CN105535050A - 一种当归抗肿瘤药物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物提取物领域，涉及一种具有抗肿瘤作用的当归提取物。该提取物是采用如下方法制备的：（1）将当归粉碎，置烘箱内烘干后，加50%～60%丙酮，于水浴回流提取，提取液回收丙酮，得到当归总提取物浸膏；（2）将得到的当归总提取物浸膏以氯仿<b>:</b>甲醇=50:2的混合溶液在水浴条件下搅拌溶解，过滤，滤液在水浴中减压浓缩后进行层析分离；（3）选用AB-8型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1:7～9，上样体积6BV～8BV，水洗4BV～6BV除杂，以乙酸乙酯:丙酮=100:2的洗脱剂7BV～9BV洗脱，流速为2BV/h～4BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。
Description
技术领域
本发明属于植物提取物领域，涉及一种具有抗肿瘤作用的当归提取物药物。
背景技术
当归是伞形科当归属植物当归Agelicasinensis(Oilv.)Diel的干燥根，为经典的常用中药，具有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效。
肿瘤是一种发病率逐年上升的疾病，尤其恶性肿瘤已严重影响人类的生存。因此，寻找有效抗癌药物是目前肿瘤研究的重点。目前，随着中药抗肿瘤作用的发现，从中药中开发有效抗肿瘤药物已成为热点，当归也引起了学者关注，研究证实当归不同提取物能有效抑制肿瘤生长，显示出一定抗肿瘤活性。当归成分除多糖，挥发油外，还有其他成分，其诸多成分均有一定抗肿瘤活性。
当归多糖抗肿瘤效应
1.1当归多糖
当归多糖（Angelicapolysaccharide，APS）为当归有效成分之一，中药多糖抗肿瘤以其作用机制多方位、多环节、高效低毒影响肿瘤细胞增殖以及有较好抗肿瘤特点而被学者广为关注。近年来，有关中药多糖抗肿瘤研究已取得重大进展。研究显示，当归多糖亦显示出良好抗肿瘤效应，随着研究不断深入，已从当归中获得多种多糖组分，且不同多糖抗肿瘤机制各异。
1.1.1APS-1cII
曹蔚等通过研究APS-1cII（Angelicapolysaccharide-1cII，APS-1cII）抗肿瘤机制，证实均一性APS-1cII对体外培养肿瘤细胞无增殖抑制作用，但对S180荷瘤小鼠肿瘤生长具抑制效应，且能增加荷瘤机体免疫细胞数量和免疫器官质量，并刺激免疫细胞分泌TNF-α、IL-1β。此机制可能与APS-1cII参与荷瘤机体免疫调节直接促使肿瘤凋亡或间接抑制肿瘤细胞增殖有关，通过体液免疫和细胞免疫，作用于非特异性及特异性免疫细胞，综合实现体内抑瘤作用。
1.1.2APS-bII
陈曦等从当归粗多糖中分离纯化到均一性杂多糖APS-bII，并探讨了APS-bII体外抗肿瘤机制，结果表明，APS-bII浓度范围为（3～1000mg/L）时，可对人结肠癌细胞SW-1116和人肝癌细胞HepG2产生较为显著增殖抑制作用。研究证实，多数多糖抗肿瘤机制为通过直接促进肿瘤细胞凋亡或间接增强免疫功能实现抗肿瘤作用。APS-bII虽能对体外培养的多种肿瘤细胞产生抑制，但其作用机制尚且不明，有待更为深入的研究。
1.1.3APS-3c
曹蔚等从当归中分离纯化得到新型酸性多糖APS-3c，用于研究其对体外培养肿瘤细胞的毒性，结果表明，相比对照组APS-3c对人HeLa和HepG2细胞没有显著增殖抑制效应，而对人白血病HL-60及SWlll6肿瘤细胞有一定毒性。
1.1.4APS-2а
通过建立小鼠肉瘤S180移植模型，证实当归酸性多糖APS-2а对S180荷瘤小鼠具抑瘤作用，能显著提高荷瘤机体胸腺和脾脏指数。这与APS-2а具一定免疫调节作用相关。但低剂量APS-2а对小鼠肉瘤S180抑制效果最为显著，抑瘤率达49.49%（P<0.05），APS-2а抑瘤作用与剂量呈负相关性，此抑瘤机制较为特殊，有待进一步研究。
1.1.5APS-3b
研究发现，当归酸性多糖APS-3b能显著抑制S180肿瘤生长，延长S180荷瘤小鼠生存时间，这与APS-3b促进脾细胞增殖，上调脾细胞中IFN-gamma、IL-6及IL-2mRNA表达，促进腹膜巨噬细胞产生TNF-alpha及NO相关。
1.1.6APS
郑敏等用APS研究了对人白血病K562细胞的增殖与分化作用，得出结论，APS对K562细胞增殖有显著抑制作用，并可降低K562细胞C-MYC表达水平，促进其向红、粒细胞方向分化，这与APS阻止K562细胞由G0/G1过渡至S、G2＋M期，影响参与K562细胞增殖与分化的相关基因而产生抗肿瘤作用有关。华自森等证实APS能够抑制K562细胞增殖、诱导其凋亡并促进其分化，这与APS使K562细胞核中STAT3表达减少，影响JAK2/STAT3核转位活化和信号分子表达相关。可见，APS是一类极具价值、并具前景的抗肿瘤药物。
1.1.7硫酸酯化APS
吴素珍等通过建立S180小鼠模型研究了硫酸酯化当归多糖（SPAS）的抗肿瘤作用。证实，当归多糖经硫酸酯化后，能延长荷瘤小鼠存活期，并能使小鼠移植性肿瘤S180生长受到抑制，与阴性对照组相比肿瘤重量明显较轻。这可能与多糖经硫酸酯化作用后，具有一定细胞毒作用，并对机体非特异性和特异性免疫功能有一定促进作用相关；分子结构和空间构象发生变化，生物活性也随着改变有关，但硫酸酯化当归多糖抗肿瘤机理是否与此相关，尚有待更为深入的研究。
当归挥发油的抗肿瘤效应
2.1当归挥发油
当归挥发油做为当归重要成分之一，具有多样化学组成及良好药理活性，有关当归挥发油抗肿瘤作用研究，报道日益增加，现做出归纳总结，以便为当归挥发油后续深入研究提供依据。
2.1.1当归内酯（ASDL）
当归内酯（ASDL）为当归挥发油成分之一，龙锐通过建立荷瘤小鼠H22肝癌模型，研究了ASDL抗肿瘤效应。结果表明，ASDL具显著抑制小鼠H22肝癌移植瘤的生长作用，有良好抗肿瘤活性，ASDL的抑瘤作用是通过增加胸腺和脾脏系数，增强淋巴细胞增殖、巨噬细胞吞噬功能、CTL和NK细胞活性而实现。
2.1.2当归乙醇提取物
将当归挥发油成分之一正丁烯基苯酞（n-butylidenephthalide，n-BP）作用于人前列腺癌细胞PC-3和LNCaP。结果显示，n-BP能通过提高细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子及降低检验点蛋白表达，而使两种细胞均停滞于G0/G1期，且能受内质网应激诱导调节而产生细胞毒作用，亦能抑制荷LNCaP瘤裸鼠体内肿瘤生长，抑瘤率达68%。从当归中用氯仿提取n-BP之后，用于对体内外多形性成胶质细胞瘤（GBM）抗肿瘤效应研究。发现，n-BP在体外，通过触发p53蛋白依赖性及非依赖途径而引起肿瘤细胞凋亡；在体内，通过上调p21和p27表达而减少Rb蛋白磷酸化，下调肿瘤细胞周期调控因子使肿瘤细胞停留在G0/G1期，以发挥抗肿瘤效应。研究表明，体外适量n-BP能显著抑制人肺癌A549端粒酶活性及hTERTmRNA表达，从而对其产生生长抑制作用；体内试验发现，n-BP对荷A549瘤裸鼠亦能产生生长抑制作用。可见，n-BP在体内外均能对发挥抗肿瘤效应。
