CN110105210B

CN110105210B - 百里酚衍生物及其制备方法和应用

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Publication number: CN110105210B
Application number: CN201910412350.1A
Authority: CN
Inventors: 时静; 刘玉国; 于悦
Original assignee: Shandong Cancer Hospital & Institute (shandong Cancer Hospital)
Current assignee: Shandong Cancer Hospital & Institute (shandong Cancer Hospital)
Priority date: 2019-05-17
Filing date: 2019-05-17
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2039-05-17
Also published as: CN110105210A

Abstract

本发明提供百里酚衍生物及其制备方法和应用，本发明从菊科泽兰属(Eupatorium)植物佩兰(Eupatorium fortunei)中分离获得两种结构新颖的百里酚衍生物，

和

Description

百里酚衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药制药技术领域，具体涉及百里酚衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

肿瘤是目前危害人类健康最严重的疾病之一，据WHO统计，全球平均每年死于恶性肿瘤者达700万人，新发病为800万例，且还在逐年增加,到2020年全世界每年将新发生2000万例肿瘤，成为人类健康头号杀手。目前临床使用的抗肿瘤药物普遍存在选择性差、毒副作用大等缺点，严重影响了病人的治疗效果和生存质量。因此研制选择性高，副作用小的新型抗肿瘤药物已成为全世界共同关注的课题。自20世纪60年代开始，抗肿瘤新药的发现主要是从大量的天然产物中寻找，目前超过60％的抗肿瘤新药物就是从天然植物中分离的得到的化合物或其结构类似物，如从喜树中分离得到的喜树碱类衍生物，红豆杉中分离得到的紫杉二萜类成分等。鉴于天然产物结构变化多样，从传统中药资源宝库中搜寻具有良好活性的抗肿瘤先导化合物，对创制新药物的研究以及植物资源的开发利用具有重要意义。

佩兰(Eupatorium fortunei)为菊科泽兰属(Eupatorium)植物中的一种常用的芳香化湿药，最早记载于《神农本草经》，列为上品，具有化湿醒脾、祛暑辟秽的功效，主治湿温暑病，以及因过食甜腻厚味以致脾热结聚、口甘舌腻等病症。在中医中药治疗肿瘤的方案中，对肝癌及胃肠道、泌尿生殖系统的肿瘤用药，经常运用化湿泄浊法，因而芳香化湿、苦温燥湿、淡渗利湿及具有化湿解毒作用的药物会出现在这些复方中，其中主要的药物之一就是佩兰。现代药理研究表明佩兰提取物能够显著降低肿瘤中VEGF的表达而抑制恶性肿瘤的血管生成及其转移。然而，发明人发现，国内外学者对佩兰的化学成分研究并不深入，因此，其潜在的药理活性成分有待发掘。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明提供百里酚衍生物及其制备方法和应用，本发明从菊科泽兰属(Eupatorium)植物佩兰(Eupatorium fortunei)中分离获得两种结构新颖的百里酚衍生物，经试验验证，其对肺癌细胞、宫颈癌细胞、肝癌细胞和乳腺癌细胞等多种肿瘤细胞均具有较强的抑制作用，而对正常细胞毒性较小，具有良好的实际应用之价值。

本发明的第一个方面，提供一种式(I)或式(II)所示的化合物或其药学上可接受的盐，

本发明的第二个方面，提供上述化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，所述化合物的制备方法如下：

S1、佩兰全草地上茎叶加乙醇浸泡，加热回流提取，减压浓缩得浸膏；

S2、将浸膏溶于甲醇，干燥后依次使用石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，丙酮，甲醇进行恒定洗脱；

S3、将经所述石油醚洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析分离，使用50:1至0：100梯度的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，经色谱分析，合并收集含有式(I)和式(II)所示的化合物的流份段，命名为第一顺序组分；

S4、采用大孔树脂，依次使用50％、70％、100％的甲醇溶液对第一顺序组分进行洗脱，合并收集含有式(I)和式(II)所示的化合物的流份段，命名为第二顺序组分；

S5、采用中压柱色谱，用50：50至100:0的甲醇-水溶液对第二顺序组分进行梯度洗脱，经色谱分析，合并收集含有式(I)和式(II)所示的化合物的流份段，命名为第三顺序组分；

S6、对第三顺序组分通过制备液相色谱得到式(I)和式(II)所示单体化合物。

本发明的第三个方面，提供上述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述肿瘤包括但不限于肺癌、宫颈癌、肝癌和乳腺癌。

本发明的第四个方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含上述化合物或其药学上可接受的盐。

进一步的，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

本发明的有益技术效果：

本发明提供了具有新颖结构的百里酚衍生物，以及其制备方法和应用，所述化合物的制备方法简单易操作，同时化合物对多种肿瘤细胞株具有较强的的抑制作用，而对正常细胞的毒性较小，因此在制备抗肿瘤药物方面具有较好的应用前景。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，国内外学者对佩兰的化学成分研究并不深入，因此，其潜在的药理活性成分有待发掘。

