식품에 관한 것이다.
류마티스 관절염은 다발성 관절염을 특징으로 하는 원인 불명의 만성 염증성 질환이다. 초기에는 관절을 싸고 있는 활막에 염증이 발생하지만 점차 주위의 연골과 뼈로 염증이 퍼져 관절의 파괴와 변형을 초래하게 된다. 관절뿐만 아니라 관절 외 증상으로 빈혈, 건조증후군, 피하 결절, 폐섬유화증, 혈관염, 피부 궤양 등 전신을 침범할 수 있는 질환이다.
류마티스 관절염의 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았지만 자가면역현상이 주요 기전으로 알려져 있다. 자가면역이란 외부로부터 인체를 지키는 면역계의 이상으로 오히려 자신의 인체를 공격하는 현상이다. 일반적으로는 유전적 소인, 세균이나 바이러스 감염 등이 류마티스 관절염의 원인으로 생각되고 있다. 신체적 또는 정신적 스트레스를 받은 후 발병하기 쉽다고 알려져 있다. 즉, 관절 류마티즘은 관절의 종창, 염증, 경직, 동통을 수반하며, 전신의 다발성 관절염의 병상을 보이는 난치성 자기면역 질환이다. 즉, 생체 자신이 자기-비자기의 인식 결함에 기초하여 자기를 마치 비자기로 인식하여 자기 조직을 공격하고, 이상 면역 응답을 일으켜 결합 조직에 염증을 초래하는 전신성 질환이다.
퇴행성 관절염, 즉 골관절염은 관절을 구성하는 연골세포(chondrocytes)에 노화 등의 퇴행이 발생하여, 연골세포에서 관절의 기질 물질들인 유형II 콜라겐(type II collagen) 및 프로테오글리칸 등의 합성이 저해됨과 동시에, 인터루킨-1β(interleukin-1β) 및 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α) 등의 염증성 사이토카인이 생성됨에 따라, 관절기질을 분해하는 기질 금속단백질 분해효소(matrix metalloproteinase; MMP)의 합성 및 활성이 관절세포에서 증가됨으로 인해 관절조직이 파괴됨으로써 유발되는 질병이다.
또한, 관절염은 염증성 사이토카인에 의한 일산화질소의 생성과, 생성된 일산화질소에 의한 자가증폭적인 사이토카인의 생성으로 인해 더욱 많은 MMP의 합성이 유발되어 관절기질의 분해가 촉진됨으로써 더욱 악화된다. 이와 동시에, 염증성 사이토카인은 지질 대사산물인 프로스타글란딘 E2의 생성을 증가시켜 관절염에서의 염증반응을 유발시킨다.
만성 관절 류마티즘의 약물 요법으로서는 항염증 스테로이드제(예컨대 프레드니솔론)나 비스테로이드계 항염증제(예컨대 인도메타신, 아스피린), 면역 억제제 [예컨대 사이클로스포린 A, 타크롤리무스 (FK506), 메토트렉세이트, 시클로포스파미드, 아자티오프린], 질환 수식성 항류마티즘제 (예컨대 금 염 제제)가 사용되고 있다. 항염증제는 염증을 조절하고, 동통과 종창을 완화시킬 수 있지만, 진행자체를 저지하는 것은 어렵다. 이와 같이, 어떤 약물도 증상을 경감시키거나, 질병의 진전을 늦출 뿐이며, 또한 장기간 투여에 따른 부작용이 발현될 가능성도 있어 충분히 만족할 수 있는 약제라고 말할 수 없다.
한편, 관절염 치료에 사용되는 약물은 염증의 감소, 질병 진행의 지연, 요산 농도의 감소라는 주된 작용 기전을 근거로 분류될 수 있는데, 많은 신경관절염 치료 약물들이 염증을 감소시키는 작용을 한다. 염증은 통증, 부종, 열감, 발작, 경직을 일으키는 병적 과정이며, 염증을 신속히 완화시키는 약물에는 아스피린을 비롯한 비스테로이드성 항염제와 코티손을 비롯한 스테로이드성 항염제가 있다.
비스테로이드성 항염제는 통증을 감소시켜서 신경관절을 편안하게 하고 염증을 완화시키는 효과가 있으나, 위장장애가 나타나거나 복통을 유발하는 경우도 있기 때문에, 활동성 소화성 궤양이나 위장 부위의 출혈적 병력이 있는 사람에게는 사용이 금지된다. 스테로이드성 항염제는 그 효과에 비해 체중 증가나 고혈압 등의 부작용이 심각하여 퇴행성 신경관절염에는 잘 사용하지 않는다. 특히, 스테로이드성 항염제는 질환의 원인 치료와는 전혀 무관하고, 단순히 통증을 일시적으로 감소시켜 관절의 과잉 사용을 유도할 소지가 있으며, 이는 신경관절을 파 괴하고 장애를 악화시키는 요인이 되기 때문에 사용에 주의를 요한다.
따라서, 관절염의 치료에 사용되어 오는 치료법은 한정적인 치료효과만을 가지고, 부작용을 수반하기도 하여 장기간 사용할 수 없는 문제가 있다. 이에 기존의 치료방법에서 발견되는 문제점을 극복할 수 있는 새로운 치료법에 대한 요구가 있어왔다.
도라지 (Platycodi Radix)는 동아시아지역에 자생 혹은 재배되고 있는 초롱꽃과 (Campanulaceae) 도라지속(Platycodon)에 속하는 유일한 다년생 식물 도라지 (Platycodon grandiflorum A. DC.)의 뿌리를 일컫고 생약명으로는 길경(桔梗)이라고 한다. 도라지의 함유 성분으로는 탄수화물 (당)이 90 % 이상을 차지하고 단백질이 2.4 %, 지질 0.1 % 그리고 회분이 1.5 % 정도 존재한다고 보고되어 있다. 그 외에 트리테르페노이드 사포닌(triterpenoid saponin) [플라티코딘 (platycodin) A, C, D, D2, 폴리갈라신 (polygalacin) D, D2 등 32 종류가 보고되고 있음]이 약 2% 정도 존재하고 있으며 이들 사포닌 성분들은 도라지의 다양한 약리 효능의 유효성분으로 주목받고 있다. 그 밖에도 도라지에는 α-스피나스테롤(α-spinasterol), Δ7-스티그마스테롤 (Δ7-stigmasterol), α-스피나스테릴-β-D-글루코사이드 (α-spinasteryl-β-D-glucoside) 등 스테로이드 (steroid) 화합물이 약 0.03 % 정도 함유되어 있다. 탄수화물은 포도당, 과당, 설탕, 케스토스 등 이당류 혹은 삼당류가 대부분을 차지하고 이눌린 (inulin), 플라티코디닌(platycodinin) (과당 10분자 정도의 다당류) 등의 다당류가 보고되고 있다.
현편, 현재까지 알려진 도라지의 약리 효능으로는 뇌신경세포 보호효과 (문헌 [Yoo Ki-Yeon et al., Neurosci. lett. 444(1), 97-101 (2008)]참고), 항 비만효과 (문헌 [Zhao, H. L. et al., J. Food. Sci. 73(8), H195-H200, (2008)]참고), 간기능 보호 효과 (문헌 [Lee, K.J.et al., Toxicol. Lett. 147, 271-282, (2004)]참고), 면역기능 조절 활성 (문헌 [Ahn, K.S. et al., Life Sci. 76, 2315-2328, (2005)] 참고) 및 세포 독성 (문헌 [Lee, Kyung Jin et al., Food Chem. Toxicol. 46(5), 1778-1785 (2008); Zhang, Lin et al., Molecules 12(4), 832-841, (2007)]참고) 등이 보고되고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 상용 약제들의 여러 가지 문제점들을 해결하고 또한 최근에 심각하게 대두된 약물의 안전성문제를 해결하기 위하여 보다 안전성이 확보된 천연물로부터 유래된 류마티스 관절염 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 도라지 추출물이 유의적인 류마티스 관절염 치료효과를 나타내고, 특히, 위에서의 손상 및 부작용을 최소화하며 적은 용량으로도 약효를 극대화할 수 있도록, 약물이 위에서 녹지 않고 장에서 녹아 흡수될 수 있도록 특수하게 코팅하는 장용 코팅을 하여 투여한 결과, 현저한 류마티스 관절염 치료효과를 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적 도라지(Platycodon grandiflorum)추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염 치료용 약학적 조성물, 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 도라지(Platycodon grandiflorum)추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 도라지 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 도라지 추출물을 포함하는 장용코팅된 경구용 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 도라지(Platycodon grandiflorum)를 물, C1-C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 수득한 추출물을 농축한 후, 이온교환수지 및 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 통과시켜 당 화합물을 분리하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 당 화합물이 분리된 도라지 추출물을 모아 감압 증류 및 건조하여 분말 상의 도라지 추출물을 제조하는 단계를 포함하는, 유효 사포닌 함량이 증가된 도라지 추출물 제조 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 도라지 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 및 치료용 약학적 조성물, 예방 및 개선용 건강기능식품 및 장용코팅된 경구용 제제를 제공한다.
