CN100437109C - 一种治疗肿瘤的注射液的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗肿瘤的注射液的质量控制方法，该注射液是以如下重量份的原料药制成的：黄芪200～400重量份、人参60～130重量份、苦参素6～13重量份。本发明注射液质量控制方法包括对该注射液中间体、成品的指纹图谱质量控制方法以及对该注射液的鉴别和/或含量测定方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种注射液的质量控制方法，特别涉及一种治疗肿瘤的注射液的质量控制方法。
背景技术
中药质量控制是中药现代化进程中亟待解决的关键问题之一。目前指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段之一。通过现代分析手段，用指纹图谱特征可反映出中药的内在化学成分及其含量。按应用对象，可分为中药材(原料药材)指纹图谱、中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱、中间体(中间产物)指纹图谱以及中药制剂指纹图谱。中药指纹图谱是推动中药行业全面进步的关键技术之一，其应用研究，对保证中成药功效，提高中药行业整体水平，促进中药农业现代化，推动中药走向世界，具有重要的现实意义。申请号为021533350的发明专利公开了一种治疗肿瘤的药物组合物及其制备方法，该药物组合物是以黄芪200-400重量份人参60-130重量份苦参素6-13重量份为原料药制成，但并没有提供该药物组合物的指纹图谱，因此在保证该药物成分含量及功效方面尚须进一步提高。
发明内容
本发明目的在于提供一种治疗肿瘤的中药注射液的质量控制方法，本发明的另一目的在于提供该注射液中间体的指纹图谱测定方法，本发明的目的还在于提供该注射液成品的指纹图谱测定方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的。
本发明注射液是由如下重量份的原料药制成的：黄芪200-400重量份、人参60-130重量份、苦参素6-13重量份；
优选黄芪250重量份、人参120重量份、苦参素8重量份；黄芪350重量份、人参70重量份、苦参素12重量份；或黄芪300重量份、人参100重量份、苦参素10重量份。
本发明注射液中间体的制备方法为：
称取以上三味原料药，人参用70-80％的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，备用；黄芪加水煎煮2～3次，每次1～3小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达60～80％，用氢氧化钠调PH值至6～7，静置，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15的清膏，测定温度为65℃；再加乙醇使含醇量达70～90％，用氢氧化钠调值PH至6～7，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400体积份(按ml/g的比例)，用氢氧化钠调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤；用氢氧化钠调PH值至6～7，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，即得中间体。
本发明注射液的制备方法为：
称取以上三味原料药，人参用70-80％的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，备用；黄芪加水煎煮2～3次，每次1～3小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达60～80％，用氢氧化钠调PH值至6～7，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15的清膏，测定温度为65℃；再加乙醇使含醇量达70～90％，用氢氧化钠调值PH至6～7，静置12小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400体积份(按ml/g的比例)，用氢氧化钠调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤；用氢氧化钠调PH值至6～7，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，加注射用水至1000体积份(按ml/g的比例)，滤过，灌装，即得。
本发明注射液优选按如下方法制备：称取以上三味原料药，人参用75％的乙醇，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，备用；黄芪加水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达75％，用氢氧化钠调PH值至6～7，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15的清膏，测定温度为65℃；再加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调值PH至6～7，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400体积份(按ml/g的比例)，用氢氧化钠调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤。用氢氧化钠调PH值至6～7，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，加注射用水至1000体积份(按ml/g的比例)，滤过，灌装，即得。
本发明注射液的质量控制方法包括如下鉴别、含量测定方法和/或指纹图谱测定方法：
本发明注射液的鉴别方法包括下列步骤：
取本品10ml，加水至30ml，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以10-14∶5-8∶1-3的氯仿-甲醇-水10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点，365nm紫外光灯下显相同的橙黄色荧光斑点。
本发明注射液的含量测定方法包括如下两种方法中的一种或两种：
A.人参：照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定；
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；20-25∶75-80∶1-3的乙腈∶水∶三氟醋酸为流动相，检测波长为203nm；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1和Re对照品适量，分别加甲醇制成每1ml各含0.04mg的溶液，即得对照品溶液；
供试品溶液的制备：取本品，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；本品每1ml含人参以人参皂苷Rg1(C42H72O14)和Re(C48H82O18)的总量计，不得少于0.04mg。
B.苦参素：照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；90-95∶5-10的1％磷酸溶液-乙腈为流动相，其中磷酸溶液用三乙胺调节pH值为2.5，检测波长为220nm；理论板数按氧化苦参碱峰计算应不低于2000，氧化苦参碱峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求；
对照品溶液的制备：称取氧化苦参碱对照品适量，加流动相制成每1ml中含0.25mg的溶液，即得对照品溶液；
供试品溶液制备：量取本品2.5ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
测定法：量取对照品溶液及供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算；本品每1ml含苦参碱素以氧化苦参碱(C15H24N2O2)计，应为9.0mg～11.0mg。
本发明注射液的指纹图谱测定包括对本发明注射液中间体以及成品的指纹图谱测定方法。
本发明注射液中间体指纹图谱检测方法包括下列步骤：
