CN103073650A - 红芪多糖4及其有效成分的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了红芪多糖4以及红芪多糖4的三个有效组分，包括三个有效组分的具体结构。同时，本发明公开了红芪多糖4及其三个有效组分的制备方法和应用。本发明公开的红芪多糖4及其三个有效组分具有抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、提高机体免疫力、抗辐射的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药提取物，具体地，涉及红芪多糖4、红芪多糖4的有效成分及其制备和应用。
背景技术
红芪(Radix Hedysari)系豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪( Hedysarum polybotrys Hand. -Mazz)的根. 为甘肃特产名贵药材，中医将其作为传统中药，在临床上其具有强心，降糖，利尿，抗病毒，抗衰老等功效。红芪多糖作为其主要活性成分之一，其中HPS4部分具有较明显的抗肿瘤、抗凝血及体外抗氧化等作用。
目前国内外对红芪的化学成分已有了较详细的报道，而对于红芪多糖研究，还只是停留在一级结构及一些药理作用的研究。1997年兰州大学的刘方明从红芪中提取分离出一种均多糖-葡聚糖，并对其结构进行研究；李世刚等通过葡聚糖凝胶柱层析分离纯化得到3个HPS组分，仅用气相色谱法分析了3个HPS组分的单糖组成，并对HPS体外抗肿瘤活性及构效关系进行研究；2009年马守军等对甘谷红芪酸性多糖的纯化及结构进行了初探。马丹等通过分步醇沉法和凝胶柱色谱获得HPS-3均一组分气相色谱法测定其组成。石义凯等研究了水提醇沉法得到的硫酸酯多糖—红芪多糖SHG的结构，多糖作为生物高分子化合物，药理活性，与其理化性质密切相关，因此，了解其理化性质显得尤为重要。
近年来国内学者相继报道了马勃多糖、当归多糖、黄精多糖、徐长卿多糖、青蒿多糖、白芍多糖、银杏叶多糖以及女贞子多糖等中药多糖具有抗肿瘤作用。对于红芪多糖的抗肿瘤作用国内外报道较少。李世刚等报道，红芪多糖可诱导人胃癌MGC- 803细胞、肝癌HEP-G2细胞凋亡；王希玉等报道红芪多糖具有体内抗肿瘤作用。但是，对于红芪多糖4、红芪多糖4的有效成分相关方面的研究还未见报到。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了红芪多糖4、红芪多糖4的有效成分及其制备和应用。本发明制备的红芪多糖4及其有效成分具有抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、提高机体免疫力、抗辐射的作用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
红芪多糖4及其有效成分的制备方法，包括以下步骤：
（1）红芪药材粉碎后，5～20倍水量在40～100℃下浸泡1～5次，每次1～3h；合并浸泡液，浓缩至比重为1.01～1.30；浓缩液用终浓度为20～85%乙醇沉淀，过滤，得沉淀；取上述沉淀复溶于水中，再用终浓度为20%～85%乙醇沉淀，取上清液，浓缩，干燥，得红芪粗多糖；
（2）红芪粗多糖经Sevag法脱蛋白或不脱蛋白，双氧水脱色或不脱色素，得红芪多糖4，红芪多糖4溶液浓缩至多糖含量为0.1~2mg /mL或溶解于水，先用终浓度为20%～85%乙醇沉淀1～5次，再用终浓度为20%～85%乙醇沉淀1～5次，取沉淀，干燥，得红芪多糖4-1和红芪多糖4-2；
（3）红芪多糖4-1经Sephadex G-200柱色谱，以0.05 mol·L-1 的NaAc-HAc缓冲液洗脱，洗脱溶液的pH值保持4.0～8.0，苯酚-硫酸法示踪，得到两个均一组分：红芪多糖4-1A、红芪多糖4-1B；红芪多糖4-2经DEAE-52柱色谱，以0～2.0 mol·L-1的NaCl梯度洗脱得到一个均一组分红芪多糖4-2A。
红芪多糖4-1A具有以下结构式Ⅰ：
其中，n=5~40。HPS4-1A构象为无规则线团，重均分子量Mw为20～73.86kDa，均方根旋转半径Rg为20～50nm ，多分散系数Mw/Mn为1.000～1.300； 各单糖组成的摩尔比例为：鼠李糖（Rha）:阿拉伯糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）=1～100:2～100:1～100:2～100，多糖含量为50～100%； 主链骨架由1,5、1,3,5-α-L-Araf和1,6、1,2,6-α- D-Galp组成，侧链分支点位于阿拉伯糖的3位与半乳糖的2位。侧链分支由1,4、1,4,6-α- D-Glcp，1,2、1,2,4-α-L-Rhap组成。主链非还原末端连接主要是阿拉伯糖。
红芪多糖4-1B具有以下结构式Ⅱ：
其中，n=10~50。HPS4-1B构象为无规线团，Mw为20～50.23KDa，Rg为15～30nm，Mw/Mn为1.005～1.410；各单糖组成的摩尔比例为： 鼠李糖（Rha）:阿拉伯糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）= 10～100:10～100:15～100:13～100，多糖含量为50～99%； 以1,4-α-D-Glcp与1,6-α-D-Galp组成主链骨架。侧链分支由1,6-α-D-Galp、1,2-α-L-Rhap、1-α-D-Glcp与1-α-L-Araf组成。侧链分支位于葡萄糖的6位。每10～13个糖残基有1个硫酸基，硫酸基存在于侧链1,4-α-D-Glcp的O-6位。
红芪多糖4-2A具有以下结构式Ⅲ：
其中，n=3~100。HPS4-2A构象为高度分支结构，Rg为18～30.5 nm, Mw 15～272kDa；Mw/Mn 1～1.80,单糖组成的摩尔比例为：鼠李糖（Rha）:阿拉伯糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）：2-乙酰氨基半乳糖（2-NAc-Gal）=10～100:20～200:20～200:20～100:10～100，多糖含量为50～100%； 以1,3,4-β-D-2-乙酰氨基半乳糖、1,4,6-α-D-葡萄糖、1,4,6-β-D-半乳糖以及1,3,6-β-D-半乳糖组成主链，支链主要由1,5-α-L-Ara与1,2-α-L-Rha组成，另外还有非还原末端 1-α-D-Glcp以及1-α-L-Araf，支链分支点分别位于2-乙酰氨基半乳糖的4位，葡萄糖的4位以及半乳糖的3、6位。每27～32个糖残基有1个硫酸基，硫酸基存在于侧链R1位。
红芪多糖4、红芪多糖4-1A、红芪多糖4-1B、红芪多糖4-2A中的一种或几种组合物在制备抗肿瘤药物、抗凝血药物、抗氧化药物、抗衰老药物、降血糖药物、降血脂药物、提高机体免疫力药物、抗辐射药物中的应用。
一种药剂，含有红芪多糖4、红芪多糖4-1A、红芪多糖4-1B、红芪多糖4-2A中的一种或几种组合成分以及药学上可接受的辅料。