2.1.3当归藁本内酯
研究显示，用甲醇从当归中提取的一种新型藁本内酯对癌细胞K562、L1210具有很强细胞毒作用，IC50分别达到了（4.78±0.18）μmol/L，（2.27±0.10）μmol/L。藁本内酯对人结肠癌细胞HT-29具有细胞毒和增殖抑制作用，对HT-29细胞增殖抑制作用强于对人正常结肠细胞CCD-18Co的细胞毒作用，对前者细胞IC50为（60.63±6.79），表明，藁本内酯的抗癌活性主要是通过抑制癌细胞增殖实现的。藁本内酯对人恶性胶质瘤T98G细胞转移具有显著抑制效应，并与剂量成正相关，此机制与调节3种RhoGTPases（RhoA，Rac1andCdc42）的表达有关，可见，藁本内酯通过调节RhoGTPases表达，以抑制癌细胞转移的方式，也可能发挥抗肿瘤效应。
当归水提取物抗肿瘤效应
顾勤等探究了单味当归水煎液对小鼠黑素瘤B16-BL6细胞的影响及其机制，结果显示，当归水煎液可显著抑制小鼠B16-BL6细胞增殖，减少肺转移结节数，降低肺转移程度。此机理可能与当归水煎液通过提高E-cad表达、降低MMP-9和FN表达，从而抑制B16-BL6细胞转移、侵袭、粘附和运动能力相关。陈景华等考察当归经水提醇沉MEM培养液稀释后对共培养的人黑素瘤细胞（A375）和角质形成细胞（HаCаT）合成黑素能力的影响。证实，当归水提醇沉物能显著抑制共培养细胞合成黑素，并与提取物浓度呈一定量效关系，此机制与酪氨酸酶活力受到抑制，进而抑制共培养细胞体系的黑素合成有关。
当归丙酮提取物抗肿瘤效应
用丙酮提取了当归脂溶性成分，研究其对多形性成胶质细胞瘤的药理效应活性，提取物作用于GMB8410细胞及荷GMB8410瘤裸鼠体内，得出结论，当归丙酮提取物能通过降低凋亡蛋白组织蛋白酶B及VEGF的表达水平，在体外能对GMB8410细胞产生增殖抑制效应；体内能够抑制脑肿瘤生长及其新生血管的形成，这可能与细胞周期受抑及凋亡受促有关。
小结
当归为伞形科植物当归的根，性甘、辛、温，具补气生血、扶本固正之功效。临床中广泛用于治疗多种病症，为最常用中药之一，当归具有良好抗肿瘤效应，但尚未成为抗肿瘤药物应用与临床。
当归多糖抗肿瘤研究已取得一定进展，值得更为深入研究，而其挥发油中仅较少成分做了抗肿瘤作用研究，其他多种挥发油成分抗肿瘤作用却未见报道，有必要加大对当归多糖、挥发油抗肿瘤作用的进一步研究，为开发当归临床药用价值提供依据。当归水煎液抗肿瘤作用，虽取得了一定进展，但更有必要和现代科技手段相结合，改变水煎法提取药物成分方式，建立水煎法所获取成分分离、提取、纯化方法。此外，当以当归丙酮提取物所具有良好抗肿瘤效应为借鉴，拓展于不同有机溶剂提取物抗肿瘤活性研究。
以上综述表明，当归具有确切抗肿瘤活性。当归不同提取物在抗肿瘤方面显示出良好药理活性是中药在抗肿瘤方面的独特性，相比化学药物而言，当归抗肿瘤，具高效低毒特点，这在肿瘤治疗方面相比化疗法独具优越性，不仅能产生较好疗效，且能保护机体正常组织细胞。说明充分开发当归还可为开拓抗肿瘤新型药物提供科学指导。当归具有多种化学成分，但目前当归有效成分中仅报道了其多糖、挥发油、水煎液及丙酮提取物抗肿瘤效应，而当归香豆素类，黄酮类，有机酸等化学成分尚没有抗肿瘤方面研究。有必要深入挖掘当归有效抗肿瘤活性成分，这对充分开发利用当归极具意义，也能为挖掘抗肿瘤药物提供思路、为开拓有效抗肿瘤药物奠定基础。
本发明提供了一种治疗肿瘤的当归提取物，研究证明该提取物具有明显的抗肿瘤作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种当归提取物。
本发明的另一目的是提供该提取物的制备方法。
本发明的还提供该提取物在制备治疗肿瘤以及胆囊息肉药物中的应用。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种具有抗肿瘤作用的当归提取物，该当归提取物是采用如下方法制备的：
（1）将当归粉碎，置烘箱内40℃～50℃烘干3h～5h后，加15～25倍量50%～60%丙酮，于60℃～70℃水浴回流提取2次～4次，每次70min～80min，合并提取液，回收丙酮，得到当归总提取物浸膏；
（2）将得到的当归总提取物浸膏以氯仿:甲醇=50:2的混合溶液在40℃～50℃水浴条件下搅拌溶解，过滤，滤液在40℃～50℃水浴中减压浓缩后进行层析分离；
（3）选用AB-8型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1:7～9，上样体积6BV～8BV，水洗4BV～6BV除杂，以乙酸乙酯:丙酮=100:2的洗脱剂7BV～9BV洗脱，流速为2BV/h～4BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。
所述当归提取物优选是采用如下方法制备的：
（1）将当归粉碎，置烘箱内40℃烘干5h后，加15倍量55%丙酮，于60℃水浴回流提取4次，每次70min，合并提取液，回收丙酮，得到当归总提取物浸膏；
（2）将得到的当归总提取物浸膏以氯仿:甲醇=50:2的混合溶液在50℃水浴条件下搅拌溶解，过滤，滤液在50℃水浴中减压浓缩后进行层析分离；
（3）选用AB-8型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1:7，上样体积8BV，水洗4BV除杂，以乙酸乙酯:丙酮=100:2的洗脱剂9BV洗脱，流速为2BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。
所述当归提取物还可以优选采用如下方法制备：
（1）将当归粉碎，置烘箱内50℃烘干3h后，加25倍量50%丙酮，于70℃水浴回流提取2次，每次80min，合并提取液，回收丙酮，得到当归总提取物浸膏；
（2）将得到的当归总提取物浸膏以氯仿:甲醇=50:2的混合溶液在40℃水浴条件下搅拌溶解，过滤，滤液在40℃水浴中减压浓缩后进行层析分离；
（3）选用AB-8型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1:9，上样体积6BV，水洗6BV除杂，以乙酸乙酯:丙酮=100:2的洗脱剂7BV洗脱，流速为4BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。