照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)；
色谱条件及系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以pH值4.5、0.02mol/L的磷酸二氢钾溶液为流动相A，以80％乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min流动相B体积比为25％、流动相A体积比为75％，5～20min流动相B体积比由25％线性上升到39％、流动相A体积比由75％线性下降到61％，20～35min流动相B体积比由39％线性上升到49％、流动相A体积比由61％线性下降到51％，35～55min流动相B体积比由49％线性上升到85％、流动相A体积比由51％线性下降到15％，55～65min流动相B体积比为85％、流动相A体积比为15％，65～72min流动相B体积比由85％线性下降到25％、流动相A体积比由15％线性上升到75％；检测波长203nm；柱温35℃；流速1ml/min；
参照物溶液的制备：称取人参皂苷Rg1对照品约3.0mg，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得；
供试品溶液的制备：取200μl中间体，用水稀释至5ml，作为供试品溶液；HPLC分析前用0.45μm水系滤膜过滤；
测定法：分别取各批中间体供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录70min色谱；
供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱(见附图1)有良好的相似性；
指纹图谱应有21个共有峰；
各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：0.621(1号峰)、0.816(2号峰)、0.846(3号峰)、0.895(4号峰)、1.000(S峰)、1.062(5号峰)、1.105(6号峰)、1.367(7号峰)、1.460(8号峰)、1.483(9号峰)、1.559(10号峰)、1.638(11号峰)、1.718(12号峰)、1.801(13号峰)、1.825(14号峰)、1.921(15号峰)、1.996(16号峰)、2.451(17号峰)、2.574(18号峰)、3.089(19号峰)、3.399(20号峰)；
各序号特征峰的峰面积比值分别为：0.115(1号峰)、0.130(2号峰)、0.746(3号峰)、0.251(4号峰)、1.000(S峰)、0.418(5号峰)、0.538(6号峰)、0.158(7号峰)、0.089(8号峰)、0.120(9号峰)、0.248(10号峰)、0.077(11号峰)、0.078(12号峰)、0.301(13号峰)、0.124(14号峰)、0.326(15号峰)、0.531(16号峰)、0.074(17号峰)、0.091(18号峰)、0.301(19号峰)、0.190(20号峰)；
非共有峰面积不得过总峰面积的5％。
本发明注射液成品指纹图谱检测方法包括下列步骤：
照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)；
色谱条件及系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以pH值4.5、0.02mol/L的磷酸二氢钾溶液为流动相A，以80％乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min流动相B体积比为25％、流动相A体积比为75％，5～20min流动相B体积比由25％线性上升到39％、流动相A体积比由75％线性下降到61％，20～35min流动相B体积比由39％线性上升到49％、流动相A体积比由61％线性下降到51％，35～55min流动相B体积比由49％线性上升到85％、流动相A体积比由51％线性下降到15％，55～65min流动相B体积比为85％、流动相A体积比为15％，65～72min流动相B体积比由85％线性下降到25％、流动相A体积比由15％线性上升到75％；检测波长203nm；柱温35℃；流速1ml/min；
参照物溶液的制备：称取人参皂苷Rg1对照品约3.0mg，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得；
供试品溶液的制备：成品直接作为供试品溶液；
测定法：分别取各批成品供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录70min色谱；
供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱(见附图2)有良好的相似性；
指纹图谱应有17个共有峰；
各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：0.844(1号峰)、0.857(2号峰)、0.904(3号峰)、1.000(S峰)、1.061(4号峰)、1.096(5号峰)、1.364(6号峰)、1.457(7号峰)、1.491(8号峰)、1.567(9号峰)、1.645(10号峰)、1.721(11号峰)、1.873(12号峰)、1.947(13号峰)、2.360(14号峰)、2.463(15号峰)、3.259(16号峰)；
各序号特征峰的峰面积比值分别为：0.122(1号峰)、0.733±25％(2号峰)、0.272±30％(3号峰)、1.000(S峰)、0.496±25％(4号峰)、0.226(5号峰)、0.120(6号峰)、0.083(7号峰)、0.170(8号峰)、0.169(9号峰)、0.128(10号峰)、0.082(11号峰)、0.149(12号峰)、0.166(13号峰)、0.101(14号峰)、0.084(15号峰)、0.284(16号峰)；
非共有峰面积不得过总峰面积的5％。
本发明注射液为中药注射液，由黄芪、人参、苦参素组成，其功效为益气扶正，增强机体免疫功能。用于原发性肝癌、肺癌及各种原因引起的白细胞减少症。
本发明注射液质量控制方法不仅通过鉴别黄芪甲苷和对注射液中人参、苦参素的含量进行测定来控制注射液的质量，还首次采用了指纹图谱测定，从原药材、中间体、成品三个环节控制产品质量，保证了本发明注射液的疗效。
本发明注射液中间体指纹图谱检测精密度试验结果显示，中间体的制备样品在1d内通过HPLC分析结果稳定，各共有峰的相对保留时间和相对积分面积相当一致，相对标准偏差均小于3.0％；结果表明本发明注射液中间体指纹图谱检测方法的精密度良好。稳定性试验结果表明低温保存下的本发明注射液中间体的制备样品稳定性较好，常温下1d之内也能保持较好的稳定性。重现性试验结果表明所考察的共有峰的相对保留时间及相对峰面积具有较好的重现性。
本发明注射液成品指纹图谱检测精密度试验结果显示，成品在1d内通过HPLC分析结果稳定，共有峰的相对保留时间和相对积分面积相当一致，相对标准偏差均小于3.0％；结果表明本发明注射液成品指纹图谱检测方法精密度良好。稳定性试验结果表明低温保存下的成品稳定性较好，常温下1d之内也能保持较好的稳定性。重现性试验结果表明所考察的共有峰的相对保留时间及相对峰面积具有较好的重现性。
经药效学试验研究采用本发明质量控制方法得到的本发明注射液具有如下突出的作用：本发明注射液对小白鼠移植性肿瘤肝癌肉瘤H22有明显的抑瘤作用，对小白鼠移植性肿瘤肺癌lewis肉瘤有明显的抑瘤作用。对S180肉瘤荷瘤小白鼠环磷酰胺化疗有明显增效减毒作用，对环磷酰胺化疗所致白细胞总数减少，有明显升白作用，对S180肉瘤荷瘤小白鼠60Co-r射线照射放疗，有非常显著的增效减毒作用，对60Co-r射线放疗所致白细胞总数减少，有明显升白作用，对荷瘤小白鼠化疗、放疗体重减轻，未见明显影响。能明显提高S180肉瘤荷瘤小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，促进血清溶血素(IgM)生成，对Wistar大鼠全血中NK细胞活性有增强的作用趋势，高剂量组有明显的增强作用，具有增强细胞免疫功能和体液免疫功能的作用。说明本发明注射液具有一定的抑瘤作用、抑瘤增效减毒作用和免疫增强作用。
附图说明：
附图1：本发明注射液中间体对照指纹图谱
附图2：本发明注射液成品对照指纹图谱
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
下述试验材料适用于实验例1-10：