본 발명의 도라지(Platycodon grandiflorum) 추출물은 플라티코딘 함량을 1% 이상 함유하며, 유의적인 류마티스 관절염 치료효과를 나타내고, 특히, 위에서의 손상 및 부작용을 최소화하며 적은 용량으로도 약효를 극대화할 수 있도록, 약물이 위에서 녹지 않고 장에서 녹아 흡수될 수 있도록 특수하게 코팅하는 장용 코팅을 하여 투여한 결과, 현저한 류마티스 관절염 치료효과를 나타내므로, 상기 도라지 추출물을 류마티스 관절염에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 도라지 추출물의 다당체 및 조사포닌 함량 변화를 나타낸 도이다.
도 2는 플라티코딘(Platycodin) D의 약동학 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 도라지 추출물의 당 분리 전 후 사포닌 함량을 HPLC로 나타낸 도이다.
도 4는 파골세포 분화 억제능을 나타낸 도이다.
도 5는 실험 동물에 류마티스 관절염을 유발하는 과정의 모식도이다.
도 6은 본 발명의 도라지 추출물의 류마티스 관절염 유도 동물 모델의 체중 변화에 미치는 영향을 나타낸 도이다:
정상군(Normal group);
대조군(Control group);
본 발명의 도라지 추출물 100 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 100 mg/kg, PGE-100 group);
본 발명의 도라지 추출물 300 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 300 mg/kg, PGE-300 group);
본 발명의 도라지 추출물 1000 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 1000 mg/kg, PGE-1000 group); 및
양성대조군인 조사포닌 추출물 6 mg/kg을 투여한 실험군(Crude saponin extract 6 mg/kg, CS-6 group).
도 7은 본 발명의 도라지 추출물의 류마티스 관절염 유도 동물 모델의 식이 및 음수량 변화에 미치는 영향을 나타낸 도이다:
정상군(Normal group);
대조군(Control group);
본 발명의 도라지 추출물 100 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 100 mg/kg, PGE-100 group);
본 발명의 도라지 추출물 300 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 300 mg/kg, PGE-300 group);
본 발명의 도라지 추출물 1000 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 1000 mg/kg, PGE-1000 group); 및
양성대조군인 조사포닌 추출물 6 mg/kg을 투여한 실험군(Crude saponin extract 6 mg/kg, CS-6 group).
도 8은 본 발명의 도라지 추출물의 류마티스 관절염 유도 동물 모델의 발두께 변화에 따른 관절염 임상점수에 미치는 영향을 나타낸 도이다:
정상군(Normal group);
대조군(Control group);
본 발명의 도라지 추출물 100 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 100 mg/kg, PGE-100 group);
본 발명의 도라지 추출물 300 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 300 mg/kg, PGE-300 group);
본 발명의 도라지 추출물 1000 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 1000 mg/kg, PGE-1000 group); 및
양성대조군인 조사포닌 추출물 6 mg/kg을 투여한 실험군(Crude saponin extract 6 mg/kg, CS-6 group).
도 9 및 도 10은 본 발명의 도라지 추출물의 류마티스 관절염 유도 동물 모델의 앞발 두께 변화에 미치는 영향을 나타낸 도이다:
정상군(Normal group);
대조군(Control group);
본 발명의 도라지 추출물 100 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 100 mg/kg, PGE-100 group);
본 발명의 도라지 추출물 300 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 300 mg/kg, PGE-300 group);
본 발명의 도라지 추출물 1000 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 1000 mg/kg, PGE-1000 group); 및
양성대조군인 조사포닌 추출물 6 mg/kg을 투여한 실험군(Crude saponin extract 6 mg/kg, CS-6 group).
도 11 및 도 12는 본 발명의 도라지 추출물의 류마티스 관절염 유도 동물 모델의 뒷발 두께 변화에 미치는 영향을 나타낸 도이다:
정상군(Normal group);
대조군(Control group);
본 발명의 도라지 추출물 100 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 100 mg/kg, PGE-100 group);
본 발명의 도라지 추출물 300 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 300 mg/kg, PGE-300 group);
본 발명의 도라지 추출물 1000 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 1000 mg/kg, PGE-1000 group); 및
양성대조군인 조사포닌 추출물 6 mg/kg을 투여한 실험군(Crude saponin extract 6 mg/kg, CS-6 group).
도 13은 본 발명의 도라지 추출물의 류마티스 관절염 유도 동물 모델의 혈액 내 TNF-α 와 IL-1β 함량에 미치는 영향을 나타낸 도이다:
정상군(Normal group);
대조군(Control group);
본 발명의 도라지 추출물 100 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 100 mg/kg, PGE-100 group);
본 발명의 도라지 추출물 300 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 300 mg/kg, PGE-300 group);
본 발명의 도라지 추출물 1000 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 1000 mg/kg, PGE-1000 group); 및
양성대조군인 조사포닌 추출물 6 mg/kg을 투여한 실험군(Crude saponin extract 6 mg/kg, CS-6 group).
도 2는 플라티코딘(Platycodin) D의 약동학 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 도라지 추출물의 당 분리 전 후 사포닌 함량을 HPLC로 나타낸 도이다.
도 4는 파골세포 분화 억제능을 나타낸 도이다.
도 5는 실험 동물에 류마티스 관절염을 유발하는 과정의 모식도이다.
도 6은 본 발명의 도라지 추출물의 류마티스 관절염 유도 동물 모델의 체중 변화에 미치는 영향을 나타낸 도이다:
정상군(Normal group);
대조군(Control group);
본 발명의 도라지 추출물 100 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 100 mg/kg, PGE-100 group);
본 발명의 도라지 추출물 300 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 300 mg/kg, PGE-300 group);
본 발명의 도라지 추출물 1000 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 1000 mg/kg, PGE-1000 group); 및
양성대조군인 조사포닌 추출물 6 mg/kg을 투여한 실험군(Crude saponin extract 6 mg/kg, CS-6 group).
도 7은 본 발명의 도라지 추출물의 류마티스 관절염 유도 동물 모델의 식이 및 음수량 변화에 미치는 영향을 나타낸 도이다:
정상군(Normal group);
대조군(Control group);
본 발명의 도라지 추출물 100 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 100 mg/kg, PGE-100 group);
본 발명의 도라지 추출물 300 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 300 mg/kg, PGE-300 group);
본 발명의 도라지 추출물 1000 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 1000 mg/kg, PGE-1000 group); 및
양성대조군인 조사포닌 추출물 6 mg/kg을 투여한 실험군(Crude saponin extract 6 mg/kg, CS-6 group).
도 8은 본 발명의 도라지 추출물의 류마티스 관절염 유도 동물 모델의 발두께 변화에 따른 관절염 임상점수에 미치는 영향을 나타낸 도이다:
정상군(Normal group);
대조군(Control group);
본 발명의 도라지 추출물 100 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 100 mg/kg, PGE-100 group);
본 발명의 도라지 추출물 300 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 300 mg/kg, PGE-300 group);
본 발명의 도라지 추출물 1000 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 1000 mg/kg, PGE-1000 group); 및
양성대조군인 조사포닌 추출물 6 mg/kg을 투여한 실험군(Crude saponin extract 6 mg/kg, CS-6 group).
도 9 및 도 10은 본 발명의 도라지 추출물의 류마티스 관절염 유도 동물 모델의 앞발 두께 변화에 미치는 영향을 나타낸 도이다:
정상군(Normal group);
대조군(Control group);
본 발명의 도라지 추출물 100 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 100 mg/kg, PGE-100 group);
본 발명의 도라지 추출물 300 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 300 mg/kg, PGE-300 group);
본 발명의 도라지 추출물 1000 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 1000 mg/kg, PGE-1000 group); 및
양성대조군인 조사포닌 추출물 6 mg/kg을 투여한 실험군(Crude saponin extract 6 mg/kg, CS-6 group).
도 11 및 도 12는 본 발명의 도라지 추출물의 류마티스 관절염 유도 동물 모델의 뒷발 두께 변화에 미치는 영향을 나타낸 도이다:
정상군(Normal group);
대조군(Control group);
본 발명의 도라지 추출물 100 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 100 mg/kg, PGE-100 group);
본 발명의 도라지 추출물 300 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 300 mg/kg, PGE-300 group);
본 발명의 도라지 추출물 1000 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 1000 mg/kg, PGE-1000 group); 및
양성대조군인 조사포닌 추출물 6 mg/kg을 투여한 실험군(Crude saponin extract 6 mg/kg, CS-6 group).