具体地，所述药剂的剂型为溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制剂中的一种。
文中的简写分别代表：
红芪多糖4：HPS4；红芪多糖4-1A：HPS4-1A；红芪多糖4-1B：HPS4-1 B；红芪多糖4-2A：HPS4-2A。
相关实验：
一、红芪多糖4中3个组分的构象研究
1.1 理化性质
HPS4-1A、HPS4-1B和HPS4-2A三个组分对苯酚硫酸试剂均产生颜色反应；DAD检测器色谱图显示，HPS4-1B和HPS4-2A水溶液在280nm有微弱紫外吸收, HPS4-1A水溶液则没有吸收；而这3个组分在200nm左右均有多糖特征吸收峰。以上结果表明组分HPS4-1A为多糖；组分HPS4-1B和HPS4-2A为含少量蛋白质或多肽的多糖蛋白质组合物，经元素分析仪分析，HPS4-1B和HPS4-2A含有3～5%N元素（考马斯亮蓝法测定含蛋白质0.2～2.0%）也验证了这一点。
1.2高效凝胶色谱（HPGPC）法鉴定多糖组分纯度
采用HPGPC-DAD-RI联用技术，色谱柱：Ultrahydrogel 1000、500色谱柱串联，流动相: 超纯水，流速: 0.8mL/min，柱温：35℃，示差折光检测器温度：35℃，进样量:30μl。样品溶液浓度为3mg/mL，0.45μm膜过滤。
图1所示HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A的示差图均为单一对称峰，说明这三个组分都是均一组分。
1.3凝胶渗透色谱-多角度激光散射（GPC-MALLS）法分析多糖构型
采用Ultrahydrogel 1000、500色谱柱串联凝胶色谱，流动相为含0.02% NaN3的0.154M NaCl溶液，流速为0.8 mL/min，柱温：35℃；MALLS的光源气体为氦气和氖气，波长：690 nm。流动相的折光指数取1.330，多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)为0.138,校准激光的仪器常数为 8.1104×10-61/(V cm)，校准示差折光检测器仪器常数为2.2697×10-41/(V cm)。
精密称取样品HPS4-1A,HPS4-1B,HPS4-2A，用流动相配制成30mg/mL溶液 ，经0.45μm滤膜过滤，进样量50μl，进行GPC-MALLS分析。
本发明采用GPC-MALLS联用技术，测得红芪多糖4中3个组分在溶液状态的构象，可为红芪多糖4研发成为药品（如注射剂等）提供基础。
通过对流动相含0.02% NaN3的NaCl溶液的浓度（0～0.2 mol/L）、样品浓度（5～50 mg/mL）、柱温（30～50 ℃）及流速（0～1 mL/min）对样品激光信号影响的考察，结果表明，流动相对样品激光信号的影响最大，其次为样品浓度，而柱温与流速的影响则较小。为避免过高柱压，同时尽量缩短分析时间，流速设为0.8mL/min。流动相浓度的增大以及样品浓度的增加（特别是分子量较小的样品），在较大程度上削减了噪音，提高了激光信号。因此，选用含0.02%NaN3的0.154M NaCl溶液为流动相，样品浓度为30mg/mL，柱温为35℃。
以旋转均方根半径对摩尔质量作图：当斜率为1时，表示高分子在溶液中是棒状排列；当斜率为0.4～0.6时则表示高分子在溶液中呈无规则线团；斜率约为0.33 时则表示高分子在溶液中为球状形态；当图形呈U型（又称马蹄形）时，表示高分子在溶液中为高度支化。HPS4-1A的斜率为0.45±0.01（图2），可知HPS4-1A在流动相溶液中的构型为无规则线团；HPS4-1B的斜率为0.43±0.01（图3），可知HPS4-1B为在流动相溶液中的构型为无规则线团。而HPS4-2A（图4）Rg对Mw作图，分子半径分布呈马蹄形，表明HPS4-2A在流动相溶液中的构型为高度支化。
二、红芪多糖4中3个组分的单糖组成与糖醛酸的确定
2.1. HPS4、HPS4-1A,HPS4-1B的单糖组成（糖腈乙酸酯法）
2.1.1.气相色谱条件
色谱柱为OV-101柱；进样口温度，210 ℃；检测器温度，260 ℃；载气压力：0.5 Mpa；
程序升温：起始温度175℃，以15 ℃/min的速度升至225 ℃，保持5 min，然后以5 ℃/min的速度升至250℃，保持1.5 min。
2.1.2. 标准单糖糖腈乙酸酯衍生物的制备
分别称取鼠李糖、阿拉伯、木糖、糖葡萄糖、半乳糖、甘露糖各5mg，加入10mg盐酸羟胺、7mg内标肌醇六乙酰酯、0.5 mL吡啶, 置烘箱中90℃恒温30 min。取出后冷至室温,加入0.5 mL醋酸酐, 在90℃下继续反应30 min(乙酰化)。反应产物减压蒸干, 溶于1.0 mL氯仿中,进行GC分析。
2.1.3. HPS4、HPS4-1A,HPS4-1B水解及糖腈乙酸酯衍生化
取HPS4、HPS4-1A,HPS4-1B各10mg，加2.0 mL2.0 mol·L-1TFA置于特弗伦管中, 封管后120 ℃水解3 h,冷却后于60 ℃减压旋蒸除去TFA, 加入1.5 mL甲醇溶解, 减压蒸干,重复3次，除尽TFA。向已水解的样品中加入10 mg盐酸羟胺、7 mg内标肌醇六乙酰酯、0.5 mL吡啶, 置烘箱中90℃恒温30 min。取出后冷至室温，加入0.5 mL醋酸酐, 在90 ℃下继续反应30 min(乙酰化)。反应产物减压蒸干, 溶于1.0 mL氯仿中，进行GC分析。结果见图5～7。
通过与标准单糖糖腈乙酸酯衍生物色谱图对照，结合色谱峰面积归一化法测定样品中单糖的组成和摩尔比例，HPS4单糖组成及摩尔比例为: 鼠李糖（Rha）:阿拉伯糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）=1～100:3～100:10～100:1～100 HPS4-1A单糖组成及摩尔比例为：鼠李糖（Rha）:阿拉伯糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）=1～100:2～100:1～100:2～100； HPS4-1B单糖组成及摩尔比例为：鼠李糖（Rha）:阿拉伯糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）= 10～100:10～100:15～100:13～100。
2.2. HPS4-2A的单糖组成
2.2.1. 质谱条件
离子源温度：200℃；接口温度：250℃；溶剂延迟：4min；阈值：1000；起始时间（min）：4.00；结束时间（min）：29.00；采集方式：Scan；质谱检测范围（m/z）：33.00～630.00。
2.2.2. 气相色谱条件
程序升温：起始温度150℃，以5 ℃/min的速度升至170 ℃，然后以8 ℃/min的速度升至250℃，保持1 min，再以15℃/min升至250℃，然后保持5min。
2.2.3. 标准单糖糖醇乙酸酯衍生物的制备
