CN110483544B

CN110483544B - 一种倍半萜内酯类化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110483544B
Application number: CN201910782996.9A
Authority: CN
Inventors: 杨波; 赵华军; 姜青利; 朱智慧
Original assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Current assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date: 2019-08-23
Filing date: 2019-08-23
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2039-08-23
Also published as: CN110483544A

Abstract

本发明公开了一种从泽兰属植物华泽兰中提取、分离、鉴定的新颖倍半萜内酯类化合物及其制备方法和应用。该倍半萜内酯类化合物的结构如式(I)所示。该化合物的制备包括：A、使用提取溶剂对药材提取，得到提取液；B、浓缩提取液，加水混悬，用乙酸乙酯萃取，浓缩萃取液，得到华泽兰乙酸乙酯提取物；C、华泽兰乙酸乙酯提取物进行正相柱层析，用洗脱剂进行洗脱；收集洗脱液，干燥，得到粗产品；D、粗产品进行反相中压柱层析及制备型高效液相柱层析分离，得到所述的新颖倍半萜内酯类化合物。该制备方法操作简单，生产成本低，得到的化合物体外具有良好的抑制人源三阴性乳腺癌细胞增殖作用，具有良好开发、应用前景。

Description

一种倍半萜内酯类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及倍半萜内酯类化合物及其制备技术领域，具体涉及一种倍半萜内酯类化合物及其制备方法和在制备抗癌药物中的应用。

背景技术

菊科(Compositae)泽兰属(Eupatorium L.)植物，资源丰富，全世界约有600余种，主要分布于中南美洲的温带及热带地区。我国有14种及若干个变种，除新疆、西藏外全国均产。泽兰属作为药用的植物，目前应用较多的有野马追、华泽兰、佩兰等八个种。该属植物具有较悠久的用药历史。

华泽兰是菊科泽兰属植物华泽兰(Eupatorium chinense L.)的干燥全草，又名六月霜、六月雪、白头翁、斑骨相思、白花姜、秤杆草、野升麻、对叶蒿等。华泽兰，其味辛、苦，性平，归肺、肝经，具有清热解毒、疏肝活血等功效，主治风热感冒、胸胁痛、脘痛腹胀、跌打损伤、痈肿疮毒、咽喉炎等疾病，是广东地区治疗白喉、咽炎常用药之一。

泽兰属植物中含有丰富的、结构新颖的倍半萜内酯类成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗炎等多种生物活性。泽兰属倍半萜内酯多含有“α-β不饱和羰基”，“三元氧环”等结构单元，为一类迈克尔反应受体分子(Michael addition acceptors)或亲电天然产物，含该类结构单元的倍半萜内酯多具有显著生物活性，特别是对细胞信号传导通路中含有半胱氨酸残基的蛋白、酶，如STAT3、NF-κB、CDK、Hsp90等具有抑制活性。

倍半萜类成分具有良好成药性，如青蒿素等。研究结构新颖的倍半萜内酯的多种生物活性及分子作用机制，并以此为先导物进行结构修饰，可有望开发具有良好应用前景的创新型药物。

迄今为止，虽然从泽兰属植物中分离得到了一系列倍半萜内酯类化合物，但并没有提供一种工艺简单、科学合理，且化学结构如式(I)所示的新颖倍半萜内酯。该新颖倍半萜内酯在生物医药领域可能具有多种潜在的应用前景，可能为新型STAT3、NF-κB等抑制剂，用于多种疾病的预防及治疗。以本发明所报道的倍半萜内酯为前体，亦可制备多种结构类似的衍生物，衍生物亦可能具有良好应用前景。

天然倍半萜内酯具有多个手性碳，实现所述新颖倍半萜内酯的全合成尚需时日，全合成且量产尚有较大的技术难度，故提供一种简便易行，科学合理的该新颖倍半萜内酯的制备方法对该化合物的深度研究及应用具有重要意义。