도 13은 본 발명의 도라지 추출물의 류마티스 관절염 유도 동물 모델의 혈액 내 TNF-α 와 IL-1β 함량에 미치는 영향을 나타낸 도이다:
정상군(Normal group);
대조군(Control group);
본 발명의 도라지 추출물 100 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 100 mg/kg, PGE-100 group);
본 발명의 도라지 추출물 300 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 300 mg/kg, PGE-300 group);
본 발명의 도라지 추출물 1000 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 1000 mg/kg, PGE-1000 group); 및
양성대조군인 조사포닌 추출물 6 mg/kg을 투여한 실험군(Crude saponin extract 6 mg/kg, CS-6 group).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 도라지(Platycodon grandiflorum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 도라지 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
1) 도라지에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축하여 도라지의 추출물을 제조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 도라지는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 알코올로는 C1 내지 C2 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 열수 추출, 침지 추출, 초임계 추출, 아임계 추출, 고온 추출, 고압 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 추출장치를 이용한 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착 수지를 이용하는 방법 등 당 업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 가온하며 환류 추출 또는 상온에서 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 추출용매를 건조된 도라지 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 4 내지 6배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 100℃ 인 것이 바람직하고, 실온 또는 60℃ 내지 90℃인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 3 내지 36시간인 것이 바람직하며, 5 내지 20시간인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 횟수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 2 내지 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 수득한 추출액의 농축은 감압농축의 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조, 상온건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 도라지 추출물은 도라지 착즙 추출물일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 도라지 착즙 추출물은
1) 도라지를 1차 착즙하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 착즙하고 남은 잔유물에 물을 첨가한 후, 2차 착즙하는 단계;
3) 상기 단계 1)의 1차 착즙한 착즙물 및 상기 단계 2)의 2차 착즙물을 혼합한 후, 원심 분리하여, 고형분을 제거하는 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 도라지 착즙 추출물은 조사포닌 함량 및 플라티코딘 함량이 증가된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 플라티코딘은 플라티코딘 D인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 일반적으로 플라티코딘은 플라티코딘 D의 함량이 가장 많으며 유사한 구조의 플라티코딘 D2 및 D3 등이 포함된다.
상기 도라지 착즙 추출물은 한외여과막을 통과한 여과물을 모아 건조시켜 분자량 1,000 이상의 도라지 착즙 추출물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 도라지(Platycodon grandiflorum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 도라지 추출물은
1) 도라지(Platycodon grandiflorum)를 물, C1-C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 수득한 추출물을 농축한 후, 이온교환수지 및 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 통과시켜 당 화합물을 분리하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 당 화합물이 분리된 도라지 추출물을 모아 감압 증류 및 건조하여 분말 상의 도라지 추출물을 제조하는 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 알코올로는 C1 내지 C2 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 열수 추출, 침지 추출, 초임계 추출, 아임계 추출, 고온 추출, 고압 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 추출장치를 이용한 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착 수지를 이용하는 방법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 가온하며 환류 추출 또는 상온에서 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 추출용매를 건조된 도라지 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 4 내지 6배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 100℃ 인 것이 바람직하고, 실온 또는 60℃ 내지 90℃인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 3 내지 36시간인 것이 바람직하며, 5 내지 20시간인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 횟수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 2 내지 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계 3)에서, 이온교환수지는 Diaion, Lewatit, Dowex 또는 Amberite일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한 크기 배제 크로마토그라피는 세파덱스 계열의 충진제를 사용하며 이들 중 세파덱스 LH 계열의 충진제가 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용한 이온교환수지는 Diaion UBK이며, NaCl 수용액을 이용하여 Na-form으로 치환시킨 후 다시 증류수로 NaCl을 제거한 후 사용하였다.
상기 분리되는 당 화합물은 포도당(glucose), 과당(fructose), 솔비톨(solbitol), 자당(sucrose) 또는 단당류이다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 이온교환수지 및 크기 배제 크로마토그래피를 통과한 여과물을 모아 건조시켜 1,000 이상의 도라지 추출물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
수득한 추출액의 농축은 감압농축의 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조, 상온건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 도라지 추출물은 플라티코딘(Platycodin) 함량이 1% 이상인 것이 바람직하다.
상기 방법에 의해 제조된 도라지 추출물은 유효 사포닌 함량이 증가한 것이 바람직하며, 상기 유효 사포닌은 플라티코딘이며, 구체적으로는 플라티코딘(Platycodin) D 이다.
일반적으로 플라티코딘은 플라티코딘 D의 함량이 가장 많으며 유사한 구조의 플라티코딘 D2 및 D3 등이 포함된다.
또한, 본 발명은 도라지(Platycodon grandiflorum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 도라지 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
1) 도라지를 1차 착즙하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 착즙하고 남은 잔유물에 물을 첨가한 후, 2차 착즙하는 단계;
3) 상기 단계 1)의 1차 착즙한 착즙물 및 상기 단계 2)의 2차 착즙물을 혼합한 후, 원심 분리하여, 고형분을 제거하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 고형분이 제거된 착즙물을 상기 단계 1)에서 수득한 추출물을 농축한 후, 이온교환수지 및 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 통과시켜 당 화합물을 분리하는 단계;
5) 상기 단계 4)의 당 화합물을 분리한 착즙물을 분무건조시키는 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 당 화합물은 포도당(glucose), 과당(fructose), 솔비톨(solbitol), 자당(sucrose) 또는 단당류인 것이 바람직하다.
상기 도라지 착즙 추출물은 조사포닌 함량 및 플라티코딘 함량이 증가된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 상기 도라지 추출물은 플라티코딘(Platycodin) 함량이 1% 이상인 것이 바람직하다.
상기 플라티코딘은 플라티코딘 D인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 일반적으로 플라티코딘은 플라티코딘 D의 함량이 가장 많으며 유사한 구조의 플라티코딘 D2 및 D3 등이 포함된다.
상기 도라지 착즙 추출물은 한외여과막을 통과한 여과물을 모아 감압 농축하여 분자량 1,000 이상의 도라지 착즙 추출물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 도라지(Platycodon grandiflorum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 도라지 추출물은 플라티코딘(Platycodin) 함량이 1% 이상인 것이 바람직하다.
상기 플라티코딘은 플라티코딘 D인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 일반적으로 플라티코딘은 플라티코딘 D의 함량이 가장 많으며 유사한 구조의 플라티코딘 D2 및 D3 등이 포함된다.
또한, 본 발명은
1) 도라지(Platycodon grandiflorum)를 물, C1-C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 수득한 추출물을 농축한 후, 이온교환수지 및 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 통과시켜 당 화합물을 분리하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 당 화합물이 분리된 도라지 추출물을 모아 감압 증류 및 건조하여 분말 상의 도라지 추출물을 제조하는 단계를 포함하는, 유효 사포닌 함량이 증가된 도라지 추출물 제조 방법을 제공한다.
상기 당 화합물은 포도당(glucose), 과당(fructose), 솔비톨(solbitol), 자당(sucrose) 또는 단당류인 것이 바람직하다.
상기 유효 사포닌은 플라티코딘(Platycodin)인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 플라티코딘 D이다.
일반적으로 플라티코딘은 플라티코딘 D의 함량이 가장 많으며 유사한 구조의 플라티코딘 D2 및 D3 등이 포함된다.
상기 도라지 추출물은 플라티코딘 함량이 1% 이상인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은
1) 도라지를 1차 착즙하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 착즙하고 남은 잔유물에 물을 첨가한 후, 2차 착즙하는 단계;
3) 상기 단계 1)의 1차 착즙한 착즙물 및 상기 단계 2)의 2차 착즙물을 혼합한 후, 원심 분리하여, 고형분을 제거하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 고형분이 제거된 착즙물을 상기 단계 1)에서 수득한 추출물을 농축한 후, 이온교환수지 및 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 통과시켜 당 화합물을 분리하는 단계;
5) 상기 단계 4)의 당 화합물을 분리한 착즙물을 분무건조시키는 단계를 포함하는, 유효 사포닌 함량이 증가된 도라지 추출물 제조 방법을 제공한다.
상기 당 화합물은 포도당(glucose), 과당(fructose), 솔비톨(solbitol), 자당(sucrose) 또는 단당류인 것이 바람직하다.
상기 유효 사포닌은 플라티코딘(Platycodin)인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 플라티코딘 D이다.
일반적으로 플라티코딘은 플라티코딘 D의 함량이 가장 많으며 유사한 구조의 플라티코딘 D2 및 D3 등이 포함된다.
상기 도라지 추출물은 플라티코딘 함량이 1% 이상인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 도라지 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 도라지 추출물은 플라티코딘 함량이 1% 이상인 것이 바람직하다.
상기 플라티코딘은 플라티코딘 D인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 일반적으로 플라티코딘은 플라티코딘 D의 함량이 가장 많으며 유사한 구조의 플라티코딘 D2 및 D3 등이 포함된다.