分别称取鼠李糖、阿拉伯、木糖、糖葡萄糖、半乳糖、甘露糖、2-乙酰氨基半乳糖各5mg，加入15mg硼氢化钠和1mL蒸馏水, 震荡后在室温下放置1.5h，使糖还原成相应的糖醇。滴入醋酸分解过量的硼氢化钠，至无气泡产生为止。溶液在60℃下减压浓缩至干。加入0.1%（V/V）盐酸甲醇溶液2mL，震荡后减压蒸发至干，重复4次以除去硼酸根。剩余物在烘箱中105℃恒温加热15 min去除水分。加入0.5mL吡啶和0.5mL醋酸酐, 密封后在100℃下继续反应60min。反应产物直接进行气相色谱分析。
2.2.4. HPS4-2A水解及糖醇乙酸酯衍生化
取HPS4-2A 10 mg，加2.0 mL2.0 mol/LTFA置于特弗伦管中, 封管后120℃水解3 h,冷却后于60 ℃减压旋蒸除去TFA, 加入1.5 mL甲醇溶解, 减压蒸干,重复3次,除尽TFA。向已水解的样品中加入30mg硼氢化钠和2mL蒸馏水, 震荡后在室温下放置1.5 h，使糖还原成相应的糖醇。滴入醋酸分解过量的硼氢化钠，至无气泡产生为止。溶液在60 ℃下减压浓缩至干。加入0.1%（V/V）盐酸甲醇溶液2 mL，震荡后减压蒸发至干，重复4次以除去硼酸根。剩余物在烘箱中105 ℃恒温加热15 min去除水分。加入0.5 mL吡啶和0.5 mL醋酸酐, 密封后在100 ℃下继续反应60 min。反应产物直接进行气相色谱分析。结果见图8、图9，通过与标准单糖糖腈乙酸酯衍生物色谱图对照，结合色谱峰面积归一化法测定样品中单糖的组成和摩尔比， HPS4-2A单糖组成及摩尔比例为：鼠李糖（Rha）:阿拉伯糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）：2-乙酰氨基半乳糖（2-NAc-Gal）=10～100:20～200:20～200:20～100:10～100。
2.3.糖醛酸的鉴定
许多植物多糖含有糖醛酸，为了研究本发明的多糖是否也含有糖醛酸，采用气相色谱法和硫酸咔唑法。
2.3.1. 气相色谱法鉴定糖醛酸
2.3.1.1. 标准单糖衍生物的制备
分别称取鼠李糖、阿拉伯、木糖、糖葡萄糖、半乳糖、甘露糖各2mg，溶于1 mL水中，然后加入78 μL0.5 mol/L碳酸钠。溶液于30 ℃保持45 min，然后加4%的硼氢化钠0.5 mL于室温放置1.5 h。滴加25%乙酸至不产生气泡为止以除去多余的硼氢化钠。溶液通过阳离子交换柱，以 10 mL水洗脱。洗脱液45 ℃真空蒸干。分两次加入甲醇（3 mL）蒸干以除去硼酸盐。85 ℃真空加热2 h将糖醛酸转变为内酯。残渣溶于1 mL吡啶中，加入1 mL正丙胺，密封，55 ℃加热30 min。溶液冷却（45 ℃以下），再加热至55℃减压蒸干。残渣分别加入0.5 mL吡啶和乙酸酐，95 ℃加热1 h。反应产物减压蒸干, 溶于1.0 mL氯仿中,进行GC分析。
2.3.1.2 样品衍生物的制备
取HPS4-1A、HPS4-1B和HPS4-2A各10 mg，加2.0 mL2.0 mol/LTFA置于特弗伦管中, 封管后120 ℃水解3 h,冷却后于60 ℃减压旋蒸除去TFA, 加入1.5 mL甲醇溶解, 减压蒸干,重复3次，除尽TFA。然后按照2.3.1.1方法处理。
2.3.2 硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量
2.3.2.1糖醛酸标准曲线绘制
精密称取葡萄糖醛酸12 mg溶于25 mL容量瓶中。准确移取葡萄糖醛酸标准溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8 mL于具塞试管中，加蒸馏水至1mL，置于冰水浴中，加入浓硫酸6mL，振摇，85℃水浴中保持20 min，取出后冷却至室温，分别加0.2 mL0.1%咔唑乙醇液，室温下保持2 h，于530 nm处测定吸光度A，绘制标准曲线。
2.3.2.2供试品溶液配制及糖醛酸含量测定
称取多糖样品6.0 mg溶于5 mL容量瓶中。分别取此溶液0.1 mL，0.3 mL，0.5 mL于具塞试管中定容至1 mL，以后操作同糖醛酸标准液。
经2.3.1和2.3.2两种方法确定HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A均不含糖醛酸。
三、红芪多糖4中3个组分的化学结构研究
采用部分酸水解、甲基化结合气-质联用、核磁共振等技术对红芪多糖4中3个组分多糖部分的结构进行了研究。
3.1. 多糖样品的部分酸水解
3.1.1 HPS4-1A、HPS4-1B和HPS4-2A的部分酸水解
取HPS4-1A、HPS4-1B和HPS4-2A各50 mg用0.1 mol/LTFA100 ℃水解1 h，冷却至室温后，60 ℃减压旋蒸除去TFA, 加入1.5 mL甲醇溶解, 减压蒸干,重复3次,除尽TFA。用蒸馏水溶解，透析（3500Da）。袋内部分经Sephadex-100柱色谱纯化后得到次级多糖组分HPS4-1A-H、HPS4-1B-H、HPS4-2A-H；袋外部分收集得到HPS4-1A-L、HPS4-1B-L、HPS4-2A-L。以上所得部分酸水解产物进行单糖组成分析
3.1.2 HPS4-1A、HPS4-1B和HPS4-2A部分酸水解产物的单糖组成分析
HPS4-1A和HPS4-1B的部分酸水解产物按2.1方法进行单糖组成分析。
HPS4-2A的部分酸水解产物按2.2所述述方法进行单糖组成分析。
3.2. 多糖的甲基化
取经充分干燥的多糖样品5 mg，充分溶于2.5 mLDMSO，置10 mL的圆底烧瓶中。然后加入100 mg的氢氧化钠粉末，充氮气，室温下超声10 min（或者90 min），放置90 min。然后置冰浴中滴加1.875 mL（0.75×2.5倍）碘甲烷，约需1 min。在室温下超声30 min，放置30 min，加水1 mL终止反应,加入1 mol/LHAc中和，透析，冷冻干燥。如此重复三次，经IR检测，即得全甲基化的样品。
上述全甲基化样品加入88%甲酸5.0 mL，100 ℃密封水解3 h，减压蒸发至干。加入2 mol/L三氟乙酸2.0 mL，120 ℃水解3 h，减压蒸发至干。然后加甲醇3.0 mL，再减压蒸发至干，如此重复三次。
在上述蒸干的残渣中加入新配置的0.5 mol/L硼氢化钠的氨水溶液（硼氢化钠溶解在2 mol/L的氨水中）2.5mL，60 ℃反应60 min，加丙酮1.25 mL终止反应，40 ℃减压蒸干。残渣溶于0.5 ml 18 mol/L的乙酸中，加入2.5 mL乙酸乙酯，然后再加入7.5 mL的乙酸酐，混合后加入0.25 mL70%高氯酸，充分混合。反应5 min后，冰浴冷却，加入10 mL蒸馏水，再加入0.5 mL 1-甲基咪唑（催化剂），混合，反应5 min。加入二氯甲烷1.5 mL萃取，取二氯甲烷层，GC-MS分析。
3.2. HPS4-1A、HPS4-1B和HPS4-2A的NMR分析
称取充分干燥的HPS4-1A、HPS4-1B和HPS4-2A，溶于1.0 mL重水中，冷冻干燥，如此重复用重水交换三次，再溶于0.5mL重水后，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过后在Bruker DRX-600核磁共振光谱仪上进行1H和13C NMR分析。