受试药物：本发明注射液，长白山制药股份有限公司提供，批号：040401，为淡黄色液体，规格10ml/支，用0.9％NaCl生理盐水(沈阳志鹰制药厂生产，批号：04041303)配成所需浓度，供试验用。阳性对照药，华蟾素注射液，安徽金蟾生化股份有限公司生产，国药准字Z34020273，批号：040402，用5％葡萄糖(沈阳志鹰制药厂生产，批号：04032602)配成所需浓度，现用现配。注射用环磷酰胺，上海华联制药有限公司生产，国药准字H31021703，批号：040114，用生理盐水配成所需浓度，现用现配。
受试动物：昆明种封闭群小白鼠、豚鼠、杂种鸡、Wistar大鼠，购于沈阳医学院实验动物中心，许可证号：SCXK(辽)2003-0016。C57纯系小白鼠购于中国医科大学实验动物部，许可证号：SCXK(辽)2003-0009。BALB/C裸鼠，由中国医学科学院实验动物研究所提供，实验动物合格证号：SCXK(京)2004-0001。环境设施许可证号：SYXK(京)2002-0006。
实验环境：受试动物引进后在辽宁省中医研究院实验动物中心饲养观察一周，许可证号：SYXK(辽)2003-0010。辽宁省中医研究院中药药理实验室为国家中医药管理局三级实验室。实验室温度：20℃～23℃，实验室湿度：50％～60％。
瘤株：小白鼠移植肿瘤腹水瘤S180及肺癌lewis肉瘤由北京药物研究所引进；肝癌H22由中国医科大学肿瘤研究所引进；小鼠淋巴瘤细胞株Yac-1由北京病毒所提供，自行传代保种。人小细胞肺癌LTEP-SML由中国医学科学院肿瘤研究所提供，常规保存。
仪器：“721”分光光度计，上海第三分析仪器厂产；60Co-r射线，由沈阳军区后勤部军事医学研究所提供；超低温冰箱，MDF-382E，日本SANY生产；超纯水机，Milli-Q，美国MILLIPORE生产；酶标仪，BENCHMAR，日本生产；倒置荧光显微镜，LEIT20MIL，德国莱卡生产；电热恒温培养箱，H.HB11420，上海跃进生产；台式压力蒸汽灭菌器，DYMII-JB20L，沈阳盛达生产；生物安全柜，NU-425-400，美国NVAIRE生产；二氧化碳培养箱，NU-4950美国NVAIRE生产。
试剂：大鼠淋巴细胞分离液，中国科学院提供；DMEM，美国GIBCO生产，批号：1090260；胎牛血清，美国GIBCO生产，产品号：F2552；青霉素，沈阳六药生产，批号：20040406；链霉素，沈阳六药生产，批号：20040406；谷胺酰胺，上海康达生产，批号：20031013。MTT，华美生产，批号：1090260。
统计软件：Drug And Statistics verl.0(DAS)。
实验例1：本发明注射液对小白鼠移植性肿瘤肺癌lewis肉瘤的抑瘤作用
取18～22g健康纯系C57小白鼠50只，雌、雄各半，无菌条件下取生长发育良好的肉瘤，用研磨器研磨，无菌生理盐水1：2稀释，右前肢腋下皮下接种0.2ml/只。接种后禁食不禁水17小时，按体重随机分为5组，每组10只，低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、空白对照组，组间平均体重差小于1g，分组给药后立即开始尾静脉给药，每天给药1次，空白对照组给等量的生理盐水，连续给药7天，末次药后24小时处死动物，剖取肿瘤称重，用DAS软件进行统计学分析，进行组间t检验，并计算各组肿瘤抑制率，试验重复3次，结果见表1。
表1：本发明注射液对小白鼠移植性肿瘤肺癌lewis肉瘤抑瘤的作用
**P＜0.01(与空白对照组比)
由表1可见，本发明注射液尾静脉注射给药低剂量组(1.3ml/kg)、中剂量组(2.6ml/kg)、高剂量组(5.2ml/kg)对小白鼠肺癌lewis肉瘤有显著的抑瘤作用，其平均瘤重明显低于荷瘤对照组。
实验例2：本发明注射液对裸鼠移植人小细胞肺癌LTEP-SML的抑瘤作用
取17～18BALB/c雄性裸鼠50只，SPF级，右前肢腋窝皮下接种在裸鼠体内传代生长良好的人肺癌肿瘤组织块，在超净台内无菌操作下，取出肿瘤结节，采取常规小块接种法，1块/鼠(约1mm3)，50只动物肿瘤接种40分钟内完成。待肿瘤长出可触及时(1mm3)，将动物随机分为5组，每组10只，称体重、标号，低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、空白对照组，实验组每日鼠尾静脉注射给药1次，空白对照组给等量的生理盐水，给药15天，末次给药结束后24小时，处死动物，称体重后完整剖取瘤块称瘤重，用DAS软件进行统计学分析，进行组间t检验，并计算抑瘤率。结果见表2。
表2.本发明注射液对裸鼠移植人小细胞肺癌LTEP-SML的抑瘤作用
**P＜0.05(与空白对照组比)
由表2可见，本发明注射液尾静脉注射给药对裸鼠移植人小细胞肺癌LTEP-SML中剂量组(2.6ml/kg)、高剂量组(5.2ml/kg)有显著的抑瘤作用，其平均瘤重明显低于荷瘤对照组。
实验例3：本发明注射液对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠环磷酰胺化疗的增效作用
取18～22g健康昆明小白鼠60只，雌、雄各半，无菌条件下抽取生长发育良好的S180腹水，无菌生理盐水1∶2稀释，右前肢腋下皮下接种0.2ml/只。接种后禁食不禁水17小时，按体重随机分6组，每组10只，低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、模型对照组，荷瘤空白对照组。组间平均体重差小于1g，分组后除空白对照组不注射环磷酰胺，为荷瘤对照组外，其余各组均腹腔注射环磷酰胺30mg/kg化疗，每天1次，连续注射7天。同时开始尾静脉给药，每天1次，模型对照组、空白对照组给等量的生理盐水，连续给药7天。于末次给药后24小时称体重，处死动物，剖取肿瘤称重，计算各组平均瘤重，用DAS软件进行统计学分析，进行组间t检验，并计算抑瘤率和增效抑瘤率，结果见表3。
注：
表3：本发明注射液对环磷酰胺抑制S180肉瘤的增效作用
**P＜0.01(与荷瘤环磷酰胺对照组比)##P＜0.01(与荷瘤对照组比)
由表3可见，本发明注射液尾静脉给药高剂量组(5.2ml/kg)对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠环磷酰胺化疗有增加抑瘤作用，本发明注射液对化疗引起的体重减轻与单纯化疗组比均无明显差异。
实验例4：本发明注射液对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠60Co-r射线放疗照射的增效作用
选取体重20～22g健康小白鼠60只，雌、雄各半。无菌条件下抽取生长发育良好的S180腹水，无菌生理盐水1∶2稀释，右前肢腋下皮下接种0.2ml/只。第二天除留10只荷瘤小鼠不进行60Co-r射线照射外，其余荷瘤小白鼠全部进行60Co-r射线照射，剂量为4GY源距为1.5m，照射时间为1分53秒，剂量率为2.13GY/min，照射后，禁食不禁水17小时，按体重随机分5组，与荷瘤不照射的对照组共为6组。低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、模型对照组，荷瘤空白对照组。照射后第二天开始尾静脉给药，每天1次，模型对照组、空白对照组给等量的生理盐水，共给药7天，末次药后24小时称体重、拉断颈椎处死动物，解剖、取瘤块、称重，计算各组平均瘤重，用DAS软件进行统计学分析，进行组间t检验，结果见表4。
表4：本发明注射液对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠60Co-r射线放疗照射的增效作用
*P＜0.05(与照射荷瘤对照组比)##P＜0.01#＜0.05(与荷瘤空白对照组比)
由表4可见，本发明注射液尾静脉给药低剂量组(1.3ml/kg)、中剂量组(2.6ml/kg)对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠60Co-r射线放疗照射有一定抑瘤作用趋势，高剂量组(5.2ml/kg)对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠60Co-r射线放疗照射有明显增加抑瘤作用，本发明注射液对放疗引起的体重减轻均无明显影响。
实验例5：本发明注射液对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠环磷酰胺化疗的减毒作用