일반적으로 도라지 추출물들은 열수 추출물, 알콜 추출물 및 착즙을 통한 추출방법으로 추출한 추출물들의 지표성분 사포닌인 플라티코딘(Platycodin)의 함량은 대략 0.1-0.2% 정도이다. 그 외의 나머지 성분들은 대략 조사포닌 0.3-2%, 단당류 및 이당류인 포도당(glucose), 과당(fructose), 솔비톨(solbitol), 자당(sucrose) 등이 40-50%, 프락토올리고당들이 30-40% 그리고 다당체인 이눌린이 20-30% 등이 포함되어 있다. 따라서, 도라지 추출물의 플라티코딘 함량을 0.5-1%로 높이기 위해서는 일반적인 추출방법으로는 어렵다.
본 발명의 도라지 추출물은 당 화합물들을 제거함으로서 플라티코딘을 비롯한 사포닌의 함량을 높였다. 도라지 추출물에 포함되어 있는 포도당, 과당, 솔비톨, 자당 등의 단순 당을 비롯한 올리고당 이하의 당 성분들은, 추출물을 대량 생산하기 위한 분무건조(spray dry) 공정에서 물리적인 불안정성(unstability)의 원인이 되므로 제거하는 것이 좋다. 또 다른 플라티코딘 함량을 높이는 방법으로는 이미 보고되어 있는 나노 막 분리를 통해서 얻는 방법이 있다. 그러나 이 방법은 단당류 및 이당류인 포도당, 과당, 솔비톨, 자당 등이 40-50% 함유되어 있어 플라티코딘 함량을 본 추출물의 2배 정도인 약 0.3% 까지 높이는 것은 가능하나 본 발명과 같이 플라티코딘 함량 약 1% 까지 얻기는 어렵다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 다양한 추출용매를 이용하여 도라지 추출물을 제조하였고, 또한 착즙 방법을 이용하여 도라지 착즙 추출물을 제조한 후, 각각의 추출물 별, 조 사포닌 함량을 확인하였다. 또한, 한외여과막을 통과한 여과물을 모아 건조하여 분자량 1,000 이상의 도라지 조성물을 제조한 후, 도라지 착즙 추출물의 조사포닌 함량 변화를 확인한 결과, 도라지 착즙 추출물에 비하여, 한외 여과후의 다당체 및 조사포닌의 함량이 2배 이상 증가하였음을 확인하였다(도 1).
또한, 본 발명자들은 Diaion UBK 500 ml을 유리관(2.5 x 100 cm)에 넣은 다음 증류수 500 ml로 씻어내고 이어서 5% NaCl 수용액 200 ml을 가하여 Na-form으로 치환시킨 후 증류수 500 ml로 NaCl을 제거하여 관 크로마토그라피를 준비하였다. 여기에 농축된 상기 플라티코딘 D 함량 0.098%의 도라지 열수 추출물 2 g을 20 ml의 물에 용해시켜 서서히 관 크로마토그라피에 가하고, 증류수 500 ml 이상을 가하여 용출되는 물질들을 TLC로 확인하면서 당 화합물들을 분리하여 제거하였다. 단당류 및 이당류인 포도당(glucose), 과당(fructose), 솔비톨(solbitol), 자당(sucrose) 등과, 프락토올리고당들이 제거된 것을 확인한 후, 나머지 용출액을 모아 감압 증류하여 210 mg의 화합물을 얻었다. HPLC 분석 결과, 당을 분리한 후의 도라지 추출물의 플라티코딘 D의 함량이 약 10배 정도 높아진 것으로 확인되었다(표 2 및 도 3 참조).
또한, 본 발명의 도라지 추출물을 류마티스 관절염 치료효과를 확인하기 위하여, in vitro, in vivo 실험을 수행한 결과, 본 발명의 도라지 추출물은 현저한 류마티스 관절염 치료효과를 나타냄을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 본 발명의 도라지 추출물 처리 4일 후 파골 세포를 관찰한 결과 처리하지 않은 대조군에 비하여 최대 10 ㎍/ml의 도라지 추출물을 처리한 군에서 파골세포의 크기와 분화량이 감소한 결과를 확인하였다(도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 도라지 추출물이 류마티스 관절염 동물모델에 미치는 영향을 알아보기 위해 먼저 순화기간부터 관절염 유도 기간 동안 각 실험군 별 체중 변화량을 측정하였고, 도라지 추출물의 투여농도가 증가함에 따라 체중량도 높은 경향을 보이거나 유의하게 증가된 것으로 나타났다(도 6 참조). 또한, 류마티스 관절염 유발여부를 확인하기 위하여 부종 및 홍반, 경직 정도를 임상점수로 산출하였으며, 그 결과, 도라지 추출물 투여군과 조사포닌 추출물 투여군의 경우 1차 boosting을 투여한 후에는 정상군과 유사한 수준을 보였고, 2차 boosting을 투여한 후에야 임상적인 변화가 나타나기 시작하였고, 도라지 추출물의 투여 농도가 높아질수록 임상점수는 낮은 것으로 확인되었다(도 8 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 도라지 추출물이 류마티스 관절염 동물모델에 미치는 영향을 알아보기 위해 발 두께변화를 측정하여 비교하였고 그 결과, 본 발명의 도라지 추출물 투여군과 조사포닌의 투여군 두께가 현저히 두께가 감소하여 효과가 있음을 확인하였다(도 9 내지 도 12 참조). 류마티스 관절염을 유도한 동물모델에서 각 실험군별 혈액 내 염증 지표 인자인 TNF-α(tumor necrosis factor-α)와 IL-1β (Interleukin 1β)의 함량을 비교 분석하였다. 그 결과, 도라지 추출물의 투여농도가 증가할수록 대조군에 비해 혈중 함량이 감소하는 경향을 보이거나 유의하게 감소하였다(도 13 참조).
따라서, 본 발명의 도라지 추출물은 파골세포를 현저히 분화유도하고 류마티스 관절염 동물모델의 부종을 현저히 감소시키는 현저한 치료효과를 나타내므로, 류마티스 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물에 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 도라지 추출물을 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말 셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 도라지 추출물을 유효성분으로 함유하는 장용코팅된 경구용 제제를 제공한다.
상기 도라지 추출물은 플라티코딘 함량이 1% 이상인 것이 바람직하다.
상기 플라티코딘은 플라티코딘 D인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 일반적으로 플라티코딘은 플라티코딘 D의 함량이 가장 많으며 유사한 구조의 플라티코딘 D2 및 D3 등이 포함된다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우, 장용코팅하는 것이 바람직하다.
구체적으로, 본 발명의 도라지 추출물이 포함하고 있는 플라티코딘 D(PD)를 이용하여, 약동학 테스트를 수행한 결과, 약동학적 지표의 수치를 통하여 플라티코딘 D 화합물은 위를 직접 경유하는 경구투여보다는, 위에서의 손상 및 부작용을 최소화할 수 있도록, 약물이 위에서 녹지 않고 장에서 녹을 수 있도록 특수하게 코팅하는 장용 코팅 처리를 하여 투여하는 것이 보다 효과적이고 바람직한 것임을 확인하였다. 따라서, 상기 플라티코딘 D를 함유하는 도라지 추출물은 유의적인 류마티스 관절염 치료효과를 나타내기 위해 장용코팅하여야 한다.
한편, 상기 장용코팅을 하기 위한 구체적인 조성은 하기와 같다.
또한, 본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 도라지 추출물의 양을 기준으로 0.001 내지 200 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.01 내지 50 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 도라지(Platycodon grandiflorum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 도라지 추출물은 플라티코딘 함량이 1% 이상인 것이 바람직하다.
상기 플라티코딘은 플라티코딘 D인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 일반적으로 플라티코딘은 플라티코딘 D의 함량이 가장 많으며 유사한 구조의 플라티코딘 D2 및 D3 등이 포함된다.
본 발명의 도라지 추출물은 류마티스 관절염에 대한 현저한 치료효과를 나타내므로, 류마티스 관절염 예방 및 개선용 건강기능식품에 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 명세서의 "건강기능식품"이란 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분 (기능성원료)을 사용하여 제조한 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품으로 식품의약품안전처장이 정한 것을 의미하나, 이에 한정되지 않으며 통상적인 의미의 건강식품을 배제하는 의미로 사용된 것이 아니다.
본 발명의 도라지 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 다당류, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 도라지 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 도라지 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 도라지 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 도라지(
Platycodon grandiflorum
A. DC) 추출물의 제조
<1-1> 도라지 물 추출물의 제조
도라지 분말 1,000g 에 증류수 5,000 ㎖를 가하고 90℃에서 6시간 동안 2회 환류 추출한 후 냉각시켜 30분 동안 상온에서 원심 분리(10,000 × g)하여 고형분을 제거하였다. 원심 분리된 용액을 분무 건조시켜 분말상의 도라지 물 추출물 368 g을 수득하였다.
<1-2> 도라지 에탄올 추출물의 제조
도라지 분말 1,000 g에 주정 에탄올 5,000 ㎖를 가하고 수욕 상에서 6시간 동안 2회 환류 추출한 후 냉각시켜 30분 동안 상온에서 원심 분리(10,000 × g)하여 고형분을 제거하였다. 원심 분리된 용액을 감압 건조하여 분말상의 도라지 추출물 136 g 을 수득하였다.