所述当归提取物还可以优选采用如下方法制备：
（1）将当归粉碎，置烘箱内45℃烘干4h后，加20倍量60%丙酮，于65℃水浴回流提取3次，每次75min，合并提取液，回收丙酮，得到当归总提取物浸膏；
（2）将得到的当归总提取物浸膏以氯仿:甲醇=50:2的混合溶液在45℃水浴条件下搅拌溶解，过滤，滤液在45℃水浴中减压浓缩后进行层析分离；
（3）选用AB-8型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1:8，上样体积7BV，水洗5BV除杂，以乙酸乙酯:丙酮=100:2的洗脱剂8BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。
所述的当归提取物，其特征在于，该当归提取物采用药学中常规的制药方法制备成口服制剂。
所述口服制剂优选制备为片剂、丸剂、硬胶囊剂、颗粒剂、口服液。
所述当归提取物可采用如下方法制备为硬胶囊剂：取当归提取物，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，装入硬胶囊，即得。
所述当归提取物可采用如下方法制备为片剂：取当归提取物，粉碎成细粉，加入辅料，混匀，制成颗粒，干燥，压制成片，即得。
所述的当归提取物，可采用高效液相色谱法对6-甲氧基-7-羟基香豆素进行含量测定：
（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为20～40：60～80的乙腈-水；检测波长：190～210nm；柱温：15～25℃；流速：0.5～1.5mL·min-1；进样量：5～20μL；
（2）对照品溶液制备：精密称取干燥至恒重的6-甲氧基-7-羟基香豆素对照品适量，加甲醇溶解制成对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取本发明当归提取物，加甲醇，加热回流，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各5～20μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
其中，优选采用高效液谱法对6-甲氧基-7-羟基香豆素进行含量测定：
（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-水；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；
（2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的6-甲氧基-7-羟基香豆素对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取本发明当归提取物10mL，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
所述的当归提取物，采用气相色谱法对香草醛、马鞭草烯酮进行含量测定：
（1）色谱条件：色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱；载气：N2，0.5～1.5mL·mL-1；氢气，30～50mL·mL-1；空气，300～500mL·min-1；分流比：5～15：1；进样口温度：240～260℃，检测器温度：290～310℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法；
（2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成溶液，摇匀，作为内标溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密量取本品，置容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取，置容量瓶中，精密加入内标溶液，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；
（4）对照品溶液的制备：精密称取香草醛对照品、马鞭草烯酮对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含香草醛及马鞭草烯酮的对照品储备溶液，备用；
（5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各5～20μL，注入气相色谱仪，进行检测。
其中，采用气相色谱法对香草醛、马鞭草烯酮进行含量测定，优选步骤如下：
（1）色谱条件：色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱；载气：N2，1.0mL·mL-1；氢气，40mL·mL-1；空气，400mL·min-1；分流比：8：1；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法；
（2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；
（4）对照品溶液的制备：精密称取香草醛对照品、马鞭草烯酮对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含香草醛0.301mg·mL-1及马鞭草烯酮0.901mg·mL-1的对照品储备溶液，备用；
（5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测。
所述的当归提取物采用药学中常规的制药方法制备成口服药物制剂。
所述的当归提取物在制备治疗胆囊息肉药物或保健品中的应用。
本发明所述的当归提取物可用于在制备治疗肿瘤药物或保健品。
本发明所述的当归提取物还可用于在制备治疗胆囊息肉药物或保健品。
通过如下实验研究验证本发明的技术效果：
实验一：本发明当归提取物抗肿瘤作用的实验研究
1材料
本发明当归提取物：（1）将当归粉碎，置烘箱内45℃烘干4h后，加20倍量60%丙酮，于65℃水浴回流提取3次，每次75min，合并提取液，回收丙酮，得到当归总提取物浸膏；
（2）将得到的当归总提取物浸膏以氯仿:甲醇=50:2的混合溶液在45℃水浴条件下搅拌溶解，过滤，滤液在45℃水浴中减压浓缩后进行层析分离；
（3）选用AB-8型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1:8，上样体积7BV，水洗5BV除杂，以乙酸乙酯:丙酮=100:2的洗脱剂8BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，得本发明当归提取物。
