CN101284835B

CN101284835B - 双倍半萜内酯类化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101284835B
Application number: CN2008100385687A
Authority: CN
Inventors: 张卫东; 金慧子; 单磊; 苏娟; 柳润辉; 李慧梁; 覃江江
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2008-06-05
Filing date: 2008-06-05
Publication date: 2010-06-16
Anticipated expiration: 2028-06-05
Also published as: CN101284835A

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体为一种双倍半萜类化合物及其制备方法和应用。该双倍半萜类化合物从旋覆花中提取分离得到，分别为双旋覆花内酯甲(Japonicone A)、双旋覆花内酯乙(Japonicone B)、双旋覆花内酯丙(Japonicone C)。经实验研究表明，该类化合物对多种人肿瘤细胞具有良好的抑制活性，对炎症具有显著的抑制作用，因此，可以用于制备抗肿瘤药物和抗炎症药物。

Description

双倍半萜内酯类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种从植物旋覆花中分离得到的三个新的双倍半萜内酯类化合物双旋覆花内酯甲(Japonicone A)、双旋覆花内酯乙(Japonicone B)、双旋覆花内酯丙(Japonicone C)及其制备方法和应用。

背景技术

旋覆花属(Inula L.)植物是菊科(Compositae)中的一属，全世界约有100种，分别于亚洲、欧洲和非洲，以地中海地区为主。我国有20余种，本属多种植物常供药用，如土木香(I.helenium)可作为健胃、利尿、祛痰和驱虫药；大花旋覆花(I.britannica)具有消痰、下气、软坚、行水等功效。倍半萜类化合物是本属植物的特征性成分，以桉烷型、吉马烷型和愈创木烷型为主，还包括伪愈创木烷型、裂环桉烷型、榄烷型、苍耳烷型和少量的无环倍半萜及倍半萜二聚体。研究表明，该属植物中的倍半萜类化合物具有驱虫杀虫、抗菌抗肿瘤、抗病毒、免疫抑制的功效。

旋覆花(Inula japonica)又名金佛花，金佛草(江浙)，六月菊(河北)。多年生草本。根状茎短，横走或斜生，有多少粗壮的须根。分布在我国北部、东北部、中部、东部、四川、广东等地。我国通称的旋覆花应是此种，供药用。根及叶治刀伤、疔毒，煎服可平喘镇咳；花是健胃祛痰药，也治疗胸中痞闷、胃部膨胀、嗳气、咳嗽、呕逆等(《江苏省药材志》)。古方祛痰、除湿、利肠，又为治水肿的主要药。我们对采自安徽亳州的旋覆花进行了系统的化学成分研究，以期明确其化学成分，为天然药物化学研究积累资料；发现具有良好活性的天然产物，为后续深入的研究开发提供物质基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的双倍半萜内酯类天然化合物及其制备方法和其在制备抗肿瘤、抗炎药物中的应用。

本发明提供的双倍半萜内酯类化合物是从旋覆花(生长于安徽亳州)中提取分离得到，分别命名为双旋覆花内酯甲(Japonicone A)、双旋覆花内酯乙(Japonicone B)、双旋覆花内酯丙(Japonicone C)，其化学结构式如下：

上述化合物的制备方法如下：

(1)提取：将旋覆花地上部分干燥，粉碎，以80～95％乙醇室温浸泡提取3～4次，每次12～24小时；合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，加水稀释，然后，先以石油醚萃取，再以二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集二氯甲烷部位；

(2)分离：将上述二氯甲烷部位应用硅胶柱色谱，以体积比为100∶1～2∶1的二氯甲烷/甲醇系统梯度洗脱，薄层色谱检测，分别收集含有双旋覆花内酯甲、双旋覆花内酯乙和双旋覆花内酯丙的流分，再经葡聚糖凝胶柱色谱，以体积比为1∶1的二氯甲烷/甲醇洗脱，最后经液相色谱制备，得双旋覆花内酯甲、双旋覆花内酯乙和双旋覆花内酯丙。

