CN106580937B - 月腺大戟素a的制备方法及其在制备乳腺癌药物中的应用 - Google Patents

月腺大戟素a的制备方法及其在制备乳腺癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及月腺大戟素A的制备方法及其在制备乳腺癌药物中的应用，提取工艺为对狼毒大戟药材粉末采用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇进行萃取。接着通过硅胶柱层析法对上述部位进行分离，制备方法简单快捷，重现性好，提取纯度高，获得的化合物中，二苯基甲烷类化合物具有较好的抗乳腺癌细胞活性作用，而2,4‑二羟基‑6‑甲氧基‑3‑甲基‑1‑苯乙酮无明显的抗乳腺癌细胞活性作用。由此可见，具有二苯基甲烷母核的化合物能明显抑制乳腺癌细胞活性，该类型化合物具有一定构效关系。

Description

月腺大戟素A的制备方法及其在制备乳腺癌药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体是从天然产物中筛选出抗乳腺癌细胞活性成分。
背景技术
乳腺癌为女性最常见的恶性肿瘤之一，其较高的发病率和逐渐上升的死亡率一直为全球关注的疾病。据2011年全球癌症统计报告显示，2008年全球乳腺癌新发病人数达到138.4万，占恶性肿瘤新发病总数的23.0％，而致死人数则高达45.9万，一些较发达的国家世界人口年龄标准化发病率为66.4/10万，而发展中国家则为27.3/10万。国内女性乳腺癌发病率占据女性癌症发病率的第1位，死亡率占据女性癌症死亡率的第6位。由于目前乳腺癌发病率以平均每年0.5％的趋势增长，估计到2030年，全球乳腺癌的发病人数和死亡人数将分别达到264万和170万。同时，调查也显示乳腺癌的发病年龄趋于年轻化，国内女性乳腺癌患者发病的中位年龄是48岁，比西方国家提早了10年(马纯华，颜君，孙邓南等.乳腺癌患者社会支持的研究现状.现代临床护理.2013，12(10)61-64)。目前治疗乳腺癌的药物可分类为天然活性成分，化学类药物以及常用的联合用药。化学类药物以环磷酰胺，卡培他滨，5-氟尿嘧啶等为主，天然的活性成分主要包括紫杉醇，姜黄素，长春新碱，芹黄素，三氧化二砷等(韩伟，阎雪莹，丁文财，等.抗乳腺癌药物的研究现状.黑龙江医药.2014，27(5)：1027-1029)，其中化学类药物所致不良反应的发生率之高，不容忽视，最主要表现为骨髓抑制，胃肠道的反应，同时还降低患者免疫力，引起恶心和呕吐等。天然活性成分紫杉醇从红豆杉中提取而来，虽对乳腺癌等恶性肿瘤有显著疗效，但红豆杉作为国家一级珍惜濒危保护植物，资源有限，且毒性较大。因此开发毒副作用小，资源丰富的化合物越来越受到青睐。
我国传统中药狼毒为大戟科植物狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.或月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata的干燥根，狼毒大戟主产于辽宁，吉林，黑龙江，河北等地。狼毒始载于《神农本草经》，其味辛，性平，有毒，归肝、脾经，有逐水祛痰，散结杀虫之功效，主治水肿腹胀，痰、食、虫积、心腹疼痛、咳喘、瘰疬、痰核、疥癣、灭蝇蛆。民间将狼毒广泛用于抗肿瘤，抗结核及皮肤病的治疗，既往研究或临床实践表明狼毒提取物对肝癌及肺癌的作用效果显著(柯华红，王华倩，等.月腺大戟与狼毒大戟对人肝癌细胞BEL-7402体外增值的影响对比研究.中国药房.2012,23(15):1359-1361；姜红.狼毒大戟对小鼠Lewis肺癌增值及转移的影响.实用医药杂志.2013,30(9):808-810)，但对乳腺癌的研究鲜有报道。目前对肝癌治疗的主要包括，针对表皮生长因子受体传导通路的靶向治疗，例如吉非替尼，厄罗替尼和西妥昔单抗，针对血管内皮生长因子的靶向治疗，包括贝伐单抗，沙利度胺等，以及多靶点治疗药物索拉非尼，该药物可同时起到抗血管生成和抗肿瘤细胞增殖的双重作用(陈敏山，张耀军，等.肝癌分子靶向药物治疗的研究进展.中华消化外科杂志.2009,8(2):96-97)。对肺癌治疗的主要包括多靶点药物索拉非尼，舒尼替尼，培美曲塞等(刘旭春，蒋国华.非小细胞肺癌多靶点药物治疗研究进展.Journal of Oncology.2010,16(12):918-921)。