<1-3> 도라지 메탄올 추출물의 제조
도라지 분말 1,000 g에 메탄올 5,000 ㎖를 가하고 수욕 상에서 6시간 동안 2회 환류 추출한 후 냉각시켜 30분 동안 상온에서 원심 분리(10,000 × g)하여 고형분을 제거하였다. 원심 분리된 용액을 감압 건조하여 분말상의 도라지 추출물 205 g 을 수득하였다.
<1-4> 도라지 90% 에탄올 추출물의 제조
도라지 분말 1,000 g에 90% 주정 에탄올과 10% 물을 혼합하여 5,000 ㎖가 되도록 가하고 수욕 상에서 6시간 동안 2회 환류 추출한 후 냉각시켜 30분 동안 상온에서 원심 분리(회전 속도 10,000 × g)하여 고형분을 제거하였다. 원심 분리된 용액을 감압 건조하여 분말 상의 도라지 90% 에탄올 추출물 156 g을 수득하였다.
<1-5> 도라지 75% 에탄올 추출물의 제조
도라지 분말 1,000 g에 75% 주정 에탄올과 25% 물을 혼합하여 5,000 ㎖가 되도록 가하고 수욕 상에서 6시간 동안 2회 환류 추출한 후 냉각시켜 30분 동안 상온에서 원심 분리(회전 속도 10,000 × g)하여 고형분을 제거하였다. 원심 분리된 용액을 감압 건조하여 분말 상의 도라지 90% 에탄올 추출물 175 g을 수득하였다.
<1-6> 도라지 50% 에탄올 추출물의 제조
도라지 분말 1,000 g에 50% 주정 에탄올과 50% 물을 혼합하여 5,000 ㎖가 되도록 가하고 수욕 상에서 6시간 동안 2회 환류 추출한 후 냉각시켜 30분 동안 상온에서 원심 분리(회전 속도 10,000 × g)하여 고형분을 제거하였다. 원심 분리된 용액을 감압 건조하여 분말 상의 도라지 90% 에탄올 추출물 230 g을 수득하였다.
<1-7> 도라지 25% 에탄올 추출물의 제조
도라지 분말 1,000 g에 25% 주정 에탄올과 75% 물을 혼합하여 5,000 ㎖가 되도록 가하고 수욕 상에서 6시간 동안 2회 환류 추출한 후 냉각시켜 30분 동안 상온에서 원심 분리(회전 속도 10,000 × g)하여 고형분을 제거하였다. 원심 분리된 용액을 감압 건조하여 분말 상의 도라지 90% 에탄올 추출물 305 g을 수득하였다.
<1-8> 도라지 10% 에탄올 추출물의 제조
도라지 분말 1,000 g에 10% 주정 에탄올과 90% 물을 혼합하여 5,000 ㎖가 되도록 가하고 수욕 상에서 6시간 동안 2회 환류 추출한 후 냉각시켜 30분 동안 상온에서 원심 분리(회전 속도 10,000 × g)하여 고형분을 제거하였다. 원심 분리된 용액을 감압 건조하여 분말 상의 도라지 90% 에탄올 추출물 356 g을 수득하였다.
<1-9> 도라지 착즙 추출물의 제조
생도라지 5,000 g을 착즙기로 1차 착즙하여 300 ㎖의 도라지 생즙을 수득한 다음, 1차 착즙하고 남은 잔류물에 다시 물 1,000 ㎖을 가해 상온에서 4-10시간 동안 교반하고 2차 착즙하여 1,100 ㎖을 얻었다. 1차, 2차 착즙한 도라지 생즙을 합하고 30분 동안 10,000 × g에서 원심 분리하여 고형분을 제거하였다. 원심 분리된 용액을 분무 건조하여 분말 상의 도라지 착즙물 476 g을 수득하였다.
<실시예 2> 도라지 추출물로부터 조 사포닌의 분리
<2-1> 도라지 물 추출물로부터 조 사포닌의 분리
상기 <실시예 1>에서 제조한 도라지 물 추출물로부터 아래와 같은 방법으로 조 사포닌을 분리하였다.
구체적으로, 도라지 물 추출물 100g을 물 1,000 ㎖에 녹여 500 ㎖의 역상 겔 (HP-20, RP-18, 또는 MCI 겔)로 충진된 컬럼(50 × 250㎜)에 주입하여 조 사포닌을 흡착시킨다. 흡착되지 않는 당 성분들 (글루코스, 솔비톨, 프락토스, 슈크로스 및 프락토올리고당 등 이눌린)을 제거하기 위하여 1,000 ㎖의 물 및 3-5 %의 아세토니트릴 수용액 500 ㎖를 계속해서 흘려주고 아세토니트릴을 없애기 위하여 다시 물 500 ㎖을 흘려준다. 당 성분들이 완전히 제거되면 30-90 % 에탄올 수용액 (500 ㎖)을 충분히 흘려주어 흡착된 성분을 탈착시켜 얻은 에탄올 수용액을 감압 증류하면 7 g의 고형분을 얻는다. 얻어진 고형물을 에탄올 50 ㎖를 가하여 에탄올에 녹지 않는 부분을 여과해내고, 얻어진 여액에 에틸아세테이트 100 ㎖을 가하여 생성된 고체를 여과하고 잘 건조시켜 6.5g 의 조사포닌을 수득하였다.
<2-2> 도라지 착즙 추출물로부터 조 사포닌의 분리
상기 <실시예 1>에서 제조한 도라지 착즙 추출물 100 g을, 상기 실시예 <2-1> 동일한 방법으로 조 사포닌을 분리 정제하여 14.8g의 조 사포닌을 얻었다.
<실시예 3> 한외여과막 여과를 이용한 도라지 사포닌 함유 조성물의 제조
한외여과막(ultra-filtration membrane)은 펠리콘(Pellicon) 2 TFF 시스템 (Millipore USA, 제품번호(PART# xi42 pm001))를 사용하였다. 상기 <실시예 1>에서 얻은 도라지 추출물 100 g을 증류수 18,000 ㎖에 녹여 잔류물이 100 ml가 될 때까지 한외여과막(Pellicon 2, 1 KDa)을 통과시켰다. 남은 잔류물에 1,000 ㎖의 물을 추가하여 잔류물의 용량이 100 ㎖ 이하가 될 때까지 계속 한외여과막 (Pellicon 2, 1 KDa)을 통과시켰다. 한외여과막을 통과한 여과물을 모아 감압 농축하여 분자량 1,000 이상의 도라지 조성물을 하기 [표 1]에서와 같이 각각 수득하였다.
| 구분 | <실시예 3>의 한외여과막 여과를 통한 도라지 조성물 수득량 |
| <1-1> 도라지 물 추출물 | 29 g |
| <1-2> 도라지 에탄올 추출물 | 24 g |
| <1-3> 도라지 메탄올 추출물 | 25 g |
| <1-4> 도라지 90% 에탄올 추출물 | 26 g |
| <1-5> 도라지 75% 에탄올 추출물 | 26 g |
| <1-6> 도라지 50% 에탄올 추출물 | 27 g |
| <1-7> 도라지 25% 에탄올 추출물 | 28 g |
| <1-8> 도라지 10% 에탄올 추출물 | 28 g |
| <1-9> 도라지 착즙 추출물 | 40 g |
<
실시예
4>
고함량의
플라티코딘을
가지는 도라지 추출물의 제조
본 연구자들은 플라티코딘(Platycodin) D의 함량을 높이기 위해, Diaion, Lewatit, Dowex, Amberite 등과 같은 이온교환수지 및 사이즈 배재 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 사용하여 단당류 및 이당류인 포도당(glucose), 과당(fructose), 솔비톨(solbitol), 자당(sucrose) 등과 프락토올리고당들을 제거하였다.
구체적으로, Diaion UBK 500 ml을 유리관(2.5 x 100 cm)에 넣은 다음 증류수 500 ml로 씻어내고 이어서 5% NaCl 수용액 200 ml을 가하여 Na-form으로 치환시킨 후 증류수 500 ml로 NaCl을 제거하여 관 크로마토그라피를 준비하였다. 여기에 농축된 상기 <실시예 1>의 도라지 열수 추출물(PD 함량 0.098%) 2 g을 20 ml의 물에 용해시켜 서서히 관 크로마토그라피에 가하고, 증류수 500 ml 이상을 가하여 용출되는 물질들을 TLC로 확인하면서 당 화합물들을 분리하여 제거하였다. 단당류 및 이당류인 포도당(glucose), 과당(fructose), 솔비톨(solbitol), 자당(sucrose) 등과, 프락토올리고당들이 제거된 것을 확인한 후, 나머지 용출액을 모아 감압 증류하여 210 mg의 화합물을 얻었다.