对比药物A（当归多糖）：陕西慈缘生物技术有限公司生产。
对比药物B（当归挥发油）：陕西藤迈生物科技有限责任公司生产。
对比药物C（当归内酯）：彼艾孚（上海）实业有限公司生产。
对比药物D（当归乙醇提取物）：取当归粗粉，加10倍量70%乙醇于室温下浸渍2次，每次2天，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩，干燥，得当归乙醇提取物。
对比药物E（当归藁本内酯）：西安天宝生物科技有限公司生产。
对比药物F（当归水提取物）：取当归粗粉（40目），加水煎煮三次，（一煎加水6倍量，煎煮90min；二煎加水4倍量，煎煮60min；三煎加水4倍量，煎煮30min）；药液合并浓缩至药材量与药液浓缩液量的比为1:1，加乙醇至含醇量达60％，静置24h，滤过，回收乙醇至无醇味，加水至每lml含1g药材，静置36h，0.45μm微孔滤膜滤过，得当归水提取物，浓缩，干燥，得当归水提取物。
对比药物G（当归丙酮提取物）：取当归粗粉（40目），加水煎煮三次，（一煎加水6倍量，煎煮90min；二煎加水4倍量，煎煮60min；三煎加水4倍量，煎煮30min）；药液合并浓缩至药材量与药液浓缩液量的比为1:1，加乙醇至含醇量达60％，静置24h，滤过，回收乙醇至无醇味，加水至每lml含1g药材，静置36h，0.45μm微孔滤膜滤过，得当归水提取物，浓缩，当归总浸膏；将上述总浸膏，通过聚酸胺柱，得流出液A；取流出液A，溶于95%乙醇，拌入硅藻土，红外灯下烘干，置索氏抽提器中，先用苯萃取，继用丙酮萃取，常压蒸馏回收丙酮，得浓缩物；浓缩物在水浴上挥尽丙酮，得丙酮提取物。
注射用环磷酰胺，江苏盛迪医药有限公司，国药准字H20023036；
健康昆明种小鼠，雌雄兼用，体质量18～22g；小鼠肝癌H22细胞株购于甘肃中医药大学实验动物中心，肉瘤S180细胞株，购于由山东省医学科学院药物研究所。
2方法
2.1制备瘤细胞悬液在无菌操作下取瘤块，称重，用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放入无菌容器内，加生理盐水稀释成1：3的细胞悬液，容器置冰块上，充分混匀。
2.2本发明当归提取物对H22移植性实体瘤的抑制作用取小鼠100只，每只小鼠均于右前腋下接种H22瘤细胞液0.2ml。次日称体质量，并随机分为10组，即生理盐水组、环磷酰胺组、本发明当归提取物组、对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组、对比药物D、对比药物E、对比药物F、对比药物G，每组10只小鼠。接种24h后灌胃给药，灌胃体积为20ml/kg体质量，1次/d，连续给药10d，环磷酰胺组腹腔注射给药，隔日1次。停药后次日处死小鼠称重，并小心剥离瘤组织、胸腺及脾脏，分别称重，并计算抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数。
2.4本发明当归提取物对S180腹水瘤小鼠存活期的影响取小鼠100只，每只小鼠均腹腔接种S180瘤细胞液0.2ml。随机分为10组，即生理盐水组、本发明当归提取物组、对比药物A组、对比药物B组、对比药物C组、对比药物D、对比药物E、对比药物F、对比药物G，每组10只小鼠。接种24h后灌胃给药，灌胃体积为20ml/kg体质量，1次/d，连续给药10d。以接种肿瘤之日算起，记录死亡时间，计算生命延长率。
2.5统计学处理各组数据以均数±标准差（±s）表示，采用F检验进行统计学分析。
3结果
3.1对H22移植性实体瘤的抑制作用本发明当归提取物对H22移植性实体瘤的抑制与生理盐水组相比，本发明当归提取物有显著抑制H22移植性实体瘤生长的作用（P<0.01），并且本发明当归提取物对小鼠体质量的增加没有明显的抑制作用。环磷酰胺虽然抑瘤效果最好，抑瘤率达到68.71%，但是其对小鼠的增长有明显的抑制作用。见表1-1。
表1-1本发明当归提取物对H22移植性实体瘤的抑制作用（±s，n=10）
注：与生理盐水组比较，**P<0.01
3.2对荷瘤小鼠免疫器官的影响见表1-2。
表1-2本发明当归提取物对荷瘤（H22）鼠免疫器官的影响（±s，n=10）
注：与生理盐水组比较，*P<0.05
3.3对S180腹水瘤小鼠存活期的影响见表1-3。
表1-3本发明当归提取物对S180腹水瘤小鼠存活期的影响（±s，n=10）
注：与生理盐水组比较，**P<0.01
4讨论与结论
在肿瘤的临床治疗中，主要应用的仍然是传统的细胞毒类化疗药物。该类药物在发挥疗效的同时，对机体的毒副作用明显，尤其是对免疫力有较大的破坏。实验结果说明，本发明当归提取物具有明显的抗肿瘤作用，其作用效果明显优于其他当归的组分。实验结果同时说明，增强免疫功能是本发明当归提取物抗肿瘤的可能途径之一。本发明当归提取物除了增强机体免疫功能之外，尚有抗氧化、提高机体应激能力等多种活性。
实验二：本发明当归提取物高效液相色谱法质量检测方法研究
1仪器与试药
1.1仪器
高效液相色谱仪（Agilent110高效液相色谱仪及工作站，G1311Aquat泵，G1314紫外检测器）。
1.2试药
6-甲氧基-7-羟基香豆素对照品（中国药品生物制品检定研究院）；本发明中药组合物：参照本发明说明书具体实施方式中的实施例1制备；当归药材（甘肃岷县顺发药材有限公司提供）；甲醇（色谱醇，上海生化工助剂厂）；其他试剂为分析纯。
2方法与结果
2.1处方
当归20kg
2.2制备
（1）将当归粉碎20kg，置烘箱内45℃烘干4h后，加20倍量60%丙酮，于65℃水浴回流提取3次，每次75min，合并提取液，回收丙酮，得到当归总提取物浸膏；
（2）将得到的当归总提取物浸膏以氯仿:甲醇=50:2的混合溶液在45℃水浴条件下搅拌溶解，过滤，滤液在45℃水浴中减压浓缩后进行层析分离；
（3）选用AB-8型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1:8，上样体积7BV，水洗5BV除杂，以乙酸乙酯:丙酮=100:2的洗脱剂8BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，得本发明当归提取物10.4g。
2.36-甲氧基-7-羟基香豆素的含量测定
2.3.1HPLC色谱条件
采用HypersilDs（4.0mm×125mm，5μm）色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-水；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；在该色谱条件下，对照品及样品色谱峰良好，无当归阴性对照对测定无干扰。