而传统治疗乳腺癌的药物主要有环磷酰胺，5-氟尿嘧啶，紫杉醇等，和以人类表皮生长因子受体2为靶点的新型乳腺癌治疗药物赫赛汀，拉帕替尼，帕妥珠单克隆抗体等(唐静，祖旭宇.乳腺癌靶向治疗药物的研究进展.中国药房.2011,22(41):3909-3911)。由此可见，作用于肝癌，肺癌与乳腺癌的的药物，虽抗肿瘤作用机制相似，但代表药物各不相同。目前从狼毒大戟中分离提取得到的化学成分种类较多，主要有二萜，三萜，香豆素，苯乙酮类化合物等(马良，王欢，王金兰，等.狼毒大戟地上部分化学成分研究.齐齐哈尔大学学报.2012,28(6):27-29)，其二萜类化合物虽为主要的活性成分，但化合物本身具有毒性限制了其发展(Yuping Tang,Wei Jiang,Qicheng Wu,et al.Comparative characteristicof the inflammatory diterpenes in the roots of Euphorbia fischeriana withdifferent preparation method using HPLC-ELSD.Fitoterapia.2012,(83):427-433)。本发明采用现代生物活性筛选模型，从狼毒大戟中首次提取分离得到的二苯基甲烷类化合物，来源丰富，毒副作用低，抗乳腺癌活性好，为进而开发成为对乳腺癌有较好治疗效果的新型药物，具有重要的意义。
月腺大戟素A(ebracteolatain A)，二苯基甲烷化合物，3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-5'-甲基二苯基甲烷(邓彬，穆淑珍，郝小江.月腺大戟的化学成分.中国天然药物.2010,8(3):183-185)，目前尚无药理活性方面研究报道。
发明内容
本发明的目的是对狼毒大戟进行系统性分离提取，并完成了不同提取物的体外抗乳腺癌细胞实验，筛选出狼毒大戟中抗乳腺癌细胞的有效单体成分，而单体成分诱导凋亡的机制还有待进一步的研究。
本发明第一方面提供了月腺大戟素A在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
优选的，所述的乳腺癌细胞株为三阴性乳腺癌MDA-MB-231，Sum149，LuminalA型MCF-7，LuminalB型ZR-75-1，Her 2阳性型SKBr3，BT474。
本发明第二方面提供了上述月腺大戟素A的提取方法，具体按照下述步骤进行：
30kg干燥狼毒大戟药材，粉碎后浸泡在80％乙醇回流提取2次，每次2小时，溶剂用量分别为180L和150L。合并提取液，趁热过滤，合并浓缩至无乙醇残留，浓缩体积至8L。取2L浓缩液加1L水稀释，依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次萃取溶剂均为3L，减压回收溶剂，最终得乙酸乙酯部分160g，乙酸乙酯部分过正相硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，15:1，10：1，5:1，1:1洗脱，得Fr.1-Fr.7(Fr.1-Fr.7分别为不同洗脱梯度石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，15:1，10：1，5:1，1:1洗脱得到的溶液)；
18gFr.3过正相柱，石油醚：乙酸乙酯：甲酸25:1:0.1，20:1:0.1，15:1:0.1，10:1:0.1,5:1:0.1,1:1:0.1梯度洗脱，其中石油醚：乙酸乙酯：甲酸15:1:0.1洗脱得月腺大戟素A。
得到的单体化合物是通过MS，NMR等测定其结构。
本发明的益效是：
1.本发明通过醇提，各极性溶剂萃取，正相柱层析，重结晶等，从狼毒大戟中首次获得月腺大戟素A，制备过程均为常规单体提取分离方法，具有操作简单，重现性好，化合物得率高等优点。
2.本发明得到的月腺大戟素A与现有的临床药物相比较，不仅有明显的抗乳腺癌活性，单体易溶解，无毒性的优点，而且来自传统中药狼毒大戟，资源丰富，具有较好的实际操作意义。