그 결과, 표 2 및 도 3에서 나타낸 바와 같이 상기에서 얻어진 화합물을 HPLC로 확인한 결과 당을 분리한 후의 도라지 추출물의 플라티코딘(Platycodin) D의 함량이 약 10배 정도 높아진 것으로 확인되었다(표 2 및 도 3).
| 당 분리 전 도라지 추출물 |
성분명 | PD |
| 머무른시간(min) | 64.382 | |
| 면적(uVsec)) | 2564056.54 | |
| 면적% 표지(%) | 100.000 BMB | |
| 농도 | 381.448 | |
| 당 분리 후 도라지 추출물 |
성분명 | PD |
| 머무른시간(min) | 64.882 | |
| 면적(uVsec)) | 34210565.32 | |
| 면적% 표지(%) | 100.000 BMB | |
| 농도 | 3887.236 |
<
실험예
1> 다당체 및
조사포닌의
함량 변화 확인
한외여과막 여과를 이용한 도라지 조성물의 다당체 및 조사포닌 함량을 확인하기 위하여, 분석에 사용된 기기는 Solvent delivery pump (NS-4000i Futecs.co.ltd)를 사용하였으며, 표준 분석용 컬럼은 OH pak (SB-802, 802.5,806M) 또는 이와 동등한 것을 사용하며, 컬럼 온도는 60℃를 유지하도록 하고, 검출기는 굴절율 검출기 (Refractive Index detector (IR-101 shodex))를 사용한다. 유속(flow rate)은 0.9 ㎖/min으로 하고, 이동상 용매는 증류수를 사용한다. 전체 분석 시간은 100분으로 하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 도라지 착즙 추출물은 착즙 후에는 분자량 1,000 이하의 물질들이 분자량 2,000 이상의 물질보다 큰 영역을 나타내고 있으나 한외 여과 후에는 오히려 분자량 2,000 이상의 물질들이 더 큰 영역을 나타내고 있음을 알 수 있었다.
이 결과를 토대로 초기 다당체 및 조사포닌 함량에 비하여 한외 여과후의 다당체 및 조사포닌의 함량이 2배 이상 증가하였음을 확인하였다(도 1).
<
실험예
2>
류마티스
관절염에서 도라지 추출물의 파골세포 분화 능력 억제 효과 확인
류마티스 관절염에서는 파골세포의 분화가 활성화되어 관절을 파괴한다고 보고 되어 있다. 본 연구에서는, 상기 <실시예 4>에서 제조한 본 발명의 도라지 추출물의 효능을 확인하기 위하여 도라지 추출물 농도에 따른 파골세포 분화 억제 능력을 분석하였다.
구체적으로, 파골세포로 분화가 가능한 골수세포(bone marrow cells)를 분리한 후, 상기 파골세포의 배양을 위하여 PBMC(4 × 105 cell/well)와 RASF(0.5 × 103 cell/well)를 2주간 함께 배양하여 CD40L+ 또는 CD40L-세포(0.5×104 cell/well) 또는 T cell(104 cell/well)을 48-well plate에 분주하여 M-CSF 30 ng/ml, RANKL 150 ng/ml를 처리 후 4일간 배양하였다. 상기 배양된 세포에 대조군, 에탄올 대조군과 함께 상기 <실시예 4>에서 제조한 본 발명의 도라지 추출물을 2, 5, 10 ㎍/ml의 농도로 처리하여 4일 째 되는 날 TRAP 염색하고, 네 구역에서 영상분석 시스템(Image Gauge, Tokyo, Japan)을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 도라지 추출물을 처리 4일 후 파골 세포를 관찰한 결과 처리하지 않은 대조군에 비하여 최대 10 ㎍/ml의 도라지 추출물을 처리한 군에서 파골세포의 크기와 분화량이 감소한 결과를 확인하였다(도 4). 따라서, 파골세포의 분화 유도를 억제하므로 류마티스 관절염 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.
<실험예 3> 류마티스 관절염 동물모델에서 도라지 추출물의 류마티스 관절염 개선 효과 확인
<3-1> 실험동물의 준비
실험동물은 샘타코 바이오코리아(오산 한국)에서 Specific-pathgen free (SPF) 상태의 DBA/1 mice male 7주령을 분양받아 일주일 순화기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 실험 식이는 일반 고형 사료(Samtakα Gyunggi, Korea)를 급여하며 순화기간 중 음수는 여과한 음용수를 매일 갈아주며 자유롭게 섭취하도록 하였다. 사육기간 중 온도는 23±1℃ 습도 50±5%, 소음 60 phone 이하, 조명시간 08:00∼20:00 (1일 12시간), 조도 150∼300 Lux, 환기는 시간당 10회 ~ 12회의 환경을 유지하였다. 아울러, 본 발명은 원광대학교의 동물실험윤리규정을 준수하여 수행하였다.
실험군 구성을 위하여, 순화기간을 거친 실험동물은 Z열 방식(난괴법)으로 그룹을 배정하였다. 실험군은 정상군(Normal group), 류마티스 관절염(Rhuematoid arthritis; RA)을 유발한 대조군(Control group), 류마티스 관절염(RA) 유발 후 상기 <실시예 4>에서 제조한 본 발명의 도라지 추출물 100 mg/kg를 투여한 실험군, RA 유발 후 본 발명의 도라지 추출물 300 mg/kg 투여한 실험군, RA 유발 후 본 발명의 도라지 추출물 1000 mg/kg 투여한 실험군, RA 유발 후 상기 <실시예 2>에서 분리한 조사포닌 6 mg/kg를 투여한 실험군으로 하여 군당 10마리씩 실험에 사용하였다. 모든 실험군의 체중과 사료 및 음수량은 주 1회 간격으로 측정하며 사료 및 음료 섭취량의 경우 급여 후 잔량을 측정하여 일정한 시간에 측정하였다.
도 5에 도식화한 것과 같이, Bovine type Ⅱ collagen를 이용하여 류마티스 관절염을 유도하였다. 구체적으로, 2 mg/㎖ 농도의 Bovine type Ⅱ collagen 용액을 동일한 농도의 complete Freund's adjuvant(CFA, Chondrex, Redmond, WA, USA)와 동량의 비율로 혼합하여, 0일차에 혼합액 150 ㎕(제2형 콜라겐 100 ㎍)을 꼬리의 기저부에서 1.5 ~ 3 cm 아래쪽의 피내를 통해 천천히 주입하여 1차 유발하였다. 이 후, 21일차에는 1차 시기와 동일하게 Bovine type Ⅱ collagen 용액과 incomplete Freund's adjuvant(IFA, Chondrex)과 혼합하여 꼬리의 기저부에 주사하여 관절의 파괴, 변형 및 부종 등을 유발하였다. 각 실험군별 시료의 처치는 21일차 면역촉진제를 투여하는 시기를 기점으로 매일 일정시간에 경구투여하며, 대조군에는 실험군의 동일한 양의 음용수를 투여하였다. 이 후, 일주일 간격으로 발목 두께를 측정하며 40일차에 부검하여 각 바이오마커를 분석하였다.
<3-2> 체중 변화량 및 식이/음수 섭취량의 변화 확인
상기 <실시예 4>에서 제조한 본 발명의 도라지 추출물이 상기 실험예 <3-1>에서 제조한 류마티스 관절염(Rhuematoid arthritis; RA) 동물모델에 미치는 영향을 알아보기 위해 먼저 순화기간부터 관절염 유도 기간 동안 각 실험군 별 체중 변화량을 측정하였다.
정상군과 비교하여 대조군의 체중은 RA 유도물질을 투여함에 따라 체중이 감소하였으며, 1차 boosting을 투여한 후에 체중이 감소하기 시작하여 2차 boosting을 투여하였을 때는 시간이 경과 함에 따라 체중이 감소하여 30일 차에는 류마티스 관절염 통증으로 초기 체중보다 감소하였으며, 33일 차부터 유지되는 경향을 보였다. 반면 도라지 추출물 추출물을 투여한 실험군(Platycodi radix extract group)의 경우 대조군과는 달리 RA 유도물질을 투여한 후에는 정상군과 체중이 유사하였으며 1차 boosting을 투여한 후 체중이 감소하여 2차 boosting을 투여한 후 가장 낮은 체중량을 보였으나, 33일 차에는 다시 체중이 증가되는 경향을 보였다.
이에 따라 실험 종료 시점인 36일 차에 각 실험군의 체중을 비교하여 보면 정상군(Normal group)이 22.6±0.4 g, 대조군(Control group)이 19.0±0.3 g으로 유의한 차이를 보였고 도라지 추출물 100 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 100 mg/kg, PGE-100 group)은 19.8±0.4 g, 300 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 300 mg/kg, PGE-300 group)은 19.9±0.2 g, 1000 mg/kg을 투여한 실험군(Platycodi radix extract 1000 mg/kg, PGE-1000 group)은 21.1±0.6 g으로 시료의 투여농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 체중이 유의하게 증가하였다. 반면 양성대조군인 조사포닌 추출물 6 mg/kg을 투여한 실험군(Crude saponin extract 6 mg/kg, CS-6 group)의 체중량은 20.1±0.4 g으로 대조군과 PGE-100 실험군 및 PFE-300 실험군과 비교하여 높은 경향을 보였으나 PGE-1000 실험군 보다는 낮게 조사되어 실험군 중 도라지 추출물 1000 mg/kg를 투여한 실험군의 체중량이 가장 높은 것으로 확인되었다(도 6).