2.3.2对照品溶液的制备
精密称取80℃干燥至恒重的6-甲氧基-7-羟基香豆素对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液。
2.3.3供试品溶液与阴性对照液的制备
精密称取本发明当归提取物10g，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液即得；另按处方比例制备不含当归的阴性对照品，同法制成阴性对照液。
2.3.4标准曲线的绘制
精密称取80℃干燥至恒重的6-甲氧基-7-羟基香豆素对照品适量，用甲醇制成10.4，20.8，41.6，83.2，166.4μgmL-1系列浓度的溶液，分别精密量取上述5种浓度溶液各10μL，注入高效液相色谱仪进行测定。
以峰面积比值与浓度进行线性回归，得回归方程为：A=21.2763C-0.1392，r=0.9999。表明6-甲氧基-7-羟基香豆素在10.2～166.8μgmL-1浓度范围内呈良好的线性关系。
2.3.5稳定性试验
精密吸取供试品溶液10μL，分别于0，1，2，4，8h进样，并计算6-甲氧基-7-羟基香豆素含量。结果8h内RSD为0.45%（n=5）。表明样品溶液在8h内稳定。
2.3.6重复性试验
按供试品溶液制备方法平行处理样品5份，依法测定6-甲氧基-7-羟基香豆素含量并计算。结果测得6-甲氧基-7-羟基香豆素平均含量为0.12mg·g-1，RSD为1.3%。
2.3.7精密度实验
精密吸取6-甲氧基-7-羟基香豆素对照品溶液，重复进样5次，依法测定峰面积。结果RSD为0.24%（n=5）。表明精密度较好。
2.3.8回收率实验
精密称取已知6-甲氧基-7-羟基香豆素含量的同一批号的样品6份，按高、中、低浓度分别精密加入适量的6-甲氧基-7-羟基香豆素对照品溶液，按样品测定项下操作，依法测定，计算回收率。结果平均回收率为100.3%，RSD为0.45%（n=5）。
2.3.9样品含量测定
分别量取对照品溶液和供试品溶液适量，用微孔滤膜滤过，各进样10μL，按上述色谱条件测定3批样品，平行测定5次。按外标法以峰面积计算供试品溶液6-甲氧基-7-羟基香豆素的含量。本品含6-甲氧基-7-羟基香豆素应为标示含量的95%～105%，以每1g本品含6-甲氧基-7-羟基香豆素计，不得少于0.12mg。3批样品含量分别为100.8%（RSD=1.2%），101.7%（RSD=1.3%），99.2%（RSD=1.1%）。
实验三：本发明当归提取物气相色谱法同步测定香草醛、马鞭草烯酮的含量
1仪器与试药
Agilent7890N气相色谱仪：FID检测器，A.01.12.1色谱工作站；SGH－300高纯氢气发生器（北京东方精华科技苑科技有限公司）；色谱柱弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；梅特勒－托利多十万分之一电子分析天平；香草醛对照品（含量99.9%，中国食品药品检定研究院）；马鞭草烯酮对照品（含量99.9%，中国食品药品检定研究院）；本发明当归提取物（参照本发明说明书具体实施方式中的实施例1制备），试剂：环己酮，无水乙醇均为色谱纯。
2色谱条件
色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；载气：N2，1.0mL·mL-1；氢气，40mL·mL-1；空气，400mL·min-1；分流比：8：1；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法。
3试验方法与结果
3.1内标溶液的制备
取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1g含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液。
3.2供试品溶液的制备
精密量取本品1.0g，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀。
3.3对照品储备溶液的制备
精密称取香草醛对照品、马鞭草烯酮对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含香草醛0.301mg·mL-1及马鞭草烯酮0.901mg·mL-1的对照品储备溶液，备用；
3.4阴性对照溶液的制备
取按处方中未加香草醛与马鞭草烯酮的空白溶液，按“3.2”项下制备方法，制成阴性对照溶液。
3.5线性关系的考察
分别精密移取0.2、0.5、1.0、1.5、3.5mL对照品储备液于10mL容量瓶中，加内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，分别取1μL进样，记录色谱图，以香草醛、马鞭草烯酮与内标的峰面积比值为纵坐标（Y），浓度（C）为横坐标（X），分别绘制标准曲线，得回归方程分别为：Y（香草醛）=1.1148X－0.0016，R2=0.9999，香草醛浓度在0.144～2.552mg·mL-1范围内，线性关系良好；Y（马鞭草烯酮）=1.1347X+0.0035，R2=0.9999，马鞭草烯酮浓度在0.195～3.466mg·mL-1范围内，线性关系良好。
3.6精密度试验
取香草醛浓度为0.230mg·mL-1和马鞭草烯酮浓度为0.290mg·mL-1的对照品溶液，重复进样6次，记录峰面积，分别计算2种成分与内标的峰面积比值（A/A内标），香草醛、马鞭草烯酮的RSD分别为0.22%和1.3%（n=6）。
3.7重复性试验
取同一批样品，按样品测定项下的方法重复测定6次，结果香草醛、马鞭草烯酮的RSD分别为0.33%、1.6%（n=6）。
3.8稳定性试验
取同一批样品溶液，分别在室温下放置0、2、4、6、8、12h后测定，结果按香草醛、马鞭草烯酮的RSD分别为0.38%、1.7%，说明样品溶液在12h内测定，结果稳定。
3.9加样回收率试验
取已知含量的样品溶液9份，并加入适当的低、中、高对照品溶液，按样品测定法测定香草醛、马鞭草烯酮含量，分别计算回收率，结果见表3-1。
表3-1回收率测定结果（n=9，%）
结果表明，本方法的回收率较好，香草醛的回收率分别在99.4%～100.2%，马鞭草烯酮的回收率在98.1%～100.7%之间，相对标准偏差分别为0.28%与0.86%，本测定方法能满足本发明当归提取物中香草醛与马鞭草烯酮的含量测定。
3.10定量限与检测限
采用“信噪比法”来确定本研究的定量限和检测限，取线性标准溶液适量，采用加无水乙醇逐步稀释法进行稀释，当进样浓度为6.27、9.90μg·mL-1时，取1μL进样，连续进样3次，得到香草醛、内标、马鞭草烯酮信噪比平均值分别接近10.0，可以以此浓度为定量限；继续稀释进样，当进样浓度为1.044、1.65μg·mL-1，连续进样3次，得到香草醛、内标、马鞭草烯酮信噪比平均值接近3.0，可以以此浓度为检测限。