3.本发明得到的月腺大戟素A，抗乳腺癌细胞活性明显优于其他化合物，差异表现为月腺大戟素A>3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷，而3,3'-二乙酰基-4,4'-二甲氧基-2,2',6,6'-四羟基-二苯基甲烷和2,4-二羟基-6-甲氧基-3-甲基-1-苯乙酮并无明显抗乳腺癌细胞活性。从构效关系上分析，二苯基甲烷结构为抑制乳腺癌细胞活性的关键，当二苯环上有甲基取代，其抗乳腺癌细胞活性的能力明显增强。当然，二苯基甲烷类化合物中两个苯环上取代基呈对称结构时，化合物无明显抗乳腺癌细胞活性；单环苯基母核，甲基取代也未显示出抗乳腺癌细胞活性的作用。
获得的化合物中，二苯基甲烷类化合物具有较好的抗乳腺癌细胞活性作用，且苯环上有甲基取代的月腺大戟素A抗乳腺癌细胞活性明显优于3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷。而3,3'-二乙酰基-4,4'-二甲氧基-2,2',6,6'-四羟基-二苯基甲烷虽具有二苯基甲烷母核结构，但却无抗肿瘤活性，推测因其中二苯基甲烷上取代基的对称结构，所以该化合物无抗乳腺癌活性，同时，2,4-二羟基-6-甲氧基-3-甲基-1-苯乙酮无明显的抗乳腺癌细胞活性作用。由此可见，具有二苯基甲烷母核，且苯基取代无对称性的化合物能明显抑制乳腺癌细胞活性，该类型化合物具有一定构效关系。
附图说明
图1为3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-5'-甲基二苯基甲烷的1H-NMR；
图2为3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-5'-甲基二苯基甲烷的13C-NMR；
图3为3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷的1H-NMR；
图4为3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷的13C-NMR；
图5为3,3'-二乙酰基-4,4'-二甲氧基-2,2',6,6'-四羟基-二苯基甲烷的1H-NMR；
图6为3,3'-二乙酰基-4,4'-二甲氧基-2,2',6,6'-四羟基-二苯基甲烷的13C-NMR；
图7为2,4-二羟基-6-甲氧基-3-甲基-1-苯乙酮的1H-NMR；
图8为2,4-二羟基-6-甲氧基-3-甲基-1-苯乙酮的13C-NMR。
具体实施方式
现结合实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
实施例1：从狼毒大戟中制备单体化合物的方法
30kg干燥狼毒大戟药材，粉碎后浸泡在80％(乙醇：水80:20)乙醇回流提取2次，每次2小时，溶剂用量分别为180L和150L。合并提取液，趁热过滤，合并浓缩至无乙醇残留，浓缩体积至8L。取2L浓缩液加1L水稀释，依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次萃取溶剂均为3L，减压回收溶剂，得石油醚部分60g，乙酸乙酯部分160g，正丁醇部位20g。
乙酸乙酯部分过正相硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，15:1，10：1，5:1，1:1洗脱，得Fr.1-Fr.7。
取12gFr.2过正相柱，依次以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1洗脱，20：1洗脱部分再经过正相硅胶柱，用石油醚：二氯甲烷10:1洗脱，再经乙酸乙酯多次结晶得15mg单一化合物，通过MS，NMR等测定其结构为3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷。3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷的1H-NMR和13C-NMR见图1和2，EI/MS m/z 376[M]+,NMR值见表1，化学结构式如Ⅰ所示：
取18gFr.3过正相柱，石油醚：乙酸乙酯：甲酸25:1:0.1，20:1:0.1，15:1:0.1，10:1:0.1,5:1:0.1,1:1:0.1梯度洗脱，15:1:0.1洗脱得17mg单一化合物，通过MS，NMR等测定其结构3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-5'-甲基二苯基甲烷(月腺大戟素A)。3,3'-二乙酰基-2,4'-二甲氧基-2',4,6,6'-四羟基-二苯基甲烷的1H-NMR和13C-NMR见图3和4，EI/MS m/z 390[M]+，NMR值见表1，化学结构式如Ⅱ所示：