取18～22g健康昆明小白鼠60只，雌、雄各半，无菌条件下抽取生长发育良好的S180腹水，无菌生理盐水1∶2稀释，右前肢腋下皮下接种0.2ml/只。接种后禁食不禁水17小时，按体重随机分6组，低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、模型对照组，荷瘤空白对照组。每组10只，组间平均体重差小于1g，分组后除空白对照组不注射环磷酰胺，为荷瘤对照组外，其余各组均腹腔注射环磷酰胺30mg/kg化疗，每天一次，连续注射7天。同时开始尾静脉给药，每天1次，模型对照组、空白对照组给等量的生理盐水，连续给药7天。于末次给药后24小时称体重，摘眼球取血，常规记数白细胞总数，用DAS软件进行统计学分析，进行组间t检验，结果见表5。
表5：本发明注射液注射对环磷酰胺抑制S180肉瘤的减毒作用
**P＜0.01(与照射荷瘤对照组比)##P＜0.01#＜0.05(与荷瘤对照组比)
由表5可见，本发明注射液尾静脉给药中剂量组(2.6mg/kg)、高剂量组(5.2ml/kg)对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠环磷酰胺化疗有明显减毒作用，高剂量组有明显提高环磷酰胺化疗造成白细胞减少的作用，其白细胞总数明显高于单纯环磷酰胺荷瘤对照组。本发明注射液对化疗引起体重减轻均无明显影响。
实验例6：本发明注射液对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠60Co-r射线放疗照射的减毒作用
选取体重20～22g健康小白鼠60只，雌、雄各半。无菌条件下抽取生长发育良好的S180腹水，无菌生理盐水1∶2稀释，右前肢腋下皮下接种0.2ml/只。第二天除留10只荷瘤小鼠不进行60Co-r射线照射外，其余荷瘤小白鼠全部进行60Co-r射线照射，剂量为4GY源距为1.5m，照射时间为1分53秒，剂量率为2.13GY/min，照射后，禁食不禁水17小时，按体重随机分5组，低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、模型对照组，与荷瘤不照射的对照组共为6组。照射后第二天开始尾静脉给药，模型对照组、空白对照组给等量的生理盐水，每天一次，共给药7天，末次药后24小时称体重。眼底静脉丛取血，计数白细胞总数，用DAS软件进行统计学分析，进行组间t检验，结果见表6。
表6：本发明注射液对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠60Co-r射线放疗照射的减毒作用
**P＜0.01*P＜0.05(与照射荷瘤对照组比)##P＜0.01(与荷瘤对空白照组比)
由表6可见，本发明注射液尾静脉给药低剂量组(1.3ml/kg)有明显提高60Co-r射线放疗照射造成白细胞减少的作用，中剂量组(2.6mg/kg)、高剂量组(5.2ml/kg)有极明显提高60Co-r射线放疗照射造成白细胞减少的作用，其白细胞总数明显高于60Co-r射线放疗照射荷瘤对照组，本发明注射液对放疗引起的体重减轻均无明显影响。
实验例7：本发明注射液对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能作用的影响
取18～22g健康昆明小白鼠50只，雌、雄各半，无菌条件下抽取生长发育良好的S180腹水型腹水，无菌生理盐水1∶2稀释，右前肢腋下皮下接种0.2ml/只。接种后禁食不禁水17小时，按体重随机分6组，每组10只，雌、雄各半。组间平均体重差小于1g，低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、空白对照组，分组后立即开始尾静脉给药，每天给药一次，空白对照组给等量的生理盐水，连续给药7天，在末次给药后1小时，按滴片法腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml/只，3小时后拉断颈椎处死，背位固定，腹腔注射生理盐水(2ml/只)冲洗腹腔，吸取腹腔冲洗液0.5ml滴片。37℃温育30分钟，吉氏染色，油镜观察，计数100个巨噬细胞吞噬鸡红细胞数。按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。
表7：本发明注射液对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠
腹腔巨噬细胞吞噬功能作用的影响
**P＜0.01(与空白对照组比)
由表7可见，本发明注射液尾静脉给药低剂量组(1.3ml/kg)、中剂量组(2.6mg/kg)、高剂量组(5.2ml/kg)对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠，均能极明显提高小白鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数。
实验例8：本发明注射液对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠血清溶血素(IgM)生成的影响
取18～22g健康昆明小白鼠50只，雌、雄各半，无菌条件下抽取生长发育良好的S180腹水，无菌生理盐水1∶2稀释，右前肢腋下皮下接种0.2ml/只。试验前各组受试动物均按文献方法(3)腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水悬液(0.2ml/只)免疫，免疫后禁食不禁水17小时，按体重随机分5组，每组10只，雌、雄各半。低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、空白对照组，组间平均体重差小于1g，分组后立即开始尾静脉给药，空白对照组给等量的生理盐水，每天给药一次，连续给药7天，末次给药后1小时，眼底静脉丛取血，离心，取血清，用生理盐水稀释100倍，另取3只豚鼠血清，生理盐水1∶10稀释，作为补体备用。取上述稀释血清1ml与5％鸡红细胞0.5ml混合，在0℃冰浴中加补体0.5ml，37℃温箱中保温30分钟，取出，在0℃终止反应，离心，取上清液，于“721”分光光度计比色，以不加血清的空白管调“0”点，540nm测定光密度(OD)，以OD值作为血清溶血素生成指标，用DAS软件进行统计学分析，进行组间t检验，试验结果见表8。
表8：本发明注射液对S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠血清溶血素(IgM)生成的影响
**P＜0.01*P＜0.05(与荷瘤空白对照组比)
由表8可见，本发明注射液尾静脉给药中剂量组(2.6mg/kg)能明显促进S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠血清溶血素(IgM)的生成，高剂量组(5.2ml/kg)能极明显促进S180肉瘤(实体型)荷瘤小白鼠血清溶血素(IgM)的生成，其血清光密度值明显高于荷瘤对照组。
实验例9：本发明注射液对大鼠全血中NK细胞活性的影响
取180～220g健康wistar大白鼠50只，雌、雄各半，按体重随机分5组，每组10只，低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、空白对照组，分组后立即开始尾静脉给药，每天给药1次，空白对照组给等量的生理盐水，连续给药3天，末次给药后1小时，腹主动脉取血，将血抽入抗凝管中。
实验前将小鼠淋巴瘤细胞株Yac-1细胞换液继续置37℃，5％CO2培养，用培养液将Yac-1细胞洗涤1次，台盼蓝染色，检查细胞活力＞95％者方可使用，将培养液配成密度为5×106个/mL的悬液，取细胞悬液0.1mL，制备靶细胞(Yac-1)传代培养铺板。
抗凝血5mL加同体积生理盐水稀释混匀，取10mL离心管加4mL淋巴细胞提取液，然后小心的层叠铺入稀释的抗凝血，室温下200rpm离心18min，红细胞沉入管底，白细胞在上层，血浆和下层淋巴细胞分离液底界面，小心吸取淋巴层，用生理盐水洗涤细胞两次，制备效应细胞(NK细胞)。
将单个核细胞悬液装入玻璃平皿中，平放于37℃培养箱中约1h，使单个核/巨噬细胞黏附于玻璃壁上，用毛细管吸出未贴壁的细胞悬液，即获得去除了单个核/巨噬细胞的淋巴细胞，用细胞计数板观察计数，最后配成5×105个/mL的纯淋巴细胞悬液。