3.11耐用性试验
经不同色谱柱考察和溶液稳定性考察，以及柱温，进样口温度和检测器温度考察，表明本方法耐用性良好，适用于本发明当归提取物中两组分的含量测定。
3.11.1色谱柱的影响
选用3根不同商品规格的色谱柱，测定同一批样品的含量，计算含量值的RSD%分别为1.3、1.7、1.6。结果表明，样品用不同的PEG色谱柱测定含量，香草醛、马鞭草烯酮与内标均可有效分离，说明方法耐用性良好。
3.11.2柱温的影响
柱温对分离的影响主要为影响主峰的出峰时间，温度越高，主峰出峰时间越短，在第一阶段为80℃时，香草醛主峰香草醛与杂质峰能保证基线分离，第二阶段120℃时马鞭草烯酮主峰与杂质峰能保证基线分离，且各温度下含量的RSD小于2.0%。
3.11.3进样口温度的影响
进样口温度高于柱温时，香草醛与杂质峰能够保证基线分离，马鞭草烯酮与杂质分离良好，且各温度下含量的RSD小于2.0%。
3.11.4检测器温度的影响
检测器温度高于进样口温度时，香草醛与杂质峰能够保证基线分离，马鞭草烯酮与杂质分离良好，且各温度下含量的RSD小于2.0%。
3.12样品含量测定结果
经过方法学验证，本含量测定方法操作简便、准确度高、重现性好，能更有效地控制产品质量。因此应用该方法对10批样品，按照前述方法采用内标法进行含量测定，结果见表3-2。
表3-2样品含量测定结果
4讨论
4.1系统适应性试验
在本试验气相色谱系统下，分别吸取样品测定用混合对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各1μL，记录色谱图。2种组分与内标物均能够较好地分离，阴性无干扰。该系统适应性结果见表3-3。
表3-3系统适应性试验
4.2内标物的选择
曾试用过环己酮、萘、联苯、水杨酸甲酯等，因样品挥发性成分多，结果以环己酮的保留时间及分离效果最合适。
4.3柱温的选择
香草醛、环己酮和马鞭草烯酮的沸点相差比较大，柱温低时，马鞭草烯酮的保留时间过长，柱温高时，香草醛与杂质不能有效分离，经采用两段程序升温方式能满足两种成分的同时分析。
4.4本品的含量限度
由10批次产品测定结果，暂定本品的含量限度为：本品每1g含香草醛不得少于0.200mg，含马鞭草烯酮不得少于0.200mg。
本方法对2种成分同时进行分离与检测，方法快速、灵敏，分离度好、专属性好，能有效地控制药品质量。
具体实施方式：
实施例1：
（1）将当归粉碎20kg，置烘箱内45℃烘干4h后，加20倍量60%丙酮，于65℃水浴回流提取3次，每次75min，合并提取液，回收丙酮，得到当归总提取物浸膏；
（2）将得到的当归总提取物浸膏以氯仿:甲醇=50:2的混合溶液在45℃水浴条件下搅拌溶解，过滤，滤液在45℃水浴中减压浓缩后进行层析分离；
（3）选用AB-8型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1:8，上样体积7BV，水洗5BV除杂，以乙酸乙酯:丙酮=100:2的洗脱剂8BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，得本发明当归提取物10.4g。
含量测定：
采用高效液谱法对6-甲氧基-7-羟基香豆素进行含量测定：
（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-水；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；
（2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的6-甲氧基-7-羟基香豆素对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取本发明当归提取物10mL，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测；
（5）测定结果：以每1g本品含6-甲氧基-7-羟基香豆素计，为0.15mg。
采用气相色谱法对香草醛、马鞭草烯酮进行含量测定：
（1）色谱条件：色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱；载气：N2，1.0mL·mL-1；氢气，40mL·mL-1；空气，400mL·min-1；分流比：8：1；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法；
（2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；
（4）对照品溶液的制备：精密称取香草醛对照品、马鞭草烯酮对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含香草醛0.301mg·mL-1及马鞭草烯酮0.901mg·mL-1的对照品储备溶液，备用；
（5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测；
（6）测定结果：本品每1g含香草醛为0.210mg，含马鞭草烯酮为0.212mg。
实施例2：
（1）将当归粉碎20kg，置烘箱内40℃烘干5h后，加15倍量55%丙酮，于60℃水浴回流提取4次，每次70min，合并提取液，回收丙酮，得到当归总提取物浸膏；
（2）将得到的当归总提取物浸膏以氯仿:甲醇=50:2的混合溶液在50℃水浴条件下搅拌溶解，过滤，滤液在50℃水浴中减压浓缩后进行层析分离；
（3）选用AB-8型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1:7，上样体积8BV，水洗4BV除杂，以乙酸乙酯:丙酮=100:2的洗脱剂9BV洗脱，流速为2BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，得本发明当归提取物10.2g。
含量测定：
采用高效液谱法对6-甲氧基-7-羟基香豆素进行含量测定：
（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-水；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；
（2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的6-甲氧基-7-羟基香豆素对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取本发明当归提取物10mL，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测；