经以上的结构研究分析，红芪多糖HPS4-1A、HPS4-1B和HPS4-2A的结构如下：
HPS4-1A主链骨架由1,5、1,3,5-α-L-Araf和1,6、1,2,6-α- D-Galp组成，侧链分支点位于阿拉伯糖的3位与半乳糖的2位。侧链分支由1,4、1,4,6-α- D-Glcp，1,2、1,2,4-α-L-Rhap组成。主链非还原末端连接主要是阿拉伯糖。
HPS4-1B以1,4-α-D-Glcp与1,6-α-D-Galp组成主链骨架。侧链分支由1,6-α-D-Galp、1,2-α-L-Rhap、1-α-D-Glcp与1-α-L-Araf组成。侧链分支位于葡萄糖的6位。每10～13个糖残基有1个硫酸基，硫酸基存在于侧链1,4-α-D-Glcp的O-6位。
HPS4-2A以1,3,4-β-D-2-乙酰氨基半乳糖、1,4,6-α-D-葡萄糖、1,4,6-β-D-半乳糖以及1,3,6-β-D-半乳糖组成主链，支链主要由1,5-α-L-Ara与1,2-α-L-Rha组成，另外还有非还原末端 1-α-D-Glcp以及1-α-L-Araf，支链分支点分别位于2-乙酰氨基半乳糖的4位，葡萄糖的4位以及半乳糖的3、6位。每27～32个糖残基有1个硫酸基，硫酸基存在于侧链R1位。
四、红芪多糖4及红芪多糖4中3个组分的抗肿瘤作用研究
4.1. 材料
HPS4、HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、昆明小鼠，体质量（20.0± 2.0g），雌雄各半。在室温正常光线下自由饮食水，适应性喂养1周后随机分为6组，分别为HPS4、HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A组、 模型组、环磷酰胺30mg/ (kg??d)组 ,每组10只，雌雄各半。
4.2. 红芪多糖4及红芪多糖4中3个组分对S180 荷瘤小鼠瘤重的影响
4.2.1. 造模及给药
无菌条件下抽取接种7d 生长良好的S180 荷瘤小鼠腹水( 活癌细胞数> 95% ) , 用无菌生理盐水( 体积比1：4) 稀释, 按0.3mL/只, 小鼠右腋部皮下接种。接种24h 后, 分别对6组小鼠进行腹腔注射给药。分别为HPS4、HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A组, 阳性组给环磷酰胺30mg/ （kg??d）, 模型对照组给相同体积的生理盐水，连续给药10d， 停药次日处死, 称取小鼠瘤重，测抑瘤率。
4.2.2.结果计算：
抑瘤率=（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%
如表1所示，红芪多糖对S180小鼠表现出不同的抑瘤作用。与模型组比较, 红芪多糖4及红芪多糖4中3个组分都表现出良好的抑瘤效果, 有显著性差异(p<0.05), HPS4-2A组(p<0.01)。本实验表明红芪多糖4及红芪多糖4中3个组分在小鼠体内对S180 肉瘤的生长有一定的抑制作用,且能明显增加S180 荷瘤小鼠T 淋巴细胞百分数, 说明HPS4、HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A作为生物诱导剂, 能够增强荷瘤小鼠的免疫功能而达到抗肿瘤的效果。
五、红芪多糖4及红芪多糖4中3个组分体外抗氧化作用的研究。
5.1. 实验材料
邻二氮菲、FeSO4溶液、pH=7.4的磷酸缓冲液、过氧化氢。
5.2. 实验方法
采用羟基自由基清除能力测定方法。
分别精密移取0.5mL红芪多糖样品（0～1 mg /mL），置6只同等规格的玻璃试管中，加入0.4mL磷酸缓冲盐（50mmol /L，pH=7.4）、0.25mL蒸馏水、0.15mL邻二氮菲（5mmol/L）、0.5mLFeSO4（7.5mmol/L）、0.1mLH2O2（326.3mmol/L），混匀。在37℃水浴保温60min，然后在536nm测定其吸光度值。以维生素C作为阳性对照，并以下式计算百分清除率:
百分清除率（%）= (A1- A2)/( A3- A2)×100%
上式中，A1（样品+磷酸缓冲盐+蒸馏水+邻二氮菲+FeSO4+ H2O2），A2(蒸馏水+磷酸缓冲盐+蒸馏水+邻二氮菲+FeSO4+ H2O2)， A3表示（蒸馏水+磷酸缓冲盐+蒸馏水+邻二氮菲+FeSO4+ 蒸馏水）。
结果见图10，HPS4 、HPS4-2A、HPS4-1A、HPS4-1B可随浓度的增加有效地将Fenton反应产生的羟基自由基清除；在测定的最大浓度8mg/mL，HPS4 、HPS4-2A、HPS4-1A和HPS4-1B对羟基自由基的百分清除率分别为74.8%、66.93%、56.69%和51.97% ，其中HPS4的清除率最高，仅次于阳性对照维生素C的87.01%。本实验表明HPS4 、HPS4-2A、HPS4-1A和HPS4-1B都具有较好的抗氧化作用。
六、红芪多糖4及4中3个组分的抗衰老作用的研究
6.1. 材料
HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-1A、HPS-4、60只昆明小鼠，体质量（20.0± 2.0g），雌雄各半。在室温正常光线下自由饮食水,适应性喂养1周后随机分为6组，即正常对照组、衰老模型组，HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-1A、HPS-4四个治疗组，每组10 只，雌雄各半。D-半乳糖、超氧化物歧化酶、丙二醛试剂盒,谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px)测试盒。
6.2. 给药
昆明小鼠分为6组，除正常对照组外，衰老模型组和红芪多糖4中3个组分及红芪多糖4组每只颈背部皮下注射50g/LD-半乳糖 0.5mL，进行造模。正常对照组颈背部皮下注射同等剂量生理盐水 。造模完成后，正常对照组和衰老模型组每只腹腔注射生理盐水0.5mL；治疗组每天1次腹腔注射给药红芪多糖，连续6周。
6.3. 实验指标测定
小鼠血中实验指标测定：血清中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量，小鼠全血中谷胱甘肽过氧化物酶的活力。 6 周后，麻醉下将小鼠摘除眼球取血，一部分常规分离血清，在4 ℃下3000r/min 离心5min，取上清液待测；另一部分全血待测。
超氧化物歧化酶活性，丙二醛含量，谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px)测定严格按试剂盒操作程序进行。
6.4.统计学分析
统计处理数据采用SPSS10.0 统计学软件处理，多组间差异的显著性检验使用方差分析和两组比较用t 检验，结果见表2。
与对照组比较， P*<0. 05；与 衰老模型组PΔ<0. 05。