三阴性乳腺癌占乳腺癌的比例不到20％，但其恶性程度高，预后差，且其发病有年轻化的趋势。目前临床尚无分子靶向抗三阴性乳腺癌药物，普通乳腺癌化疗药物用于乳腺癌治疗效果不甚理想，筛选高效、分子靶向的抗三阴性乳腺癌药物亦具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是报道一种新颖倍半萜内酯、提供其制备方法以及应用，该倍半萜内酯具有较好的抗癌活性，体外对人源三阴性乳腺癌细胞株具有较显著抑制活性。本发明报道的制备方法工艺成熟、操作简单、科学合理，能够得到理化性质稳定，纯度较高的所述新颖倍半萜内酯化合物。

一种倍半萜内酯类化合物，为式(I)结构：

该化合物的化学结构目前未见有文献报道，MTT试验表明该化合物对两种人源乳腺癌细胞株具有较显著的抑制作用，给药72h后，对两株人源三阴性乳腺癌细胞株的半数抑制浓度(IC₅₀)为：5.90～12.79μmol/L，体外具有较显著的抗肿瘤活性。

本发明还提供了一种所述新颖倍半萜内酯类化合物的制备方法，包括下述步骤：

(1)提取：将华泽兰药材粉碎，用提取溶剂浸泡24h～60h(最优选为48h)，渗漉提取，收集渗漉液；

所述药材为菊科泽兰属植物华泽兰的干燥地上部分和/或全草；

(2)萃取：将步骤(1)所得的渗漉液减压浓缩，所得浸膏用水混悬；用乙酸乙酯萃取混悬液3～5次，合并萃取液，浓缩，得到华泽兰乙酸乙酯提取物；

(3)正相柱层析：将步骤(2)所得的乙酸乙酯提取物上正相柱进行柱层析，以一定比例的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集富含所述倍半萜内酯的流分，减压回收溶剂，得到粗产品；

(4)中压柱层析：将步骤(3)得到的粗产品，进行中压柱层析，进一步收集富含如式(I)所示化合物的目标流分；

(5)反相制备型高压柱层析：将步骤(4)收集所得目标流分进行反相制备型高效液相柱层析，得到如式(I)所示的化合物。

步骤(1)中，药材的提取方法较多，包括渗漉法，渗漉法操作简单，提取效率高，提取溶剂用量少，常温提取，能耗低，可保护热敏性有效成分，亦可适用于药材中有效成分含量较低时，保证充分提取。

步骤(2)中，萃取溶剂可有较多选择，但至少要包括乙酸乙酯。乙酸乙酯极性大于现有技术中的石油醚、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，能够将华泽兰提取物中倍半萜内酯类成分萃取完全；乙酸乙酯极性小于现有技术中的正丁醇等，不但能将倍半萜内酯类成分完全萃取出来，还能够剔除一些易溶于正丁醇的极性较大的糖苷类杂质，从而使得华泽兰粗提物中倍半萜内酯类活性成分的含量更高，纯度更高；乙酸乙酯毒性较小，工业生产亦体现了绿色环保的理念。

步骤(3)中，洗脱剂的选择有比较严格的要求，包括合适的溶剂系统，合适的溶剂配比，以及洗脱的柱体积的限定。石油醚-乙酸乙酯系统较适合所述倍半萜内酯的洗脱及纯化；所述洗脱剂中石油醚-乙酸乙酯不同配比的设定，及按照设定的比例按极性由小到大的顺序梯度洗脱，亦保证了所述倍半萜内酯与其它倍半萜内酯类成分的充分分离；各洗脱剂洗脱的柱体积的限定，亦保证所述倍半萜内酯的充分洗脱，使目标化合物分布集中。