또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 류마티스 관절염 시험 기간 동안 각 실험군별 주간 식이 음수량에는 일부 차이가 나타나기는 하였으나 농도 의존적인 경향이나 군간 유의적인 차이는 확인되지 않았다(도 7).
<3-3> 임상적 관찰
류마티스 관절염 유발여부를 확인하기 위하여 부종 및 홍반, 경직 정도를 0 ~ 3 점으로 계산하여 점수화하였다. 류마티스 관절염 임상 점수는 부기 및 병리적 소견이 관찰되지 않을 경우, 0점, 경미한 부종 및 홍반이 관찰될 경우 1점, 확연하게 부종이 나타나는 경우 2점, 및 심각한 부종 및 경직상태의 경우 3점으로 평가하여 계산하였다. 각 군당 전체 류마티스 관절염 임상점수는 개체별 점수의 평균치로 산출하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 정상군에 비해 대조군은 1차와 2차 boosting을 투여한 후 부종에 의해 앞발과 뒷발 모두 임상점수가 크게 증가하였는데, 원래 발 상태에 비해 2차 boosting을 투여한 후인 30일 차에 임상점수가 가장 유의하게 증가하였다. 한편 도라지 추출물 투여군과 조사포닌 추출물 투여군의 경우 1차 boosting을 투여한 후에는 정상군과 유사한 수준을 보였고, 2차 boosting을 투여한 후 임상적인 변화가 관찰되었으나 대조군과 비교하여 임상 점수는 낮은 경향을 보이거나 유의하게 낮은 것으로 조사되었다. 실험군 별로 36일 차에 발의 임상변화에 따른 점수는 정상군이 0.56±0.24점, 대조군이 4.00±0.00점, PGE-100 실험군이 3.78±0.15점, PGE-300 실험군이 3.33±0.33점, PGE-1000 실험군이 2.67±0.33점, CS-6 실험군이 2.78±0.32점으로 도라지 추출물의 투여 농도가 높아질수록 임상점수는 유의하게 낮은 것으로 확인되었다(도 8).
<3-4>
류마티스
관절염 동물모델의 앞/뒷다리 부종의 변화 확인
상기 <실시예 4>에서 제조한 본 발명의 도라지 추출물이 류마티스 관절염(Rhuematoid arthritis; RA) 동물모델에 미치는 영향을 알아보기 위해 발 두께 변화를 측정하여 비교하였다.
그 결과, 도 9 내지 도 12에 나타낸 바와 같이 각 군별 앞발의 두께는 정상군이 0.19±0.01 cm, 대조군이 0.34±0.01 cm로 관절염의 유도에 의해 발 두께가 유의하게 증가하였고 본 발명의 도라지 추출물을 투여한 PGE-100 실험군은 0.35±0.01 cm, PGE-300 실험군은 0.34±0.01 cm, PGE-1000 실험군은 0.29±0.02 cm, 양성대조군인 CS 실험군은 0.31±0.01 cm로 나타나 실험군 중 PGE-1000 실험군만이 대조군과 유의한 차이를 보였다(도 9a). 초기 앞발 두께에 대한 각 실험군별 발 두께 변화를 백분율로 계산한 결과 정상군은 102.95±4.46%, 대조군은 185.31±2.93%, PGE-100 실험군은 190.26±3.49%, PGE-300 실험군은 176.10±1.86%, PGE-1000 실험군은 151.29±6.89%, CS 실험군은 161.38±5.97%로 본 발명의 도라지 추출물을 투여한 실험군은 대조군에 비해 류마티스 관절염에 의한 발 두께의 증가를 감소시키는 경향을 나타내거나 유의하게 감소시킨 것으로 나타났다(도 9b). 류마티스 관절염 동물모델에서 각 실험군별 앞발의 변화를 살펴보면, 본 발명의 도라지 추출물 투여군과 조사포닌 투여군의 발 두께가 현저히 감소하여 효과가 있음을 확인하였다(도 10).
뒷발의 경우, 각 군별 발 두께는 정상군이 0.25±0.00 cm, 대조군이 0.31±0.01 cm, PGE-100 실험군이 0.30±0.02 cm, PGE-300 실험군이 0.28±0.01 cm, PGE-1000 실험군이 0.26±0.00 cm, CS 실험군이 0.28±0.01 cm로 대조군과 비교하여 본 발명의 도라지 추출물과 조사포닌 추출물을 투여한 실험군 모두에서 발 두께가 감소하였다(도 11a). 초기 발 두께에 대한 군별 발 변화비율은 정상군이 103.33±3.12%, 대조군이 129.12±3.81%로 관절염 유도 후 유의하게 발 두께가 증가하였고, PGE-100 실험군이 121.40±5.52%, PGE-300 실험군이 115.40±3.87%, PGE-1000 실험군이 109.87±1.77%, CS 실험군이 113.36±2.23%로 시료를 투여한 실험군이 대조군에 비해 발 두께가 유의하게 감소하였다(도 11b). RA 동물모델에서 각 실험군별 뒷발의 변화를 역시 본 발명의 도라지 추출물 투여군과 조사포닌의 투여군의 현저히 두께가 감소하여 효과가 있음을 확인하였다(도 12).
<3-5> 혈액 내 지표항목 분석
류마티스 관절염을 유도한 동물모델에서 각 실험군별 혈액 내 염증 지표 인자인 TNF-α(tumor necrosis factor-α)와 IL-1β(Interleukin 1β)의 함량을 비교 분석하였다. 혈액은 복대정맥에서 채혈하여 튜브에 3000 rpm에서 10분간 원심분리 후, 혈청만을 분리하여 분석에 사용하였다. 혈청은 TNF-α와 IL-1β 분석에 사용하며, 녹십자 의료재단(GC Labs, 한국)에 분석을 의뢰하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 혈중 TNF-α의 함량은 정상군이 67.97±7.75 ug/ml, 대조군이 97.73±6.52 ug/ml로 류마티스를 유도한 실험군에서 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 반면 본 발명의 도라지 추출물을 투여한 경우 혈중 TNF-α 함량은 점차 감소하여 PGE-100 실험군이 81.34±5.52 ug/ml, PGE-300 실험군이 73.28±3.76 ug/ml, PGE-1000 실험군이 63.30±2.68 ug/ml로 시료의 투여농도가 증가할수록 대조군에 비해 혈중 함량이 감소하는 경향을 보이거나 유의하게 감소된 것으로 조사되었다. 양성 대조군인 CS 실험군에서도 63.61±2.73 ug/ml로 나타나 PGE-1000 실험군과 유사한 수준을 보이는 것으로 나타났다(도 13a).
또한, 각 실험군별 혈중 IL-1β의 함량의 변화를 비교한 실험에서 정상군의 98.12±8.50 ug/ml에 비해 대조군은 157.65±16.10 ug/ml로 유의하게 증가되었다. 반면 시료를 투여한 실험군의 경우 농도 의존적으로 혈중 IL-1β의 함량이 감소하여 PGE-100 실험군이 130.82±8.90 ug/ml, PGE-300 실험군이 112.29±4.48 ug/ml, PGE-1000 실험군이 105.56±5.97 ug/ml로 나타났으며 CS 실험군은 106.21±6.48 ug/ml로 PGE-1000 실험군과 유사한 수준을 보였다(도 13b).
<
실험예
4> 약동학 테스트
<4-1> 실험동물의 선별 및 준비
실험용 동물은 베이징 바이탈 리버 연구소 동물 기술사(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.)에서 구입한 190-215 g의 중량을 갖는 6-8주의 수컷 SD 래트이다. SD 래트를 체중에 근거하여 무작위로 네 군(1군 내지 4군)으로 나누었고, 각 군에는 여섯 마리씩 래트가 들어있다. 모든 래트는 오른쪽의 경정맥(jugular vein)에 카테터(catheter)를 삽입하였고, 정맥주사 실험을 할 1군에는 대퇴정맥에 카테터(catheter)를 삽입하였으며, 십이지장 투여 실험을 할 3군에는 중앙선 복부 절개로 소장을 노출시키고 위장을 작게 절개하여 폴리에틸렌관을 십이지장 쪽으로 삽입하였고, 회장 투여 실험을 할 4군에는 중앙선 복부 절개로 소장을 노출시켜 회장을 작게 절개하여 폴리에틸렌관을 삽입하였다. 이때 노출된 말단을 마개로 막아서 십이지장 및 회장 내용물이나 화합물이 배수되지 않도록 하였다. 수술을 수행한 뒤 1주일 동안 수술로부터의 회복기를 가졌다.