本发明的一个典型实施方式中，提供一种式(I)或式(II)所示的化合物或其药学上可接受的盐，

上述化合物药学上可接受的盐优选为上述化合物与无机酸，如盐酸、硫酸、硝酸或氢溴酸形成的盐；或有机酸，如甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸形成的盐。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，所述化合物的制备方法如下：

S5、采用中压柱色谱，用50：50至100:0的甲醇-水溶液对第二顺序组分进行梯度洗脱，经色谱分析，收集含有式(I)和式(II)所示的化合物的流份段，命名为第三顺序组分；

上述提取制备方法由粗至精的方式从佩兰中逐步分离出式(I)和式(II)所示的这两种化合物的高纯度单体成分。

本发明所述的流动相(即洗脱所用的液体)的比例均指体积比，流动相中的“％”指非水物质所占的体积百分数，例如50％的甲醇溶液指甲醇体积百分比为50％水溶液。

本发明中所述的恒定洗脱是指流动相的组成比例固定不变。

本发明中所述的梯度洗脱是指洗脱过程中不断改变流动相的浓度配比，但起始浓度和终点浓度是固定的，比如“使用50:1至0：100梯度的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱”是指：石油醚-乙酸乙酯按照起始体积比为50:1、洗脱终点体积比为0:100的方式进行梯度洗脱。

本发明的制备方法的各个步骤可以进一步改进，例如：

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S1中，

浸提所用的溶剂、料液比对粗提液的杂质含量以及有效成分的提取率均有影响。溶剂优选使用90～95％的乙醇溶液，进一步优选为95％乙醇溶液。佩兰与乙醇的料液比1kg：3～7L(优选1kg：5L)。采用上述浸提条件能减低粗提液中的杂质含量，从而有效提高百里酚衍生物的提取率。

进一步优选加热回流提取2次，每次2h。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2中，

采用硅藻土对溶解于甲醇中的浸膏进行吸附；采用硅藻土进行吸附效果更好；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S3中，

石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱具体程序为：石油醚-乙酸乙酯＝50:1；25:1；10:1；5:1；2:1；1:1；0:100；采用以上优化条件，可以提高分离度；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S5中，

甲醇梯度洗脱具体方法为：使用50-100％的甲醇梯度洗脱8h，流速控制为50mL/min；采用以上优化条件，可以提高分离度和柱效。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S6具体方法为：使用70％甲醇溶液恒定洗脱得洗脱液，干燥后即得式(I)所示单体化合物；使用51％的乙腈溶液恒定洗脱，干燥后即得到式(II)所示单体化合物。

本发明的又一具体实施方式中，上述步骤中，经色谱分析可以为高效液相色谱分析，和/或薄层分析等。

本发明的又一具体实施方式中，提供所述化合物的制备方法如下：

S1、佩兰全草地上茎叶加95％乙醇浸泡，加热回流提取，减压浓缩得浸膏；佩兰与乙醇的料液比1kg：3～7L(优选1kg：5L)；

S3、将经所述石油醚洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析分离，依次用石油醚-乙酸乙酯＝50:1；25:1；10:1；5:1；2:1；1:1；0:100梯度洗脱，分段收集洗脱液，根据薄层色谱检测结果合并相同组分流份得到Fr.1-Fr.57；

S4、采用大孔树脂，依次使用50％、70％、100％的甲醇溶液对Fr.7-8进行洗脱，得到Fr.1’-Fr.3’；

S5、采用中压柱色谱，用50-100％的甲醇溶液为流动相对Fr.2’-Fr.3’进行梯度洗脱8h，流速50mL/min；按色谱图收集流份36份即A1-A36；

S6、对A22通过制备液相色谱，洗脱剂为70％的甲醇溶液恒定洗脱，干燥得到式(I)单体化合物；洗脱剂为51％的乙腈溶液恒定洗脱，干燥得到式(II)单体化合物。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述肿瘤包括但不限于肺癌、宫颈癌、肝癌和乳腺癌。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含上述化合物或其药学上可接受的盐。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：提取分离实验

a.佩兰样品于2017年4月采自江苏省泗阳县。干燥的佩兰全草地上茎叶20kg粉碎后，加入95％乙醇100L浸泡2h后，加热回流提取2次，每次2h，提取液减压浓缩，得到1.48kg浸膏；

b.将浸膏溶解于甲醇2L中，吸附于硅藻土3.0kg，干燥，依次用石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，丙酮，甲醇洗脱，各10L，洗脱液分别浓缩得石油醚部分407g，二氯甲烷部分158g，乙酸乙酯部分40g，丙酮部分50g和甲醇部分540g；