在U型微孔板中分组加样，分3组，每组3复孔，实验组：每孔加效应细胞和靶细胞悬液各0.1ml，靶细胞组：每孔加靶细胞悬液和培养液各0.1mL，效应细胞组：每孔加效应细胞悬液和培养液各0.1mL，混匀靶细胞和效应细胞培养4小时加MTT溶液4小时，孵育结束后，吸去100uL培养液加等量含0.1mol/L盐酸的异丙醇溶液，振荡5min，在酶标仪上测定光密度(OD)值，测定波长为490nm，根据OD值进行NK细胞活性计算，取3个孔A值的均值，按下述方法计算，用DAS软件进行统计学分析，进行组间t检验。
表9：本发明注射液对大鼠全血中NK细胞活性的影响
**P＜0.01(与空白对照组比)
由表9可见本发明注射液尾静脉给药低剂量组(1.3mg/kg)、中剂量组(2.6mg/kg)有增强大鼠全血中NK细胞活性的趋势，高剂量组(5.2ml/kg)有明显增强大鼠全血中NK细胞活性的作用，其NK细胞活性明显高于荷瘤对照组。
试验1-9结果表明：
本发明注射液有一定的抑瘤作用。对C57纯系小白鼠移植性肿瘤肺癌lewis肉瘤有明显的抑瘤作用，对裸鼠移植人小细胞肺癌LTEP-SML有明显的抑瘤作用。
本发明注射液有一定的增效作用，对S180肉瘤荷瘤小白鼠环磷酰胺化疗有明显抑瘤增效作用，对S180肉瘤荷瘤小白鼠60Cor射线照射放疗，有非常显著的抑瘤增效作用，对荷瘤小鼠化疗、放疗体重减轻，未见明显影响。
本发明注射液有一定的减毒作用，对S180肉瘤荷瘤小白鼠环磷酰胺化疗所致白细胞总数减少，有明显升白作用，对S180肉瘤荷瘤小白鼠60Co-r射线照射放疗所致白细胞总数减少，有明显升白作用，对荷瘤小鼠化疗、放疗体重减轻，未见明显影响。
本发明注射液有免疫促进作用，具有增强体液免疫和细胞免疫的功能，能明显提高S180肉瘤荷瘤小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，促进血清溶血素(IgM)生成，对Wistar大鼠全血中NK细胞活性有增强的作用趋势，高剂量组有明显的增强作用。
实验例10：本发明注射液中间体HPLC指纹图谱及技术参数
1.指纹图谱选择及共有峰的标定
根据10批供试品HPLC图谱，选择了编号为04205的样品的图谱作为对照指纹图谱。提供建立指纹图谱的有关数据，包括各共有峰的相对保留时间，各共有峰面积的比值。
根据10批供试品HPLC图谱所给出的相关参数，本发明注射液中间体的所有成分的色谱峰在65min之内全部出现。人参原药材中人参皂苷Rg1为其主要成分之一，从指纹图谱中可以看出，与人参皂苷Rg1色谱峰最近的一大峰(相对人参皂苷Rg1色谱峰的TR≌1.18，峰面积约为总峰面积的16％)积分百分比最大，因此选择该峰为参考峰。但为了考察中间体分别与人参和黄芪的相关性，所以分别以该峰和人参皂苷Rg1峰为参考峰，建立两组相对保留时间。
参考峰标号为S，其他特征峰依次标号为1，2，…，N。
2.特征指纹峰相对保留时间及积分相对比值
一共试验了10批供试品，以人参皂苷Rg1为参照品，分别以人参皂苷Rg1的峰(S1)和谱图中的最大峰(S)为参考峰，换算出各峰的相对保留时间，以最大峰(S)为参考峰，换算出各峰的相对积分面积，各指纹峰的峰面积及峰面积比值、保留时间及相对保留时间均具有较好的重现性，结果见表10、11。
表10十批供试品共有峰相对保留时间1
表11十批供试品共有相对保留时间2
表12十批供试品共有峰相对峰面积
3.非共有峰面积
计算10批次供试品图谱中非共有峰总面积及占总峰面积的百分比，结果见表13。
表13十批供试品非共有峰试验结果
| 批次 | 总峰面积 | 非共有峰面积 | 峰面积比(％) |
| 1 | 3353.734 | 94.253 | 2.810 |
| 2 | 3431.465 | 0.000 | 0.000 |
| 3 | 3208.382 | 53.152 | 1.657 |
| 4 | 2937.120 | 45.418 | 1.546 |
| 5 | 3190.165 | 150.871 | 4.729 |
| 6 | 3271.051 | 47.300 | 1.446 |
| 7 | 1946.490 | 51.811 | 2.662 |
| 8 | 3736.125 | 177.700 | 4.756 |
| 9 | 3199.940 | 0.000 | 0.000 |
| 10 | 3124.516 | 103.797 | 3.322 |
从试验结果可知，非共有峰占总峰面积比＜5％，符合要求。
由相似度软件计算可得，各批供试品指纹图谱与质量标准所附对照指纹图谱相似度均在0.9～1.0之间，符合要求。
实验例11：本发明注射液成品HPLC指纹图谱及技术参数
1.指纹图谱选择及共有峰的标定
根据10批供试品HPLC图谱，选择了编号为04204的样品的图谱作为对照指纹图谱。提供建立指纹图谱的有关数据，包括各共有峰的相对保留时间，各共有峰面积的比值。
根据10批供试品HPLC图谱所给出的相关参数，本发明注射液成品的所有成分的色谱峰在65min之内全部出现。人参原药材中人参皂苷Rg1为其主要成分之一，从指纹图谱中可以看出，与人参皂苷Rg1色谱峰最近的一大峰(相对人参皂苷Rg1色谱峰的TR≌1.17，中间体中该TR≌1.18，非常接近，峰面积约为总峰面积的21％)积分百分比最大，因此选择该峰为参考峰。
参考峰标号为S，其他特征峰依次标号为1，2，…，N。
2.特征指纹峰相对保留时间及积分相对比值
一共试验了10批供试品，以人参皂苷Rg1为参照品确定各批供试品指纹图谱中的参考峰，各指纹峰的峰面积及峰面积比值、保留时间及相对保留时间均具有较好的重现性，结果见表14、15。
表14十批供试品共有峰相对保留时间
表15十批供试品峰面积比值
3.非共有峰面积
计算10批次供试品图谱中非共有峰总面积及占总峰面积的百分比，结果见表16。
表16十批供试品非共有峰试验结果
| 批次 | 总峰面积 | 非共有峰面积 | 峰面积比(％) |
| 1 | 3402.774 | 165.141 | 4.853 |
| 2 | 3454.905 | 145.458 | 4.210 |
| 3 | 4585.477 | 220.35 | 4.805 |
| 4 | 3259.54 | 127.746 | 3.919 |
| 5 | 3311.036 | 165.49 | 4.998 |
| 6 | 3252.675 | 153.824 | 4.729 |
| 7 | 2990.128 | 116.488 | 3.896 |
| 8 | 2875.918 | 121.638 | 4.230 |
| 9 | 2778.91 | 123.438 | 4.442 |
| 10 | 2797.493 | 125.597 | 4.490 |
从试验结果可知，非共有峰占总峰面积比＜5％，符合要求。
由相似度软件进行计算可得，各批供试品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均在0.9～1.0之间，符合要求。
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
实施例1：本发明注射液的制备
称取黄芪300g、人参100g、苦参素10g，人参用75％的乙醇，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20(65℃)的清膏，备用。黄芪加水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20(65℃)的清膏，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达75％，用氢氧化钠调PH值至6～7，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15(65℃)的清膏；再加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调值PH至6～7，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400ml，用氢氧化钠调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤。用氢氧化钠调PH值至6～7，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，加注射用水至1000ml，滤过，灌装，即得。
实施例2：本发明注射液中间体的制备