所述的洗脱剂包括由体积比为30～0﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱剂。

步骤(4)中，所述的中压柱层析为反相色谱，色谱柱填料为十八烷基键合相硅胶。所述中压柱层析流动相至少包括40～65％的甲醇水溶液。

步骤(5)中，所述的制备型高效液相柱层析亦为反相色谱，色谱柱填料为十八烷基键合相硅胶，流动相至少包括35～55％的甲醇水溶液。

为了取得更好的发明效果，以下作为本发明的优选：

步骤(1)所述药材为菊科泽兰属植物华泽兰(Eupatorium chinense L.)的干燥全草。华泽兰收录于《全国中草药汇编》，可用于白喉，扁桃体炎，咽喉炎，感冒发热，麻疹，肺炎，支气管炎，风湿性关节炎，痈疖肿毒，毒蛇咬伤等，药用历史悠久。

所述的提取溶剂为水、醇中的一种或两种，该提取溶剂使用安全、价廉、且具有较好的提取效率。进一步优选，所述的提取溶剂为含乙醇体积百分数为70％～95％的乙醇水溶液，更进一步优选，所述的提取溶剂为含乙醇体积百分数为90％～95％的乙醇水溶液。该提取溶剂的性质非常适合于提取华泽兰干燥地上部分和/或全草中的倍半萜内酯类成分，能够更加高效、完全地获取药用部位中的倍半萜内酯类活性成分，且能剔除大量极性较大的非倍半萜类杂质。

所述提取方法为溶剂提取法。所述的提取溶剂与华泽兰药材的用量比为15～25L﹕1kg。进一步优选，所述提取方法为渗漉法。药材打粉，过40目筛，药材粗粉润湿后装柱，加90～95％乙醇冷浸48h，渗漉，所述的提取溶剂与华泽兰药材的用量比为15～20L﹕1kg。渗漉法提取效率高，提取溶剂用量少，常温提取能耗低，且能避免热敏性活性成分的降解，渗漉设备简单，也能大量节约生产成本。

所述的华泽兰药材为华泽兰的干燥全草，将华泽兰药材粉碎并过40目筛后再用提取溶剂浸泡。

步骤(2)中，所述的萃取溶剂可选：石油醚、乙醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水中的两种以上。萃取时按照极性由小到大，依次使用单一溶剂进行萃取。进一步优选，所述的萃取溶剂为乙酸乙酯。根据相似相溶原理，通过所述萃取溶剂萃取，以使步骤(1)得到的华泽兰提取物加水混悬后的混悬液按照极性由小到大分离，通过薄层色谱(TLC)、LC-MS检识，华泽兰乙酸乙酯萃取液中富含倍半萜内酯类成分。因此，将乙酸乙酯萃取液浓缩，乙酸乙酯提取物上正相柱进一步纯化。乙酸乙酯萃取，使得所述倍半萜内酯的分布更加集中，亦剔除了大量非倍半萜类成分；后续实验证明，单一使用乙酸乙酯萃取，不影响所述倍半萜内酯的纯化，故单一溶剂萃取，亦使步骤简化，且节约成本。

步骤(3)中，所述的正相柱所用填料为100～200目的柱层析用硅胶或氧化铝。

洗脱方式为梯度洗脱，洗脱剂由体积比为30～0:1的石油醚和乙酸乙酯组成，含有目标产物的洗脱液通过TLC或HPLC或LC-MS进行检识。所述的洗脱剂包括由体积比为30﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为20﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为10﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为5﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为2﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为1﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为1﹕3的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为0﹕1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂，并按极性由小到大的顺序，依次进行梯度洗脱。采用以石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂的溶剂系统，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱，该溶剂系统对倍半萜内酯的选择性高，洗脱能力强，通过TLC、LC-MS检识，本发明所述新颖倍半萜内酯几乎全部位于体积比为1﹕3的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱剂洗脱后的洗脱液中，使得华泽兰粗提物中所述活性新颖倍半萜内酯的含量更高，分布更加集中。

步骤(4)中，所述的中压柱层析所用填料均为十八烷基键合相硅胶；中压柱层析的流动相为体积百分数40～65％的甲醇水溶液，洗脱时按极性由大到小依次进行梯度洗脱；柱子中填料均为十八烷基键合相硅胶，该填料对倍半萜内酯类化合物具有较强的选择性，分离效果好。中压柱层析，亦具有上样量大，分离效率高等优势。步骤(3)得到的富含所述新颖倍半萜的有效流分，用甲醇溶解，硅胶拌样后，上十八烷基键合相硅胶填充的中压柱分离，分别用40％、45％、55％、65％的甲醇水溶液洗脱，该流动相洗脱能力强，所述新颖倍半萜内酯几乎全部集中在45％甲醇水洗脱的部分流分中。