c.对石油醚部分400g用硅胶层析进行分离，依次用石油醚-乙酸乙酯＝50:1；25:1；10:1；5:1；2:1；1:1；0:100梯度洗脱，分段收集样品，根据薄层色谱检测结果合并相同组分流份得到Fr.1-Fr.57；

d.对Fr.7-8(21.0g)继续通过大孔树脂(PRP-512A)分离，依次用50％、70％、100％的甲醇溶液洗脱，分别得到Fr.1’-Fr.3’。Fr.2’-Fr.3’(5.0g)再使用中压柱色谱(Büchi系统，由2个泵(C-605),1个紫外检测器(C-635),1个ODS色谱柱(60×600mm,50μm,400g；YMC)组成)分离，使用50％-100％甲醇溶液梯度洗脱8h，流速50mL/min。按色谱图收集流份36份(A1-A36)，然后对A22(948mg)通过制备液相色谱(型号Shimadzu LC-6AD,YMC-Pack ODS-Acolumn)，洗脱剂为70％的甲醇溶液等度洗脱，分离干燥得到式I单体化合物200mg。对A20(291mg)通过制备液相色谱(型号Shimadzu LC-6AD,YMC-Pack ODS-A column)，洗脱剂为51％的乙腈溶液等度洗脱，分离干燥得到式II单体化合物9mg。

化合物I、II均为无色油状物，高分辨质谱(HR-ESI-MS)分别为：m/z247.1320[M+H]⁺，m/z247.1322[M+H]⁺(计算值C₁₅H₁₉O₃,247.1329)。化合物I、II的¹H-NMR(500MHz，氘代氯仿)和¹³C-NMR(500MHz，氘代氯仿)核磁共振数据见表1。以上可确定化合物I、II分别为：9-O-tiglate-8,9-dehydrothymol和9-O-(3-methyl-2-butenoyl)-8,10-dehydrothymol。

表1化合物I、II的¹H-NMR和¹³C-NMR

注：偶合常数J用括号中的数字表示(Hz为单位)，s为单峰，d为双峰，t为三重峰，q为四重峰，dt为双三重峰，m为多重峰。

实施例2：百里酚衍生物化合物I、II的抗肿瘤作用研究

以临床使用的抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶为阳性对照药，以相应溶剂作阴性对照，以人肺癌细胞株(A549)、人子宫癌细胞株(Hela)、人肝癌细胞株(HepG2)和人乳腺癌细胞株(MCF-7)为受试细胞株；用MTT法对化合物进行了体外抗肿瘤活性测试。

将受试药物和细胞共同培养48h，根据预实验细胞生长速率的结果，接种一定密度的细胞190μL于96孔培养板(约5×10⁴-1×10⁵个/孔)。

培养24h待细胞贴壁后，分别加入系列浓度的样品10μL，每个样品设5个复孔，其中DMSO终浓度＜1％。另设阴性对照孔4个，加入10μL空白基质。

细胞于饱和湿度、5％CO2，37℃条件下孵化48h，每孔加入10μLMTT(5mg/ml),继续培养4h。

吸去上清液，加入DMSO 150μL/孔，充分溶解后用酶标仪在测定波长为570nm和参考630nm处测定OD值，计算每个给药空细胞增殖抑制率，并计算其IC₅₀值，结果如下所述，表2所示：

表2化合物I、II抗肿瘤活性

由表2可知，本发明所述化合物体外对多种肿瘤细胞均有良好的抑制作用，超过了临床常用的抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶，表明本发明所述化合物具有良好的抗肿瘤作用，且对正常细胞的毒性小，有望用于抗肿瘤药物的制备。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种式(I)或式(II)所示的化合物，

2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物的制备合成方法如下：

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，

乙醇使用90～95％的乙醇溶液；

佩兰与乙醇的料液比为1kg：3～7L。

4.如权利要求 3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，

乙醇使用95％乙醇溶液。

5.如权利要求 3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，

佩兰与乙醇的料液比为1kg：5L。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，

采用硅藻土对溶解于甲醇中的浸膏进行吸附。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，

石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱具体程序为：石油醚-乙酸乙酯＝50:1；25:1；10:1；5:1；2:1；1:1；0:100。

8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中，

甲醇梯度洗脱具体方法为：使用50-100％的甲醇梯度洗脱8h，流速控制为50mL/min。

9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S6具体方法为：使用70％甲醇溶液恒定洗脱得洗脱液，干燥后即得式(I)所示单体化合物；使用51％的乙腈溶液恒定洗脱，干燥后即得到式(II)所示单体化合物。

10.权利要求1所述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、宫颈癌、肝癌和乳腺癌。

12.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1所述化合物。

13.如权利要求12所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

14.如权利要求12或13所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。

15.如权利要求14所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。