（5）测定结果：以每1g本品含6-甲氧基-7-羟基香豆素计，为0.14mg。
采用气相色谱法对香草醛、马鞭草烯酮进行含量测定：
（1）色谱条件：色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱；载气：N2，1.0mL·mL-1；氢气，40mL·mL-1；空气，400mL·min-1；分流比：8：1；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法；
（2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；
（4）对照品溶液的制备：精密称取香草醛对照品、马鞭草烯酮对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含香草醛0.301mg·mL-1及马鞭草烯酮0.901mg·mL-1的对照品储备溶液，备用；
（5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测；
（6）测定结果：本品每1g含香草醛为0.211mg，含马鞭草烯酮为0.213mg。
实施例3：
（1）将当归粉碎20kg，置烘箱内50℃烘干3h后，加25倍量50%丙酮，于70℃水浴回流提取2次，每次80min，合并提取液，回收丙酮，得到当归总提取物浸膏；
（2）将得到的当归总提取物浸膏以氯仿:甲醇=50:2的混合溶液在40℃水浴条件下搅拌溶解，过滤，滤液在40℃水浴中减压浓缩后进行层析分离；
（3）选用AB-8型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1:9，上样体积6BV，水洗6BV除杂，以乙酸乙酯:丙酮=100:2的洗脱剂7BV洗脱，流速为4BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，得本发明当归提取物9.8g。
含量测定：
采用高效液谱法对6-甲氧基-7-羟基香豆素进行含量测定：
（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-水；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；
（2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的6-甲氧基-7-羟基香豆素对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取本发明当归提取物10mL，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测；
（5）测定结果：以每1g本品含6-甲氧基-7-羟基香豆素计，为0.14mg。
采用气相色谱法对香草醛、马鞭草烯酮进行含量测定：
（1）色谱条件：色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱；载气：N2，1.0mL·mL-1；氢气，40mL·mL-1；空气，400mL·min-1；分流比：8：1；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法；
（2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；
（4）对照品溶液的制备：精密称取香草醛对照品、马鞭草烯酮对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含香草醛0.301mg·mL-1及马鞭草烯酮0.901mg·mL-1的对照品储备溶液，备用；
（5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测；
（6）测定结果：本品每1g含香草醛为0.223mg，含马鞭草烯酮为0.218mg。
实施例4：片剂
取当归提取物，加入适量淀粉，混匀，制成颗粒，干燥，压制成片，包衣，即得。
实施例5：片剂
取当归提取物，加入适量糊精，混匀，压片，即得。
实施例6：硬胶囊剂
取当归提取物，加入适量糊精，混匀，制成颗粒，装入胶囊，制成硬胶囊剂，即得。
Claims (10)
1.一种具有抗肿瘤作用的当归提取物，其特征在于，该当归提取物是采用如下方法制备的：
（1）将当归粉碎，置烘箱内40℃～50℃烘干3h～5h后，加15～25倍量50%～60%丙酮，于60℃～70℃水浴回流提取2次～4次，每次70min～80min，合并提取液，回收丙酮，得到当归总提取物浸膏；
（2）将得到的当归总提取物浸膏以氯仿:甲醇=50:2的混合溶液在40℃～50℃水浴条件下搅拌溶解，过滤，滤液在40℃～50℃水浴中减压浓缩后进行层析分离；
（3）选用AB-8型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1:7～9，上样体积6BV～8BV，水洗4BV～6BV除杂，以乙酸乙酯:丙酮=100:2的洗脱剂7BV～9BV洗脱，流速为2BV/h～4BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。
2.如权利要求1所述的当归提取物，其特征在于，该当归提取物是采用如下方法制备的：
（1）将当归粉碎，置烘箱内40℃烘干5h后，加15倍量55%丙酮，于60℃水浴回流提取4次，每次70min，合并提取液，回收丙酮，得到当归总提取物浸膏；
（2）将得到的当归总提取物浸膏以氯仿:甲醇=50:2的混合溶液在50℃水浴条件下搅拌溶解，过滤，滤液在50℃水浴中减压浓缩后进行层析分离；
（3）选用AB-8型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1:7，上样体积8BV，水洗4BV除杂，以乙酸乙酯:丙酮=100:2的洗脱剂9BV洗脱，流速为2BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。
3.如权利要求1所述的当归提取物，其特征在于，该当归提取物是采用如下方法制备的：
（1）将当归粉碎，置烘箱内50℃烘干3h后，加25倍量50%丙酮，于70℃水浴回流提取2次，每次80min，合并提取液，回收丙酮，得到当归总提取物浸膏；
（2）将得到的当归总提取物浸膏以氯仿:甲醇=50:2的混合溶液在40℃水浴条件下搅拌溶解，过滤，滤液在40℃水浴中减压浓缩后进行层析分离；