如表2所示，衰老模型组与正常对照组比较，小鼠血清中超氧化物歧化酶活性显著降低，丙二醛含量显著升高（P < 0. 05），表明衰老模型成功建立。HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、HPS-4治疗组与模型组比较，小鼠血清中超氧化物歧化酶活性均显著升高，丙二醛含量均显著降低，全血中谷胱甘肽过氧化物酶活性均明显升高（P < 0. 05或P < 0. 01），具有统计学意义。
本实验结果表明，红芪多糖4及4中3个组分具有抗衰老作用。
七、HPS 4及HPS 4中3个组分降血糖作用的研究
7.1. HPS4及4中3个组分对实验性大鼠2型糖尿病的降血糖作用
7.1.1. 实验动物
Wistar大鼠，SPF级，体重180～220g，♀，实验动物使用许可证号：SCXK(甘)2004-0006)由甘肃中医学院科研实验中心提供。
7.1.2. 药品及试剂
格华止盐酸二甲双胍片（批号：0906066），由中美上海施贵宝制药有限公司提供；ACCU-CHEK
Active型血糖试纸（批号：22967331），由德国ROCHE公司提供。
7.1.3. 动物造模及给药
取7～8周龄雌性wistar大鼠90只，按体重随机选取10只作为空白对照，用基础饲料喂养。其余80只饲以高脂高糖饲料喂养4周，一次性按30 mg/kg注射链脲佐菌素（STZ），继续饲以高脂高糖饲料4周制作实验性2型糖尿病模型。8周后选取空腹血糖≥11.l mmoL/L的大鼠60只，按体重随机分为2型糖尿病模型组、HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、HPS4 四个治疗组（100mg/kg·d）及二甲双胍组（100 mg/kg·d）。空白对照组及2型糖尿病模型组给予量生理盐水。以上各组均灌胃给药，连续给药5周后取血，用血糖测试仪测大鼠血糖，结果以mmol/L计。
7.1.4. 统计学处理
以SPSS 15.0 处理数据,采用重复测量方差分析( P < 0.05) ,所有数据以x ±s表示。结果见表3。
注：与空白组对比 *P<0.05 与模型组对比 △P<0.05 与MET组对比，☆P<0.05
由表3可见，实验性2型糖尿病大鼠模型组血糖值很高，说明成功制备了大鼠糖尿病模型。HPS4-1A、HPS4- 1B、HPS4-2A、HPS4组和二甲双胍（MET）组的血糖值均较低，与模型组比较具有统计学意义（P<0.05）。说明HPS4-1A、HPS4-1 B、HPS4-2A、HPS4具有降血糖作用。另外，在实验过程中还观察到红芪多糖中4个给药组均可明显改善糖尿病大鼠“三多一少”症状及大鼠的精神状态。表明 HPS4-1A、 HPS4-1 B、HPS4-2A、HPS4在降低2型糖尿病大鼠血糖的同时，还通过调节大鼠机体免疫功能，在整体上改善糖尿病大鼠的生存质量。
八、红芪多糖4及4中3个组分降血脂作用的研究
8.1 实验试剂与仪器
8.1.1.实验药品与试剂
HPS4-1A、 HPS4-1 B、HPS4-2A、HPS4均配制成7.5g/L溶液，置于4℃条件下保存;
总胆固醇试剂盒中生北控生物科技股份有限公司;
甘油三脂试剂盒中生北控生物科技股份有限公司;
高密度脂蛋白胆固醇试剂盒中生北控生物科技股份有限公司;
格华止盐酸二甲双胍片(批号：0706066)
8.1.2 实验仪器及实验动物
雅培Abbott Alcyon 300全自动生化分析仪。Wistar大鼠，SPF级，体重180～220g，♀，实验动物使用许可证号：SCXK(甘)2004-0006)由甘肃中医学院科研实验中心提供。
8.1.3 剂量选择及饲喂
HPS4-1A、 HPS4-1 B、HPS4-2A、HPS4剂量均为0.075g/kg.bw，每日一次经口给予，连续灌胃30天后测各项指标。正常对照组和模型组给予同体积的生理盐水水。阳性对照为二甲双胍组。高脂饲料配方为:7.88%基础饲料、1%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油、0.02%胆盐。
8.2.实验方法
8.2.1.大鼠的分组及饲养
在实验环境下，大鼠喂饲基础饲料，观察10天。禁食16小时，取血测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。根据基础值水平随机分为：空白组、高脂对照组（模型组）、二甲双胍组、HPS4-1A、 HPS4-1 B、HPS4-2A、HPS4七个组。
采用预防性高脂动物模型实验方法。HPS4-1A、 HPS4-1 B、HPS4-2A、HPS4及二甲双胍组在给予高脂饲料的同时灌胃给药相同剂量的药物；正常对照组给予正常饲料，高脂对照组给予高脂饲料的同时灌胃相应体积的生理盐水。给受试物30天后，禁食16小时，测定各组大鼠血清总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇。
8.2.2. 血清总胆固醇测定方法
大鼠股动脉采血，收集血清用雅培Abbott Alcyon 300全自动生化分析仪进行测定，结果以mol–/L表示。
8.2.3 实验数据处理:
实验数据用统计软件SPSS软件进行方差分析统计，结果见表4。
注：与空白组对比 *P<0.05 与模型组对比 △P<0.05 与MET组对比 ☆P＞0.05
由表4可见，实验性2型糖尿病大鼠模型血脂代谢异常表现在TC、TG含量增加，而HDL-C含量降低，LDL-C含量升高。HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、HPS4改善了糖尿病大鼠血脂代谢异常:(1)降低了血浆中TC、TG的含量。与2型糖尿病模型组比较，均有统计学意义(p<0.05)。(2)使HDL-C的含量增高(P＞0.05)；使LDL-C的含量降低，与模型组比较，给药组各剂量组均具有统计学意义(p<0.05)。HPS4改善2型糖尿病大鼠模型高血糖的同时也改善了血脂代谢异常。
本实验结果表明HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、HPS4具有预防和降低高血脂症的作用。
九．红芪多糖4及4中3个组分增强免疫力功能研究
9.1. 材料和方法
9.1.1. 材料
HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、HPS4均配制成7.5g/L溶液，置于4℃条件下保存。
9.1.2. 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取昆明种小鼠50只, 体重19-21g, 雌雄各半, 随机分为对照和实验组。给药组灌胃给予浓度均为7.5g/L 的HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、HPS4,对照组给予生理盐水。灌胃容积100mg/kg体重。 每天1次, 连续给药14天。停药当天每只小鼠腹腔注入5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.5mL，20小时后处死动物。注射2.5mLHank液冲洗腹腔, 取0.2mL冲洗液滴于载玻片上,37℃ 温孵30分钟。用生理盐水冲去未贴壁的细胞, 甲醇固定, 姬-瑞氏混合染液染色。镜下计数100个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的细胞数, 计算吞噬百分率, 并按下式计算吞噬指数。
吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/100个巨噬细胞
9.1.3.实验数据处理:
实验数据用统计软件SPSS软件进行方差分析统计，结果见表5。
与对照组比较 *P<0.05 **P<0.01
表5表明，小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能增强, 吞噬率由对照组28%增加至64%。本实验表明HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、HPS4可增加机体非特异性免疫功能。
十．红芪多糖4及4中3个组分抗辐射功能研究
10.1. 实验材料
健康昆明种雄性小鼠，20 ± 2g，鼠龄6～7周，由兰州大学GLP实验动物中心提供，共90只×2批，每组15只，随机分为6组，空白组(不照射不给药)，实验对照组(照射模型组，只照射不给药)，HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、HPS4组（100mg/kg）。
10.2. 实验方法
10.2.1.照射条件
以6MHz X射线辐射源（由兰州市陆军总院提供）对小鼠进行一次性全身照射，吸收剂量率为1.0 Gy/min，吸收剂量为8Gy，源距为50cm，观察小鼠存活率；吸收剂量率为1.0 Gy/min，吸收剂量为4Gy，源距为50cm，小鼠进行一次性全身照射观察对小鼠造血功能的影响。
10.2.2.动物存活率测定
雄性健康小鼠90只，于实验室适应性喂养三天后，随机分为6组，每组15只。正常对照组和辐射对照组给予等量生理盐水，均于早晨空腹灌胃，每日1次，每次0.5mL，每两天称体重，根据体重调整给药量，期间动物自由摄食和饮水。各组连续灌胃10d后进行X射线源照射，辐射后继续灌胃10d，观察照射后30d存活率及存活时间。
10.2.3.外周血细胞数、胸腺脾脏指数测定
健康雄性小鼠90只，于实验室适应性喂养三天后，随机分为6组，每组15只。空白组和辐射对照组给予等量蒸馏水，均于早晨空腹灌胃，每日1次，每次0.5mL，每天称体重，记录并根据体重调整给药量，期间动物自由摄食和饮水。各组连续灌胃10d后进行X射线照射，于照射前、照射后第2、5、7、11、16d，分别剪尾尖采血，加稀释液后用自动血球分析仪（日本Sysmex，KX-21N）测外周血白细胞和淋巴细胞数。
10.2.4 统计学处理
数据以均数±标准差（X±S）表示，组间差异显著性采用t检验，采用SPSS统计软件，应用LSD法进行两两比较。外周血细胞数用方差分析，显著性（p<0.01，0.05）作为有效依据。结果见表6。
＊与照射模型组相比P＜0.05，＊＊与照射模型组相比P＜0.01。
各组鼠（除空白组）在射线照射后当天，小鼠食欲下降活动减少，体重皆下降，陆续出现精神萎靡不振，耳廓及尾部苍白，部分小鼠耳廓出现血斑，照射组更为明显。但随着时间的推移小鼠渐渐恢复活力，HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、HPS4组恢复较快，两周左右；小鼠毛色有光泽且较浓密，较少出现皮毛稀疏松散现象。辐照后，照射组小鼠开始出现被毛蓬乱，稀疏无光泽，采食量下降，从第8天开始陆续死亡。照射组与实验组相比，死亡时间较早，死亡数较多。从表6中可以看出，HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、HPS4组均能提高辐照小鼠的存活率。HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、HPS4量组与照射组比较，死亡鼠平均存活时间均延长。
存活率和存活时间是反映抗辐射作用的最基本最客观的指标，因为抗辐射的最终目的就是为了提高存活率和延长存活时间。实验结果表明HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、HPS4组对X-照射小鼠具有良好的抗辐射效果，可以增加小鼠的体重、平均存活时间和30d存活率，即HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、HPS4对X-射线照射小鼠有保护作用。
＊与照射模型组相比，P＜0.05，＊＊与照射模型组相比，P＜0.01
由表7可见，各给药组在第16天与模型组比较均能显著提高辐照小鼠白细胞数量和外周血淋巴细胞数量。白细胞数与外周血白细胞数的变化基本一致。本实验结果表明，HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A、HPS4均对X-射线诱发的辐射损伤有较好的保护作用。
十一、红芪多糖4及4中3个组分的体外抗凝血作用
11.1. 实验材料
枸橼酸钠（分析纯），大白兔:新西兰种系,购于兰州大学大学实验动物房,体重范围3 kg ±10 g。活化部分凝血活酶时间 ( activated partial thrombop lastin time,APTT) 、凝血酶原时间 (p rothrombin time, PT)和凝血酶时间 ( thrombin time, TT)检测试剂盒均为德国西门子有限公司产品。
11.2. 实验方法
凝血酶原时间(Prothrombin Time , PT) 、凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time ,APTT)、凝血酶时间(Thrbomin Time ,TT)的测定。血浆制备采用心脏穿刺法从大白兔心脏取血,将新鲜血液置于含1/10 体积的0. 109 mol/L 枸橼酸钠抗凝液(1份抗凝液+9份全血) 的塑料管中,轻轻颠倒混匀,3000r/ min 离心15 min ,收集上层去血小板血浆。在37 ℃下预热PT试剂、TT试剂，APTT 试剂以及0. 025mol/LCaCl2。取270μL 的去血小板血浆与30μL不同浓度多糖(空白对照用生理盐水代替) 加入到塑料管中。置希森美康（SYSMEX CA7000）全自动凝血仪中分析血浆凝血时间。结果见表8。
注：*表示与空白对照组相比较P<0.01。
由表8可知组分HPS4-2A、HPS4-1A、HPS4-1B与HPS4当浓度大于等于2mg/mL时，可显著的延长APTT、PT与TT（P<0.01）。其中以HPS4-2A对APTT、PT与TT的延长效果最好，并具有一定的浓度依赖性。当HPS4-2A的浓度增大至8mg/mL时，可使APTT、PT与TT分别延长至120s、21s与130s。凝血过程是一系列酶促作用的结果, 包括内源性、外源性凝血系统的共同途径。APTT 、TT和PT是各自独立的基础性凝血途径筛查指标,APTT和TT反映内源性凝血系统的活性, PT反映外源性凝血途径的指标。红芪多糖4及4中3个组分为8mg/mL时可显著延长APTT和PT时间, 说明红芪多糖4及4中3个组分对内源性和外源性凝血途径均具有较好的抑制作用。