步骤(5)中，所述的反相制备型高效液相柱层析所用填料均为十八烷基键合相硅胶；反相制备型高效液相柱层析的流动相为体积百分数35～55％的甲醇水溶液。柱子中填料均为十八烷基键合相硅胶，该填料对倍半萜内酯类化合物具有较强的选择性，分离效果好。中压柱层析，亦具有上样量大，分离效率高等优势。步骤(4)得到的富含新颖倍半萜内酯的粗产品，进行反相制备型高效液相柱层析，用35～55％的甲醇水洗脱，进一步优选，用45％的甲醇水等度洗脱，按照色谱峰收集流分，所得流分蒸干，即得到所述新颖倍半萜内酯。所述新颖倍半萜内酯与另一倍半萜内酯类成分极性非常相近，普通硅胶柱层析及反相中压柱层析，均难以将这两种物质分开。制备型高效液相色谱具有上样量大，柱效高，分离效率高等优点。实验中，首先，尝试用50％甲醇水为流动相制备分离，但未能将两种极性相近的倍半萜内酯有效分离，得到的所述新颖倍半萜内酯纯度较低，且分离效率及得率亦非常低；随后，改用45％甲醇水为洗脱剂洗脱，并探索合适流动相的流速，使得两种极性非常接近的倍半萜内酯类化合物达到了良好的分离。

本发明还提供了一种所述的倍半萜内酯化合物在制备抗癌药物中的应用，所述的抗癌药物可用于三阴性乳腺癌的治疗。该倍半萜内酯对人源三阴性乳腺癌细胞株，具有较显著的抑制作用。以MTT法对得到的泽兰属植物中新颖倍半萜内酯化合物，进行了抑制人源三阴性乳腺癌细胞株增殖活性研究。结果显示，该新颖倍半萜内酯对MDA-MB-231、MDA-MB-468两种人源三阴性乳腺癌细胞株均具有较显著的抑制作用，给药72h后，半数抑制浓度IC₅₀约为：5.90～12.79μmol/L。上述细胞株可采用市售产品，如：可采用美国模式培养物集存库ATCC(American type culture collection)的各种细胞株。

本发明泽兰属植物中新颖倍半萜内酯化合物可与市售或者常用的载体结合，用于制备预防或者/和治疗，或者/和协同治疗癌症的药物。所述的药物可以为：脂肪乳剂、注射油剂、粉针剂、片剂、胶囊剂等形式。

与现有的技术相比，本泽兰属植物中所述新颖倍半萜内酯化合物制备方法及其癌症治疗应用的优点在于：化合物结构新颖，生物活性强。利用系统溶剂法及正相、反相色谱，中压、高压色谱，分离、纯化得到了一个结构新颖的倍半萜内酯化合物。使用的溶剂廉价易得，且毒性较低。本发明泽兰属植物中新颖倍半萜内酯的制备方法科学合理，操作简单，生产成本低，具有良好的应用前景。

附图说明

图1(A)是本发明式(I)结构的化合物的核磁共振氢谱。

图1(B)是本发明式(I)结构的化合物的核磁共振碳谱。

图1(C)是本发明式(I)结构的化合物的DEPT谱。

图1(D)是本发明式(I)结构的化合物的¹H-¹HCSOY谱。

图1(E)是本发明式(I)结构的化合物的HSQC谱。

图1(F)是本发明式(I)结构的化合物的HMBC谱。

图1(G)是本发明式(I)结构的化合物的NOESY谱。

图2是本发明式(I)结构的化合物的高分辨质谱。

图3是本发明式(I)结构的化合物的红外光谱。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的内容作进一步详细的说明，但不应将实施例理解为对本发明的限制。在不脱离本发明上述思想的情况下，根据本领域普通技术知识和常规手段作出的各种替换手段或变更，均包含在本发明之内。