<4-2> 약동학 테스트를 위한 플라티코딘(Platycodin) D 투여
약동학 테스트를 위하여, 플라티코딘(Platycodin) D[PD]를 상기 <4-1>에서 준비한 동물모델에 투여하였다.
구체적으로, 1군은 PD화합물을 정맥주사로 투여한 대조군이다. 약동학 테스트전에, SD 래트를 16시간 동안 금식을 시킨 후, PD화합물을 단일 투여량으로 5 mg/kg을 대퇴정맥 카테터를 통하여 투여하였다. 투여 후, 200 ㎕ 혈액 샘플을 상기 정맥 투여 동물군에 대해, 투여 후 0분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 및 6시간에 경정맥 카테터을 통해 각각 정기적으로 수집하였다. 혈액 샘플은 EDTA가 있는 샘플 튜브에 수집하였고, 즉시 4℃에서 5 분간 4000 rpm으로 원심분리한 후, 혈장(plasma)은 다른 샘플 튜브로 옮겨 -20℃에서 보관하였다.
2군은 PD화합물을 경구투여한 군이다. 테스트전에, SD 래트를 16시간 동안 금식을 시킨 후, PD화합물을 단일 투여량으로 10 ㎎/㎏을 경구투여했다. 투여 후, 200 ㎕ 혈액 샘플을 상기 경구투여 동물군에 대해, 투여 후 0분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 및 6시간에 경정맥 카테터을 통해 각각 정기적으로 수집하였다. 혈액 샘플은 EDTA가 있는 샘플 튜브에 수집하였고, 즉시 4℃에서 5 분간 4000 rpm으로 원심분리한 후, 혈장(plasma)은 다른 샘플 튜브로 옮겨 -20℃에서 보관하였다.
3군은 PD화합물을 십이지장 투여한 군이다. 테스트전에, SD 래트를 16시간 동안 금식을 시킨 후, PD화합물을 단일 투여량으로 10 ㎎/㎏을 십이지장으로 투여했다. 투여 후, 200 ㎕ 혈액 샘플을 상기 십이지장 투여 동물군에 대해, 투여 후 0분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 및 6시간에 경정맥 카테터을 통해 각각 정기적으로 수집하였다. 혈액 샘플은 EDTA가 있는 샘플 튜브에 수집하였고, 즉시 4℃에서 5 분간 4000 rpm으로 원심분리한 후, 혈장(plasma)은 다른 샘플 튜브로 옮겨 -20℃에서 보관하였다.
4군은 PD화합물을 회장으로 투여한 군이다. 테스트전에, SD 래트를 16시간 동안 금식을 시킨 후, PD화합물을 단일 투여량으로 10 ㎎/㎏을 회장으로 투여했다. 투여 후, 200 ㎕ 혈액 샘플을 상기 십이지장 투여 동물군에 대해, 투여 후 0분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 및 6시간에 경정맥 카테터을 통해 각각 정기적으로 수집하였다. 혈액 샘플은 EDTA가 있는 샘플 튜브에 수집하였고, 즉시 4℃에서 5 분간 4000 rpm으로 원심분리한 후, 혈장(plasma)은 다른 샘플 튜브로 옮겨 -20℃에서 보관하였다.
아울러, 각 군에서 래트의 소변을 채취하였다. PD화합물을 투여하기 전에 복부압박을 통하여 소변을 유도하였고 PD화합물 투여한 뒤 2시간 이후에 대사케이지를 이용하여 대변의 오염이 없도록 하여 채뇨하였으며 소변 샘플은 즉시 4℃에서 5 분간 4000 rpm으로 원심분리한 뒤 다른 샘플 튜브로 옮겨 -20℃에서 보관하였다.
<4-3> 약동학 테스트 결과 분석
상기 <4-2>에서 채취한 혈장 및 뇨 샘플에 대하여 PD화합물의 농도를 측정하기 위해 적정 유기용매를 사용하여 전처리한 뒤 LC-MS/MS를 수행하였다.
구체적으로, 실시예 3에서 채취한 혈장 및 뇨 샘플에 대하여 LC-MS/MS 질량 분석하기 전, 제조사의 제조 방법에 따라 ZipTips TM (Millipore)를 사용하여 정제하였다. 그 뒤 상기 정제한 시료를 Synapt High Definition mass spectrometer (Waters, Manchester, UK)를 사용하여 분석하였다(Jang et al., 2009, Oncogene 28: 1529-1536; Kim et al., 2012, Stem Cells Dev. 10.1089/scd.2011.0243)
그 결과, 각 투여방법에 따른 PD화합물의 시간대별 혈장농도가 도 2와 같이 나타남을 확인하였다(도 2).
한편, PD화합물의 생체 내 약동학적 양상을 분석하기 위한 약동학적 지표에 대한 수치는 표 3과 같음을 확인하였다.
상기 도 2 및 표 3을 바탕으로, Tmax(혈장에서 최대농도에 이르는 시간)는 어느 경우에나 0.5시간으로 차이점이 없었으나 Cmax(혈장에서의 최대농도를 나타내는 지표)에서는 경구투여군에 비해 십이지장 투여군과 회장 투여군에서 각각 4.8배, 12.7배로 높은 수치가 기록되어, PD화합물을 경구보다 십이지장이나 회장으로 직접 투여하는 것이 보다 많은 양이 혈장으로 흡수될 수 있는 것으로 확인하였다. 다른 의미로, 경구투여보다 십이지장 또는 회장으로 직접 투여하는 것이 PD화합물 투여 총량을 상대적으로 줄일 수 있어 경구투여시 나타날 수 있는 더부룩함이나 불쾌감 등의 부작용 또한 줄일 수 있을 것으로 판단된다.
또한, PD 화합물의 정맥투여 후 24시간까지의 AUC값(혈중농도-시간 그래프에서 면적값으로서 투여한 화합물의 생체흡수율과 깊이 관계되는 지표)은 6.5이고, 경구투여의 경우 24시간까지의 AUC값은 0.04이며, 십이지장 및 회장 투여의 경우 각각 0.14와 0.38로 나타났다. 이를 통해, 경구투여에 비해 십이지장 및 회장으로 투여할 경우 AUC 수치가 각각 3.5배, 9.5배로 높아 십이지장이나 회장으로 직접 투여하는 것이 경구투여보다 더 효율적으로 PD화합물의 생체흡수를 도모할 수 있는 것으로 확인하였다.
아울러, 생체이용률(F24hr)은 경구투여의 경우 0.6, 십이지장 투여의 경우 2.2, 회장 투여의 경우 5.9로 나타나 정맥투여에 비해 상대적으로 낮게 나타났으나, 경구투여를 기준으로 하면, 십이지장 투여와 회장 투여는 각각 경구투여 대비 3.7배, 9.8배로 높은 것으로 확인되었다. 이는 경구투여보다 십이지장이나 회장으로 직접 투여할 때 PD화합물의 약리학적 효과가 더 뛰어난 것으로 생각할 수 있는 결과이다.
상기의 약동학적 지표의 수치를 통하여 PD화합물은 위를 직접 경유하는 경구투여보다는, 위에서의 손상 및 부작용을 최소화하며 적은 용량으로도 약효를 극대화할 수 있도록, 약물이 위에서 녹지 않고 장에서 녹아 흡수될 수 있도록 특수하게 코팅하는 장용 코팅 처리를 하여 투여하는 것이 보다 효과적이고 바람직한 것임을 확인하였다.
Claims (24)
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- 1) 도라지(Platycodon grandiflorum)를 물, C1-C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 수득한 추출물을 농축한 후, 이온교환수지 및 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 통과시켜 당 화합물을 분리하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 당 화합물이 분리된 도라지 추출물을 모아 감압 증류 및 건조하여 분말 상의 도라지 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 도라지 추출물의 플라티코딘(Platycodin) 함량을 증가시키는 방법.
- 1) 도라지를 1차 착즙하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 착즙하고 남은 잔유물에 물을 첨가한 후, 2차 착즙하는 단계;
3) 상기 단계 1)의 1차 착즙한 착즙물 및 상기 단계 2)의 2차 착즙물을 혼합한 후, 원심 분리하여, 고형분을 제거하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 고형분이 제거된 착즙물을 상기 단계 1)에서 수득한 추출물을 농축한 후, 이온교환수지 및 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 통과시켜 당 화합물을 분리하는 단계;
5) 상기 단계 4)의 당 화합물을 분리한 착즙물을 분무건조시키는 단계를 포함하는 도라지 추출물의 플라티코딘(Platycodin) 함량을 증가시키는 방법.
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 플라티코딘은 그 함량이 1%(w/w) 이상인 것을 특징으로 하는, 도라지 추출물의 플라티코딘 함량을 증가시키는 방법.
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- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 당 화합물은 포도당(glucose), 과당(fructose), 솔비톨(solbitol), 자당(sucrose) 또는 단당류인 것을 특징으로 하는, 도라지 추출물의 플라티코딘 함량을 증가시키는 방법.
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