本发明的有益效果：
本发明制备的红芪多糖4及其有效成分具有抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、提高机体免疫力、抗辐射的作用，且效果明显。本发明所提出的红芪多糖4及其有效成分的制备方法具有简单、提取率高、易操作的优点。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1 为HPS4-1、AHPS4-1B、HPS4-2A凝胶高校液相色谱图，示差折光检测器；
图2为 HPS4-1A均方根半径对摩尔质量图；
图3 为HPS4-1B均方根半径对摩尔质量图；
图4 为HPS4-2A均方根半径对摩尔质量图；
图5为混合单糖标准品的气相色谱图；
图6 为HPS4-1A的气相色谱图；
图7 为HPS4-1B的气相色谱图；
图8 为HPS4-2A GC-MS总离子流图；
图9 为GC-MS混合标准品总离子流图；
图10红芪多糖HPS4 、HPS4-2A、HPS4-1A和HPS4-1B对羟基自由基百分清除率。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
1.红芪多糖4及其有效成分的提取
提取实验一：
（1）红芪药材粉碎后，5倍水量在40℃下浸泡1次，每次1h；合并浸泡液，浓缩至比重为1.01；浓缩液用终浓度为20%乙醇沉淀，过滤，得沉淀；取上述沉淀复溶于水中，再用终浓度为20%乙醇沉淀，取上清液，浓缩，干燥，得红芪粗多糖；
（2）红芪粗多糖经Sevag法脱蛋白或不脱蛋白，双氧水脱色或不脱色素，得红芪多糖4，红芪多糖4溶液浓缩至多糖含量为0.1mg /mL或溶解于水，先用终浓度为20%乙醇沉淀1次，再用终浓度为20%乙醇沉淀1次，取沉淀，干燥，得红芪多糖4-1和红芪多糖4-2；
（3）红芪多糖4-1经Sephadex G-200柱色谱，以0.05 mol·L-1 的NaAc-HAc缓冲液洗脱，洗脱溶液的pH值保持4.0，苯酚-硫酸法示踪，得到两个均一组分：红芪多糖4-1A、红芪多糖4-1B；红芪多糖4-2经DEAE-52柱色谱，以0.1 mol·L-1的NaCl梯度洗脱得到一个均一组分红芪多糖4-2A。
提取实验二：
（1）红芪药材粉碎后， 20倍水量在100℃下浸泡5次，每次3h；合并浸泡液，浓缩至比重为1.30；浓缩液用终浓度为85%乙醇沉淀，过滤，得沉淀；取上述沉淀复溶于水中，再用终浓度为85%乙醇沉淀，取上清液，浓缩，干燥，得红芪粗多糖；
（2）红芪粗多糖经Sevag法脱蛋白或不脱蛋白，双氧水脱色或不脱色素，得红芪多糖4，红芪多糖4溶液浓缩至多糖含量为2mg /mL或溶解于水，先用终浓度为85%乙醇沉淀5次，再用终浓度为85%乙醇沉淀5次，取沉淀，干燥，得红芪多糖4-1和红芪多糖4-2；
（3）红芪多糖4-1经Sephadex G-200柱色谱，以0.05 mol·L-1 的NaAc-HAc缓冲液洗脱，洗脱溶液的pH值保持8.0，苯酚-硫酸法示踪，得到两个均一组分：红芪多糖4-1A、红芪多糖4-1B；红芪多糖4-2经DEAE-52柱色谱，以2.0 mol·L-1的NaCl梯度洗脱得到一个均一组分红芪多糖4-2A。
提取实验三：
（1）红芪药材粉碎后，12倍水量在70℃下浸泡3次，每次2h；合并浸泡液，浓缩至比重为1.15；浓缩液用终浓度为52%乙醇沉淀，过滤，得沉淀；取上述沉淀复溶于水中，再用终浓度为52%乙醇沉淀，取上清液，浓缩，干燥，得红芪粗多糖；
（2）红芪粗多糖经Sevag法脱蛋白或不脱蛋白，双氧水脱色或不脱色素，得红芪多糖4，红芪多糖4溶液浓缩至多糖含量为1mg /mL或溶解于水，先用终浓度为52%乙醇沉淀3次，再用终浓度为52%乙醇沉淀3次，取沉淀，干燥，得红芪多糖4-1和红芪多糖4-2；
（3）红芪多糖4-1经Sephadex G-200柱色谱，以0.05 mol·L-1 的NaAc-HAc缓冲液洗脱，洗脱溶液的pH值保持6.0，苯酚-硫酸法示踪，得到两个均一组分：红芪多糖4-1A、红芪多糖4-1B；红芪多糖4-2经DEAE-52柱色谱，以1.0 mol·L-1的NaCl梯度洗脱得到一个均一组分红芪多糖4-2A。
2.红芪多糖3中4个组分的构象分析
经HPGPC鉴定，HPS4-2A、HPS4-1A和HPS4-1B均为均一组分，采用Ultrahydrogel 1000、500色谱柱串联凝胶色谱，流动相为含0.02%NaN3的0.154M NaCl溶液，流速为0.8mL/min，柱温：35℃；MALLS的光源气体为氦气和氖气，波长：690nm。流动相的折光指数取1.330，多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)为0.138,校准激光的仪器常数为8.1104×10-6 (V cm)-1，校准示差折光检测器仪器常数为2.2697×10-4 (V cm)-1。
精密称取样品HPS4-1A,HPS4-1B, HPS4-2A，用流动相配制成30mg/mL溶液 ，经0.45μm滤膜过滤，进样量50μL，进行GPC-MALLS分析，用含0.02%NaN3的0.154M NaCl溶液为流动相，样品在溶液中处于完全溶解状态。
经GPC-MALLS分析，HPS4-1A构象为无规线团，重均分子量Mw为20～73.86kDa，均方根旋转半径Rg为20～50nm ，多分散系数Mw/Mn为1.000～1.300；HPS4-1B构象为无规线团构象，Mw为20～50.23KDa，Rg为15～30nm，Mw/Mn为1.005～1.410； HPS4-2A构象为高度分支结构，Mw为15～272kDa, Rg为18～30.5 nm, Mw/Mn为1～1.633。
3.红芪多糖4中3个组分的单糖组成
3.1. HPS4-1A和HPS4-1B的单糖组成分析
色谱柱为OV-101柱；进样口温度，210 ℃；检测器温度，260 ℃；载气压力：0.5 Mpa；程序升温：起始温度175℃，以15 ℃/min的速度升至225 ℃，保持5 min，然后以5 ℃/min的速度升至250℃，保持1.5 min。
通过与标准单糖糖腈乙酸酯衍生物色谱图对照，结合色谱峰面积归一化法测定样品中单糖的组成和摩尔比例， HPS4-1A单糖组成及摩尔比例为：鼠李糖（Rha）:阿拉伯糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）=1～100:2～100:1～100:2～100； HPS4-1B单糖组成及摩尔比例为：鼠李糖（Rha）:阿拉伯糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）= 10～100:10～100:15～100:13～100。
3.2. HPS4-2A单糖组成的分析