称取黄芪250g、人参120g、苦参素8g，人参用75％的乙醇，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20(65℃)的清膏，备用。黄芪加水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20(65℃)的清膏，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达75％，用氢氧化钠调PH值至6～7，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15(65℃)的清膏；再加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调值PH至6～7，静置12小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400ml，用氢氧化钠调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤。用氢氧化钠调PH值至6～7，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，即得中间体。
实施例3：本发明注射液中间体指纹图谱检测标准
照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)，结合指纹图谱的要求进行测定。
色谱条件及系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L的磷酸二氢钾溶液(pH值4.5)为流动相A，以80％乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min流动相B体积比为25％、流动相A体积比为75％，5～20min流动相B体积比由25％线性上升到39％、流动相A体积比由75％线性下降到61％，20～35min流动相B体积比由39％线性上升到49％、流动相A体积比由61％线性下降到51％，35～55min流动相B体积比由49％线性上升到85％、流动相A体积比由51％线性下降到15％，55～65min流动相B体积比为85％、流动相A体积比为15％，65～72min流动相B体积比由85％线性下降到25％、流动相A体积比由15％线性上升到75％；检测波长203nm；柱温35℃；流速1ml/min。
参照物溶液的制备
精密称取人参皂苷Rg1对照品约3.0mg，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备
取200μl实施例制备的中间体，用水稀释至5ml，作为供试品溶液。HPLC分析前用0.45μm水系滤膜过滤。
测定法
分别取各批中间体供试品溶液20μ1，注入高效液相色谱仪，记录70min色谱。
供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱有良好的相似性。
指纹图谱应有21个共有峰；
相对保留时间/min(特征峰序号)
0.621(1)、0.816(2)、0.846(3)、0.895(4)、1.000(S)、1.062(5)、1.105(6)、1.367(7)、1.460(8)、1.483(9)、1.559(10)、1.638(11)、1.718(12)、1.801(13)、1.825(14)、1.921(15)、1.996(16)、2.451(17)、2.574(18)、3.089(19)、3.399(20)。
峰面积比值
0.115(1)、0.130(2)、0.746(3)、0.251(4)、1.000(S)、0.418(5)、0.538(6)、0.158(7)、0.089(8)、0.120(9)、0.248(10)、0.077(11)、0.078(12)、0.301(13)、0.124(14)、0.326(15)、0.531(16)、0.074(17)、0.091(18)、0.301(19)、0.190(20)。
非共有峰面积不得过总峰面积的5％。
实施例4：本发明注射液成品指纹图谱检测标准
照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)，结合指纹图谱的要求进行测定。
色谱条件及系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L的磷酸二氢钾溶液(pH值4.5)为流动相A，以80％乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min流动相B体积比为25％、流动相A体积比为75％，5～20min流动相B体积比由25％线性上升到39％、流动相A体积比由75％线性下降到61％，20～35min流动相B体积比由39％线性上升到49％、流动相A体积比由61％线性下降到51％，35～55min流动相B体积比由49％线性上升到85％、流动相A体积比由51％线性下降到15％，55～65min流动相B体积比为85％、流动相A体积比为15％，65～72min流动相B体积比由85％线性下降到25％、流动相A体积比由15％线性上升到75％；检测波长203nm；柱温35℃；流速1ml/min。
参照物溶液的制备
精密称取人参皂苷Rg1对照品约3.0mg，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备
取实施例1制备的注射液成品，直接作为供试品溶液。
测定法
分别取各批成品供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录70min色谱。
供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱有良好的相似性。
指纹图谱应有17个共有峰；
相对保留时间/min(特征峰序号)
0.844(1)、0.857(2)、0.904(3)、1.000(S)、1.061(4)、1.096(5)、1.364(6)、1.457(7)、1.491(8)、1.567(9)、1.645(10)、1.721(11)、1.873(12)、1.947(13)、2.360(14)、2.463(15)、3.259(16)。
峰面积比值
0.122(1)、0.733±25％(2)、0.272±30％(3)、1.000(S)、0.496±25％(4)、0.226(5)、0.120(6)、0.083(7)、0.170(8)、0.169(9)、0.128(10)、0.082(11)、0.149(12)、0.166(13)、0.101(14)、0.084(15)、0.284(16)。
非共有峰面积 不得过总峰面积的5％。
实施例5：本发明注射液的质量控制方法
鉴别：
取实施例1制备的注射液10ml，加水至30ml，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以13∶7∶2的氯仿-甲醇-水10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点，365nm紫外光灯下显相同的橙黄色荧光斑点。
含量测定方法：
A.人参：照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定；
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；21∶79∶1的乙腈∶水∶三氟醋酸为流动相，检测波长为203nm；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1和Re对照品适量，分别加甲醇制成每1ml各含0.04mg的溶液，即得对照品溶液；
供试品溶液的制备：取实施例1制备的注射液，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；本品每1ml含人参以人参皂苷Rg1(C42H72O14)和Re(C48H82O18)的总量计，不得少于0.04mg。
B.苦参素：照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；93∶71％的磷酸溶液-乙腈为流动相，其中磷酸溶液用三乙胺调节pH值为2.5，检测波长为220nm；理论板数按氧化苦参碱峰计算应不低于2000，氧化苦参碱峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求；
对照品溶液的制备：称取氧化苦参碱对照品适量，加流动相制成每1ml中含0.25mg的溶液，即得对照品溶液；
供试品溶液制备：量取实施例1制备的注射液2.5ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