本发明的双倍半萜内酯类化合物Japonicone A为片状结晶，由电喷雾离子质谱信号m/z 535[M-H]^-，高分辩质谱得该化合物精密质量数为559.2676[M+Na]⁺，推算其分子式为C₃₂H₄₀O₇；本发明的双倍半萜内酯类化合物Japonicone B为白色粉末，由电喷雾离子质谱信号m/z 535[M-H]^-，高分辩质谱得该化合物精密质量数为559.2670[M+Na]⁺，推算其分子式为C₃₂H₄₀O₇；本发明的双倍半萜内酯类化合物Japonicone C为白色粉末，由电喷雾离子质谱信号m/z 493[M-H]^-，高分辩质谱得该化合物精密质量数为517.2567[M+Na]⁺，推算其分子式为C₃₀H₃₈O₆。以上三个化合物的结构通过¹H-NMR，¹³C-NMR，2D-NMR以及X-衍射等手段进行确证。¹H和¹³C核磁共振数据见表1：

表1Japonicone A、C和D的¹H和¹³C核磁共振数据

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：

将干燥的旋覆花(I.japonica)地上部分20.0kg粉粹，室温下用95％的乙醇提取3次，每次分别用时24，12，12小时。将所得粗提物925.3g加适量水稀释后，依次用石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取，收集二氮甲烷部位。将得到的二氯甲烷萃取物84.5g用200-300目的薄层硅胶分离，用CH₂Cl₂-MeOH(100∶1，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，)进行梯度洗脱。薄层色谱检测，分别收集其中含有双旋覆花内酯甲、乙和丙的流分，再采用Sephadex LH-20进行分离，用CH₂Cl₂-MeOH(1∶1)进行洗脱，得到混合物，香草醛浓硫酸显色为倍半萜类化合物，采用prep HPLC分离得到双旋覆花内酯甲(Japonicone A)273mg，双旋覆花内酯乙(Japonicone B)80mg，双旋覆花内酯丙(Japonicone C)52mg。

实施例2：双旋覆花内酯甲、乙和丙的细胞毒活性实验

1、实验材料

1.1、受试样品

Japonicone A、Japonicone B、Japonicone C用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成1000μg/ml的溶液或均匀的混悬液，然后用含DMSO的PBS(-)稀释。

1.2、细胞株

A549(人肺癌细胞)，

LOVO(人肠癌细胞)，

6T-CEM(人T细胞白血病细胞)，

MDA-MB-435(人乳腺癌细胞)，

1.3、培养液

RPMI1640+15％NBS+双抗，

1.4、其他材料

全自动酶标仪：型号：WellscanMK-2，生产厂商：Labsystems，

进口96孔培养板等。

2、试验方法

MTT法：96孔板每孔加入浓度为4～6×10⁴个/ml的细胞悬液100μl，置37℃，5％CO₂培养箱内。24h后，加入样品液，10μl/孔，设双复孔，37℃，5％CO₂作用72h。每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，作用4h后加入溶解液，100μl/孔，置培养箱内，溶解后用MK-2全自动酶标仪测570nm OD值。

3、试验结果

结果见表2，结果显示，Japonicone A、Japonicone B、Japonicone C对人肺癌细胞，人肠癌细胞，人T细胞白血病细胞，人乳腺癌细胞均有较好的抑制活性，双旋覆花内酯甲、乙和丙都有很好的抗肿瘤作用，因此，可以用于制备抗肿瘤药物。

实施例3：双旋覆花内酯甲、乙和丙对小鼠S180肉瘤(实体型)的疗效实验

1、实验材料

1.1受试样品

Japonicone A、Japonicone B、Japonicone C分别用少量吐温-80助溶后用0.5％CMC配成溶液。

1.2动物

品系：昆明种小鼠

来源：第二军医大学实验动物中心提供。

合格证号：沪动合证字107号

体重：18-20g

性别：雌性。

1.3移植性肿瘤

小鼠S180肉瘤，由上海医药工业研究院传代维持。

2、实验方法

取生长良好的小鼠S180肉瘤腹水，用生理盐水以1∶4稀释，每只小鼠腋皮下接种0.2ml，随机分组，分为对照组，环磷酰胺组(CTX组，20mg/kg，ip×7)、给药(5mg/kg)组，接种后次日起给药，给药体积为0.5ml/20g体重，连续灌胃7天。接种后10日脱颈处死动物，称动物体重后解剖取瘤块，称瘤重。结果判定根据以下公式：