质谱条件：离子源温度：200℃；接口温度：250℃；溶剂延迟：4min；阈值：1000；起始时间（min）：4.50；结束时间（min）：29.00；采集方式：Scan；质谱检测范围（m/z）：33.00～630.00。
气相色谱条件：程序升温：起始温度150℃，以5 ℃/min的速度升至170 ℃，然后以8 ℃/min的速度升至250℃，保持1 min，再以15℃/min升至250℃，然后保持5min。
通过与标准单糖糖腈乙酸酯衍生物色谱图对照，结合色谱峰面积归一化法测定样品中单糖的组成和摩尔比，HPS4-2A的单糖组成及摩尔比例为：鼠李糖（Rha）:阿拉伯糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）：2-乙酰氨基半乳糖（2-NAc-Gal）=10～100:20～200:20～200:20～100:10～100。
3.3. 糖醛酸的确定
3.3.1.气相色谱法
色谱柱为OV-101柱；进样口温度：210℃；检测器温度：280℃；程序升温：起始温度160℃，以以5 ℃/min的速度升至190 ℃，保持4min。然后以3 ℃/min的速度升至210℃，保持15 min，再以10℃/min升至260℃，然后保持15min。
3.3.2. 硫酸-咔唑法
称取多糖样品6.0 mg溶于5 mL容量瓶中。分别取此溶液0.1 mL，0.3 mL，0.5 mL于具塞试管中定容至1 mL，置于冰水浴中，加入浓硫酸6mL，振摇，85℃水浴中保持20 min，取出后冷却至室温，分别加0.2 mL0.1%咔唑乙醇液，室温下保持2 h，于530 nm处测定吸光度A。
经上述两种方法判断HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A均不含糖醛酸。
4.红芪多糖4中3个组分的多糖部分化学结构研究
采用部分酸水解、甲基化结合气-质联用以及NMR技术研究了红芪多糖4中3个组分多糖部分的结构。HPS4-1A、HPS4-1B和 HPS4-2A的结构特征如下所述：
红芪多糖HPS4-1A主链骨架由1,5、1,3,5-α-L-Araf和1,6、1,2,6-α- D-Galp组成，侧链分支点位于阿拉伯糖的3位与半乳糖的2位。侧链分支由1,4、1,4,6-α- D-Glcp，1,2、1,2,4-α-L-Rhap组成。主链非还原末端连接主要是阿拉伯糖。
红芪多糖HPS4-1B以1,4-α-D-Glcp与1,6-α-D-Galp组成主链骨架。侧链分支由1,6-α-D-Galp、1,2-α-L-Rhap、1-α-D-Glcp与1-α-L-Araf组成。侧链分支位于葡萄糖的6位。每10～13个糖残基有1个硫酸基，硫酸基可能存在于侧链1,4-α-D-Glcp的O-6位；
红芪多糖HPS4-2A以1,3,4-β-D-2-乙酰氨基半乳糖、1,4,6-α-D-葡萄糖、1,4,6-β-D-半乳糖以及1,3,6-β-D-半乳糖组成主链，支链主要由1,5-α-L-Ara与1,2-α-L-Rha组成，另外还有非还原末端 1- α-D-Glcp以及1-α-L-Araf，支链分支点分别位于2-乙酰氨基半乳糖的4位，葡萄糖的4位以及半乳糖的3、6位。每27～32个糖残基有1个硫酸基，硫酸基存在于侧链R1位；
5.红芪多糖4胶囊制备
红芪药材粉碎后，5～20倍水量在40～100℃下浸泡1～5次，每次1～3h。合并浸泡液，浓缩比重为1.01～1.30。浓缩液首先用终浓度为20～85%乙醇沉淀，过滤，得沉淀；取上述沉淀复溶于水中，再用终浓度为20%～85%乙醇沉淀，取上清液，浓缩，干燥，加60%～95%乙醇制颗粒，装1号胶囊（装量为0.1g～1.0g）。
6. 红芪多糖4饮料制备
红芪药材粉碎后，5～20倍水量在40～100℃下浸泡1～5次，每次1～3h。合并浸泡液，将浸泡液浓缩为每1mL液体相当于0.01～1g红芪药材的浸膏，向浸膏中加甜味剂和矫味剂，制成饮料。
7.HPS4-2A、HPS4-1A、HPS4-1B制剂的制备
HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A粉，加药物制剂常用的润滑剂、崩解剂，压片，制片剂。
HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A粉，加药物制剂常用的润湿剂、稀释剂，制颗粒剂。
HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A粉，加药物制剂常用的润湿剂、稀释剂，制颗粒，装1号胶囊（装量为0.1g～1.0g）。
HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A粉，加注射用水使浓度达每mL含0.01mg～10mgHPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-2A，封装于安瓶中，每瓶1mL～5mL,高压灭菌，制成灭菌注射剂，用于肌肉注射或静脉注射。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.红芪多糖4及其有效成分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）红芪药材粉碎后，5～20倍水量在40～100℃下浸泡1～5次，每次1～3h；合并浸泡液，浓缩至比重为1.01～1.30；浓缩液用终浓度为20～85%乙醇沉淀，过滤，得沉淀；取上述沉淀复溶于水中，再用终浓度为20%～85%乙醇沉淀，取上清液，浓缩，干燥，得红芪粗多糖；
（2）红芪粗多糖经Sevag法脱蛋白或不脱蛋白，双氧水脱色或不脱色素，得红芪多糖4，红芪多糖4溶液浓缩至多糖含量为0.1~2mg /mL或溶解于水，先用终浓度为20%～85%乙醇沉淀1～5次，再用终浓度为20%～85%乙醇沉淀1～5次，取沉淀，干燥，得红芪多糖4-1和红芪多糖4-2；
（3）红芪多糖4-1经Sephadex G-200柱色谱，以0.05 mol·L-1 的NaAc-HAc缓冲液洗脱，洗脱溶液的pH值保持4.0～8.0，苯酚-硫酸法示踪，得到两个均一组分：红芪多糖4-1A、红芪多糖4-1B；红芪多糖4-2经DEAE-52柱色谱，以0～2.0 mol·L-1的NaCl梯度洗脱得到一个均一组分红芪多糖4-2A。
2.根据权利要求1所述的红芪多糖4及其有效成分的制备方法，其特征在于，所述红芪多糖4-1A具有以下结构式Ⅰ：
其中，n=5~40。
3.根据权利要求1所述的红芪多糖4及其有效成分的制备方法，其特征在于，所述红芪多糖4-1B具有以下结构式Ⅱ：
其中，n=10~50。
4.根据权利要求1所述的红芪多糖4及其有效成分的制备方法，其特征在于，所述红芪多糖4-2A具有以下结构式Ⅲ：
其中，n=3~100。
5.红芪多糖4、红芪多糖4-1A、红芪多糖4-1B、红芪多糖4-2A中的一种或几种组合物在制备抗肿瘤药物、抗凝血药物、抗氧化药物、抗衰老药物、降血糖药物、降血脂药物、提高机体免疫力药物、抗辐射药物中的应用。
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