测定法：量取对照品溶液及供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算；本品每1ml含苦参碱素以氧化苦参碱(C15H24N202)计，应为9.0mg～11.0mg。
实施例6：本发明注射液的质量控制方法
鉴别：
取实施例1制备的注射液10ml，加水至30ml，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以13∶7∶2的氯仿-甲醇-水10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点，365nm紫外光灯下显相同的橙黄色荧光斑点。
含量测定方法：
A.人参：照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定；
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；21∶79∶1的乙腈∶水∶三氟醋酸为流动相，检测波长为203nm；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1和Re对照品适量，分别加甲醇制成每1ml各含0.04mg的溶液，即得对照品溶液；
供试品溶液的制备：取实施例1制备的注射液，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；本品每1ml含人参以人参皂苷Rg1(C42H72O14)和Re(C48H82O18)的总量计，不得少于0.04mg。
B.苦参素：照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；93∶71％的磷酸溶液-乙腈为流动相，其中磷酸溶液用三乙胺调节pH值为2.5，检测波长为220nm；理论板数按氧化苦参碱峰计算应不低于2000，氧化苦参碱峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求；
对照品溶液的制备：称取氧化苦参碱对照品适量，加流动相制成每1ml中含0.25mg的溶液，即得对照品溶液；
供试品溶液制备：量取实施例1制备的注射液2.5ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
测定法：量取对照品溶液及供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算；本品每1ml含苦参碱素以氧化苦参碱(C15H24N202)计，应为9.0mg～11.0mg。
注射液成品指纹图谱检测标准：
照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)，结合指纹图谱的要求进行测定。
色谱条件及系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L的磷酸二氢钾溶液(pH值4.5)为流动相A，以80％乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min流动相B体积比为25％、流动相A体积比为75％，5～20min流动相B体积比由25％线性上升到39％、流动相A体积比由75％线性下降到61％，20～35min流动相B体积比由39％线性上升到49％、流动相A体积比由61％线性下降到51％，35～55min流动相B体积比由49％线性上升到85％、流动相A体积比由51％线性下降到15％，55～65min流动相B体积比为85％、流动相A体积比为15％，65～72min流动相B体积比由85％线性下降到25％、流动相A体积比由15％线性上升到75％；检测波长203nm；柱温35℃；流速1ml/min。
参照物溶液的制备
精密称取人参皂苷Rg1对照品约3.0mg，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备
取实施例1制备的注射液成品，直接作为供试品溶液。
测定法
分别取各批成品供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录70min色谱。
供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱有良好的相似性。
指纹图谱应有17个共有峰；
相对保留时间/min(特征峰序号)
0.844(1)、0.857(2)、0.904(3)、1.000(S)、1.061(4)、1.096(5)、1.364(6)、1.457(7)、1.491(8)、1.567(9)、1.645(10)、1.721(11)、1.873(12)、1.947(13)、2.360(14)、2.463(15)、3.259(16)。
峰面积比值
0.122(1)、0.733±25％(2)、0.272±30％(3)、1.000(S)、0.496±25％(4)、0.226(5)、0.120(6)、0.083(7)、0.170(8)、0.169(9)、0.128(10)、0.082(11)、0.149(12)、0.166(13)、0.101(14)、0.084(15)、0.284(16)。
非共有峰面积不得过总峰面积的5％。
Claims (7)
1、一种由原料药黄芪200～400重量份、人参60～130重量份、苦参素6-13重量份制成的注射液成品的质量控制方法，其特征在于该方法包括如下指纹图谱测定：
照高效液相色谱法；
色谱条件及系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以pH值4.5、0.02mol/L的磷酸二氢钾溶液为流动相A，以80％乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min流动相B体积比为25％、流动相A体积比为75％，5～20min流动相B体积比由25％线性上升到39％、流动相A体积比由75％线性下降到61％，20～35min流动相B体积比由39％线性上升到49％、流动相A体积比由61％线性下降到51％，35～55min流动相B体积比由49％线性上升到85％、流动相A体积比由51％线性下降到15％，55～65min流动相B体积比为85％、流动相A体积比为15％，65～72min流动相B体积比由85％线性下降到25％、流动相A体积比由15％线性上升到75％；检测波长203nm；柱温35℃；流速1ml/min；
参照物溶液的制备：称取人参皂苷Rg1对照品3.0mg，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得；
供试品溶液的制备：成品直接作为供试品溶液；
测定法：分别取各批成品供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录70min色谱；
供试品指纹图谱应与质量标准所附的注射液成品对照指纹图谱有良好的相似性；
指纹图谱应有17个共有峰；
各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：1号峰为0.844、2号峰为0.857、3号峰为0.904、S峰为1.000、4号峰为1.061、5号峰为1.096、6号峰为1.364、7号峰为1.457、8号峰为1.491、9号峰为1.567、10号峰为1.645、11号峰为1.721、12号峰为1.873、13号峰为1.947、14号峰为2.360、15号峰为2.463、16号峰为3.259；
各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.122、2号峰为0.733±25％、3号峰为0.272±30％、S峰为1.000、4号峰为0.496±25％、5号峰为0.226、6号峰为0.120、7号峰为0.083、8号峰为0.170、9号峰为0.169、10号峰为0.128、11号峰为0.082、12号峰为0.149、13号峰为0.166、14号峰为0.101、15号峰为0.084、16号峰为0.284；
非共有峰面积不得过总峰面积的5％；
所述的注射液成品是由如下方法制备的：