（3）选用AB-8型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1:9，上样体积6BV，水洗6BV除杂，以乙酸乙酯:丙酮=100:2的洗脱剂7BV洗脱，流速为4BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。
4.如权利要求1所述的当归提取物，其特征在于，该当归提取物是采用如下方法制备的：
（1）将当归粉碎，置烘箱内45℃烘干4h后，加20倍量60%丙酮，于65℃水浴回流提取3次，每次75min，合并提取液，回收丙酮，得到当归总提取物浸膏；
（2）将得到的当归总提取物浸膏以氯仿:甲醇=50:2的混合溶液在45℃水浴条件下搅拌溶解，过滤，滤液在45℃水浴中减压浓缩后进行层析分离；
（3）选用AB-8型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1:8，上样体积7BV，水洗5BV除杂，以乙酸乙酯:丙酮=100:2的洗脱剂8BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。
5.如权利要求1～4中任意一项所述的当归提取物，其特征在于，采用高效液相色谱法对6-甲氧基-7-羟基香豆素进行含量测定：
（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为20～40：60～80的乙腈-水；检测波长：190～210nm；柱温：15～25℃；流速：0.5～1.5mL·min-1；进样量：5～20μL；
（2）对照品溶液制备：精密称取干燥至恒重的6-甲氧基-7-羟基香豆素对照品适量，加甲醇溶解制成对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取本发明当归提取物，加甲醇，加热回流，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各5～20μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
6.如权利要求5所述的当归提取物，其特征在于，采用高效液谱法对6-甲氧基-7-羟基香豆素进行含量测定：
（1）色谱条件：采用HypersilDs色谱柱；流动相：比例为30：70的乙腈-水；检测波长：200nm；柱温：20℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；
（2）对照品溶液制备：精密称取80℃干燥至恒重的6-甲氧基-7-羟基香豆素对照品适量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取本发明当归提取物10mL，加甲醇40mL，加热回流4h，提取液回流溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行检测。
7.如权利要求1～4中任意一项所述的当归提取物，其特征在于，采用气相色谱法对香草醛、马鞭草烯酮进行含量测定：
（1）色谱条件：色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱；载气：N2，0.5～1.5mL·mL-1；氢气，30～50mL·mL-1；空气，300～500mL·min-1；分流比：5～15：1；进样口温度：240～260℃，检测器温度：290～310℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法；
（2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成溶液，摇匀，作为内标溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密量取本品，置容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取，置容量瓶中，精密加入内标溶液，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；（4）对照品溶液的制备：精密称取香草醛对照品、马鞭草烯酮对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含香草醛及马鞭草烯酮的对照品储备溶液，备用；
（5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各5～20μL，注入气相色谱仪，进行检测。
8.如权利要求7所述的当归提取物，其特征在于，采用气相色谱法对香草醛、马鞭草烯酮进行含量测定：
（1）色谱条件：色谱柱：ZB-WAX弹性石英毛细管柱；载气：N2，1.0mL·mL-1；氢气，40mL·mL-1；空气，400mL·min-1；分流比：8：1；进样口温度：250℃，检测器温度300℃；程序升温：初始80℃，每分钟5℃升至120℃，每分钟10℃升至180℃，保持3.5min；内标法；
（2）内标溶液的制备：取环己酮适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1mL含12.5mg的溶液，摇匀，作为内标溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入内标溶液1.0mL，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀；
（4）对照品溶液的制备：精密称取香草醛对照品、马鞭草烯酮对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成含香草醛0.301mg·mL-1及马鞭草烯酮0.901mg·mL-1的对照品储备溶液，备用；
（5）测定：分别精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入气相色谱仪，进行检测。
9.如权利要求1～4任意一项所述的当归提取物，其特征在于，该当归提取物采用药学中常规的制药方法制备成口服药物制剂。
10.如权利要求1～4任意一项所述的当归提取物在制备治疗胆囊息肉药物或保健品中的应用。
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- 2016-01-26 CN CN201610050553.7A patent/CN105535050B/zh not_active Expired - Fee Related
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