表1 化合物1和2的NMR信号归属
对比例
1.月腺大戟药材30kg粉碎后，用80％乙醇于65℃下热提2次，每次2小时，第一次溶剂用量为200L，第二次为150L。提取液分别趁热过滤，合并浓缩至无醇残留，浓缩至体积为7L。取浓缩液2L，用乙酸乙酯萃取三次，每次萃取溶剂体积为2L。合并乙酸乙酯萃取层，浓缩干燥得乙酸乙酯萃取物135g。
乙酸乙酯部位125g用1kg硅胶拌样，上正相硅胶柱层析，依次以石油醚-乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1进行梯度洗脱，得到Fr.1-Fr.7。取5.4g Fr.5上正相柱层析，以石油醚：乙酸乙酯20:1洗脱，得29mg单体化合物。通过MS，NMR等测定其结构3,3'-二乙酰基-4,4'-二甲氧基-2,2',6,6'-四羟基-二苯基甲烷(化合物3)。化合物3的1H-NMR和13C-NMR见图5和6，EI/MS m/z 376[M]+，NMR值见表2，化学结构式如下III所示：
表2 化合物3的NMR信号归属
2. 30kg干燥狼毒大戟药材，粉碎后浸泡在80％(乙醇：水80:20)乙醇回流提取2次，每次2小时，溶剂用量分别为180L和150L。合并提取液，趁热过滤，合并浓缩至无乙醇残留，浓缩体积至8L。取2L浓缩液加1L水稀释，依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次萃取溶剂均为3L，减压回收溶剂，得石油醚部分60g，乙酸乙酯部分160g，正丁醇部位20g。
乙酸乙酯部分过正相硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，15:1，10:1，5:1，1:1洗脱，得Fr.1-Fr.7。
取7gFr.5过正相柱，石油醚：乙酸乙酯：甲酸15:1:0.5，12:1:0.5，9:1:0.5，6:1:0.5，3:1:0.5，1:1:0.5梯度洗脱，其中6:1:0.5洗脱得到某一单体化合物后，剩余部分合并再次过正相柱，以石油醚：乙酸乙酯：甲酸4:1:0.1洗脱得26mg单体化合物，通过MS，NMR等测定其结构2,4-二羟基-6-甲氧基-3-甲基-1-苯乙酮(狼毒乙素，化合物4)。化合物4的1H-NMR和13C-NMR见图7和8，EI/MS m/z 196[M]+，NMR值见表3，化学结构式如下IV所示：
表3 化合物4的NMR信号归属
实施例2：体外抗乳腺癌细胞实验
MTT法评价细胞毒性，选取6种型号乳腺癌细胞进行研究，分别为三阴性乳腺癌MDA-MB-231，Sum149，LuminalA型MCF-7，LuminalB型ZR-75-1，Her 2阳性型SKBr3，BT474。紫杉醇为阳性对照药。将上述6种乳腺癌细胞密度调整为5×104个/ml，接种到96孔培养板中，每孔接种100μL细胞悬液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜，观察细胞贴壁且生长良好后，设置阳性对照组，肿瘤细胞对照组和各个不同浓度药物的实验组。实验组加入8个梯度浓度的样品溶液，化合物1和2母液浓度为5mM，紫杉醇母液浓度为3.5mM，化合物2的样品溶液配制过程为通过稀释母液浓度125倍，167倍，200倍，250倍，333倍，再将母液稀释至50μM，继续稀释5倍，12.5倍，25倍，以上述稀释后得到的8个浓度梯度作用于6种乳腺癌细胞(给药后终浓度分别为20，15，12.5，10，7.5，5，2，1μM)；化合物1除作用于肿瘤细胞MDA-MB-231细胞，是通过将母液浓度稀释41.7倍，62.5倍，83.3倍，125倍，166.7倍，再将母液稀释至50μM，继续稀释2.5倍，5倍，12.5倍，得到8个梯度浓度的样品溶液以外(给药后终浓度分别为60，40，30，20，15，10，5，2μM)，作用于其余五种细胞的稀释方法同化合物2的处理方法；而阳性药紫杉醇是先将母液稀释87.5倍，116倍，再将母液稀释至350μM，然后稀释14倍，17.5倍，23.3倍，35倍，再将母液稀释至35μM，然后稀释8.75倍，17.5倍(给药后终浓度分别为20，15，12.5，10，7.5，5，2，1μM)，试剂空白对照组加等量培养基，肿瘤细胞对照组加等量PBS溶液，每个剂量设6个平行孔。分别置于37℃、5％CO2培养箱中培养72小时，之后每孔加入MTT液(5g/L)20μL。继续培养4小时，吸去上清液，每孔加入100μLDMSO，避光，低速震荡15min，使结晶充分溶解。