称取三味原料药，人参用70-80％的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，备用；黄芪加水煎煮2～3次，每次1～3小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达60～80％，用氢氧化钠调PH值至6～7，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15的清膏，测定温度为65℃；再加乙醇使含醇量达70～90％，用氢氧化钠调值PH至6～7，静置12小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400体积份，用氢氧化钠调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤；用氢氧化钠调PH值至6～7，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，加注射用水至1000体积份，滤过，灌装，即得。
2、如权利要求1所述注射液成品的质量控制方法，其特征在于该方法中所述的注射液成品是由如下方法制备的：
称取三味原料药，人参用75％的乙醇，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至65℃下相对密度为1.10～1.20的清膏，备用；黄芪加水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至65℃下相对密度为1.10～1.20的清膏，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达75％，用氢氧化钠调PH值至6～7，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至65℃下相对密度为1.10～1.15的清膏；再加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调值PH至6～7，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400体积份，用氢氧化钠调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤；用氢氧化钠调PH值至6～7，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，加注射用水至全量，滤过，灌装，即得。
3、一种由原料药黄芪200～400重量份、人参60～130重量份、苦参素6～13重量份制成的注射液中间体的质量控制方法，其特征在于该方法包括如下指纹图谱测定：
照高效液相色谱法；色谱条件及系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以pH值4.5、0.02mol/L的磷酸二氢钾溶液为流动相A，以80％乙腈溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5min流动相B体积比为25％、流动相A体积比为75％，5～20min流动相B体积比由25％线性上升到39％、流动相A体积比由75％线性下降到61％，20～35min流动相B体积比由39％线性上升到49％、流动相A体积比由61％线性下降到51％，35～55min流动相B体积比由49％线性上升到85％、流动相A体积比由51％线性下降到15％，55～65min流动相B体积比为85％、流动相A体积比为15％，65～72min流动相B体积比由85％线性下降到25％、流动相A体积比由15％线性上升到75％；检测波长203nm；柱温35℃；流速1ml/min；
参照物溶液的制备：称取人参皂苷Rg1对照品3.0mg，置10ml容量瓶中，用40％甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得；
供试品溶液的制备：取200μl中间体，用水稀释至5ml，作为供试品溶液；HPLC分析前用0.45μm水系滤膜过滤；
测定法：分别取各批中间体供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录70min色谱；
供试品指纹图谱应与质量标准所附的注射液中间体对照指纹图谱有良好的相似性；
指纹图谱应有21个共有峰；
各序号特征峰的相对保留时间按分钟计分别为：1号峰为0.621、2号峰为0.816、3号峰为0.846、4号峰为0.895、S峰为1.000、5号峰为1.062、6号峰为1.105、7号峰为1.367、8号峰为1.460、9号峰为1.483、10号峰为1.559、11号峰为1.638、12号峰为1.718、13号峰为1.801、14号峰为1.825、15号峰为1.921、16号峰为1.996、17号峰为2.451、18号峰为2.574、19号峰为3.089、20号峰为3.399；
各序号特征峰的峰面积比值分别为：1号峰为0.115、2号峰为0.130、3号峰为0.746、4号峰为0.251、S峰为1.000、5号峰为0.418、6号峰为0.538、7号峰为0.158、8号峰为0.089、9号峰为0.120、10号峰为0.248、11号峰为0.077、12号峰为0.078、13号峰为0.301、14号峰为0.124、15号峰为0.326、16号峰为0.531、17号峰为0.074、18号峰为0.091、19号峰为0.301、20号峰为0.190；
非共有峰面积不得过总峰面积的5％；
所述注射液中间体是由如下方法制备的：
称取三味原料药，人参用70～80％的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3小时，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，备用；黄芪加水煎煮2～3次，每次1～3小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达60～80％，用氢氧化钠调PH值至6～7，静置，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15的清膏，测定温度为65℃；再加乙醇使含醇量达70～90％％，用氢氧化钠调值PH至6～7，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400体积份，用氢氧化钠调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤；用氢氧化钠调PH值至6～7，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，即得中间体。
4、如权利要求3所述注射液中间体的质量控制方法，其特征在于该方法中所述的注射液中间体是由如下方法制备的：
称取三味原料药，人参用75％的乙醇，回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，备用；黄芪加水煎煮二次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，测定温度为65℃，与人参清膏合并，加乙醇使含醇量达75％，用氢氧化钠调PH值至6～7，静置12小时，取上清液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.10～1.15的清膏，测定温度为65℃；再加乙醇使含醇量达85％，用氢氧化钠调值PH至6～7，静置12小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水到400体积份，用氢氧化钠调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤；用氢氧化钠调PH值至6～7，加活性炭适量，搅匀，煮沸15分钟，滤过，滤液备用；另取苦参素溶解，用稀盐酸调PH值至6～7，100℃灭菌30分钟，冷藏，抽滤，与脱炭后的药液合并，混匀，即得中间体。
5、如权利要求1～4所述任意一种注射液成品或注射液中间体的质量控制方法，其特征在于该方法中所述的制成注射液成品或注射液中间体的原料药为：
黄芪250重量份、人参120重量份、苦参素8重量份。
6、如权利要求1～4所述任意一种注射液成品或注射液中间体的质量控制方法，其特征在于该方法中所述的制成注射液成品或注射液中间体的原料药为：
黄芪350重量份、人参70重量份、苦参素12重量份。
7、如权利要求1～4所述任意一种注射液成品或注射液中间体的质量控制方法，其特征在于该方法中所述的制成注射液成品或注射液中间体的原料药为：
黄芪300重量份、人参100重量份、苦参素10重量份。
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