3、实验结果

Japonicone A、Japonicone B、Japonicone C有显著的抑瘤作用。实验结果见表3。

表3JaponiconeA、Japonicone B、Japonicone C对小鼠S180肉瘤的抑制作用

与对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

实施例4：双旋覆花内酯甲、乙和丙抗炎实验小鼠耳肿胀模型

1实验动物

Swiss种小鼠，雄性，体重20-24g。

2.实验模型和测试方法

取小鼠110只，随机分成11组，按表4所示的剂量灌胃给药3d，于末次给药后1h，用0.05ml的二甲苯将小鼠左耳致炎，用直径为7mm的打孔器将双耳重叠打孔，将打下的圆片在扭力天平(灵敏度为万分之一)上称量，用鼠耳两圆片的重量差表示其肿胀度。

3统计分析：

全部实验结果均以均数±标准误表示。用student t-检验比较各组数据与空白组的显著性差异，P＜0.05，表示差异有显著性意义。

4试验结果：

表4.双旋覆花内酯甲、乙和丙对小鼠耳肿胀试验的影响

与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果表明，阳性对照药氢化可的松、双旋覆花内酯甲、双旋覆花内酯乙和双旋覆花内酯丙对小鼠耳肿胀模型引起的炎症有显著的抑制作用。因此，本发明提供的化合物可用于制备抗炎症的药物。

实施例5：双旋覆花内酯甲、乙和丙抗炎实验大鼠角叉菜胶足肿胀模型

1实验动物

SD大鼠，雌雄兼用，体重180-220g。

2.实验模型和测试方法

取大鼠110只，随机分成11组，按表5所示的剂量灌胃给药4d，于末次给药前测量致炎前容积；末次给药后30min，于大鼠右后肢足跎皮下注射1％角叉菜胶0.1ml致炎。分别于致炎后2、4、6h测量右踝关节以下容积。

3统计分析：

4试验结果：

表5.双旋覆花内酯甲、乙和丙对大鼠角叉菜胶足肿胀试验的影响

与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果表明，阳性对照药地塞米松、双旋覆花内酯甲、双旋覆花内酯乙和双旋覆花内酯丙对大鼠角叉菜胶足肿胀模型所引起的炎症有显著的抑制作用。

实施例6：双旋覆花内酯甲、乙和丙抗炎实验小鼠腹腔毛细血管通透性试验

1实验动物

NH系小鼠，雌雄兼用，体重18-22g。

2.实验模型和测试方法

取大鼠110只，随机分成11组，按表6所示的剂量灌胃给药1h，尾静脉注射2％依文思蓝生理盐水溶液0.1ml/10g体重，随即腹腔注射0.8％醋酸生理盐水溶液0.20ml/只，20min后脱颈椎处死小鼠，用5ml生理盐水分数次洗涤腹腔，3000转/分，离心15min；取上清液用酶标仪于570nm比色测定其光密度(OD)值。

3统计分析：

4试验结果：

表6.双旋覆花内酯甲、乙和丙对小鼠腹腔毛细血管通透性试验的影响

与空白组比较，^*p＜0.05，^**P＜0.01

结果表明，阳性对照药地塞米松、双旋覆花内酯甲、双旋覆花内酯乙和双旋覆花内酯丙对小鼠腹腔毛细血管通透性试验引起的炎症有显著的抑制作用。

Claims

1.一种双倍半萜内酯类化合物，其特征在于从旋覆花中提取分离得到，为双旋覆花内酯甲、双旋覆花内酯乙或双旋覆花内酯丙，其化学结构式分别如下：

双旋覆花内酯甲双旋覆花内酯乙

双旋覆花内酯丙。

2.如权利要求1所述的双倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)提取：将旋覆花地上部分干燥，粉碎，以浓度为80％～95％乙醇室温浸泡提取3～4次，每次12～24小时；合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，加水稀释，然后先以石油醚萃取，再以二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集二氯甲烷部位；

3.如权利要求1所述的双倍半萜内酯类化合物双旋覆花内酯甲、双旋覆花内酯乙或双旋覆花内酯丙在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.如权利要求1所述的双倍半萜内酯类化合物双旋覆花内酯甲、双旋覆花内酯乙或双旋覆花内酯丙在制备抗炎症药物中的应用。