用酶标仪(波长492nm)测定吸光度(OD)值，计算不同浓度的化合物对乳腺癌细胞的抑制率。细胞抑制率＝(加药组OD值-调零孔OD值)/(对照组OD值-调零孔OD值)。由此计算72h细胞半数抑制浓度，结果如表4所示。
对比例
发明人同时选取了实施例1对比例中二个化合物，二苯基甲烷类化合物3,3'-二乙酰基-4,4'-二甲氧基-2,2',6,6'-四羟基-二苯基甲烷(化合物3)和具有单环结构的2,4-二羟基-6-甲氧基-3-甲基-1-苯乙酮(化合物4)进行上述的体外抗乳腺癌细胞实验，72h细胞半数抑制浓度如表4所示。
表4 MTT法测定4个化合物及阳性药紫杉醇对各乳腺癌细胞生长的影响(72h半数抑制浓度)
附：-没有活性；
20μM(30％)表示给药浓度20μM时抑制率为30％。
结论：
采用MTT法选用6种乳腺癌细胞来测试四个化合物的抗乳腺癌活性，其中化合物1和2显示出明显的抗乳腺癌活性，其中化合物2月腺大戟素A活性最高，而化合物3和4不具有体外抗乳腺癌活性。从构效关系上来看，二苯基甲烷结构是发挥抗乳腺癌细胞活性的基础，但二苯基甲烷结构中取代基完全对称的化合物3未显示抗乳腺癌细胞活性，仅有单苯环的化合物4也未显示抗乳腺癌细胞活性，同时二苯基甲烷结构上有甲基取代有助于增强其抗肿瘤活性的能力。
月腺大戟素A，制备方法简便，抗乳腺癌细胞活性好，对开发成为新型抗乳腺癌药物，具有重要的意义。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (3)

1.月腺大戟素A在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的月腺大戟素A在制备治疗乳腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的乳腺癌细胞株为三阴性乳腺癌MDA-MB-231、Sum149、LuminalA型MCF-7、LuminalB型ZR-75-1、Her 2阳性型SKBr3或BT474。
3.根据权利要求1所述的月腺大戟素A在制备治疗乳腺癌药物中的应用，其特征在于，所述月腺大戟素A的提取方法，具体按照下述步骤进行：
30kg干燥狼毒大戟药材，粉碎后浸泡在80％乙醇回流提取2次，每次2小时，溶剂用量分别为180L和150L；合并提取液，趁热过滤，合并浓缩至无乙醇残留，浓缩体积至8L；取2L浓缩液加1L水稀释，依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次萃取溶剂均为3L，减压回收溶剂，最终得乙酸乙酯部分160g，乙酸乙酯部分过正相硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯100:1，50:1，20:1，15:1，10：1，5:1，1:1洗脱，得Fr.1-Fr.7；
18gFr.3过正相柱，石油醚：乙酸乙酯：甲酸25:1:0.1，20:1:0.1，15:1:0.1，10:1:0.1,5:1:0.1,1:1:0.1梯度洗脱，其中石油醚：乙酸乙酯：甲酸15:1:0.1洗脱得月腺大戟素A。
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Two novel phloroglucinol derivatives from Euphorbia ebracteolata hayata;Guang-Miao Fu,et al.;《Journal of Asian Natural Products Research》;20070125;第8卷(第1-2期);全文
月腺大戟的化学成分;邓彬等;《中国天然药物》;20100531;第8卷(第3期);第183-185页
狼毒大戟的化学成分;王晓阳等;《中国天然药物》;20120720;第10卷(第4期);第299-302页

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