实施例1

本泽兰属植物中新颖倍半萜内酯的制备方法包括下述步骤：

(1)提取：华泽兰药材(华泽兰的干燥全草)打粉，过40目筛备用。取华泽兰药材粗粉4.7kg，加适量95％乙醇冷浸48h后渗漉提取，收集渗漉液。提取总溶剂体积相当于药材质量的18倍量(总计用去95％的乙醇84.6L)。

(2)萃取：将步骤(1)得到的渗漉液减压浓缩至无醇味，所得浸膏加水混悬至约1.6L，用1.6L的乙酸乙酯萃取，萃取4次，合并萃取液，得到华泽兰乙酸乙酯萃取液。减压回收溶剂，浓缩，得到华泽兰乙酸乙酯提取物261g。

(3)正相柱层析：取上述华泽兰乙酸乙酯提取物约135g，上100～200目的正相硅胶柱进行洗脱分离，使用不同比例的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，每个梯度洗脱约10L(相当于3个柱体积)。洗脱溶剂系统中，石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:3，0:1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分经TLC(薄层色谱法)、LC-MS(液相色谱-质谱联用)检识，富含所述新颖倍半萜内酯的流分，主要集中在石油醚和乙酸乙酯1﹕3的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在45℃减压回收溶剂，得到富含所述新颖倍半萜内酯的提取物24.28g。

(4)中压柱层析及制备型高效液相柱层析：取上述提取物约3g，进行中压柱层析分离，样品用硅胶拌样后上柱分离，分别用40％、45％、55％、65％的甲醇水溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱约600mL，收集45％甲醇水洗脱液对应的部分流分，减压回收溶剂，得到该提取物约768mg，取该提取物，用流动相溶解后，进行反相制备型高效液相柱层析，用45％的甲醇水溶液等度洗脱，收集相应吸收峰对应流分，减压回收溶剂，得到如式1所示化合物(C₂₂H₂₆O₉)约189mg(即本发明式(I)结构的化合物)。

实施例2

本泽兰属植物华泽兰中新颖倍半萜内酯的结构鉴定：

取所述化合物约10mg，用CDCl₃溶解，测试其¹H NMR谱，¹³C NMR谱，2D NMR谱；取化合物适量测试其HR-MS谱，IR谱，测试其比旋光度。

图1(A)是本发明式(I)结构的化合物的核磁共振氢谱。图1(B)是本发明式(I)结构的化合物的核磁共振碳谱。图1(C)是本发明式(I)结构的化合物的DEPT谱。图1(D)是本发明式(I)结构的化合物的¹H-¹HCSOY谱。图1(E)是本发明式(I)结构的化合物的HSQC谱。图1(F)是本发明式(I)结构的化合物的HMBC谱。图1(G)是本发明式(I)结构的化合物的NOESY谱。图2是本发明式(I)结构的化合物的高分辨质谱。图3是本发明式(I)结构的化合物的红外光谱。根据各图谱数据表征，表明得到的新化合物为如式1所示化合物(C₂₂H₂₆O₉)约189mg(即本发明式(I)结构的化合物)。

所述新颖倍半萜内酯为无色油状物质。

高分辨质谱显示其分子式为：C₂₂H₂₆O₉，理论值[M+Na]⁺为m/z：457.1475，测定值：[M+Na]⁺为m/z：457.1467；理论值[M+H]⁺为m/z：435.1655，测定值：[M+H]⁺为m/z：435.1654。IR谱显示：3486.6cm^-1存在强而宽的吸收峰，表明化合物含有羟基；1760.0cm^-1,1710.3cm^-1存在强吸收峰，表明化合物具有酯羰基。化合物有10个不饱和度，DEPT结合¹³C NMR谱显示化合物有3个CH₃，4个CH₂，8个CH，7个季碳。δ_H 6.37(d,J＝3.5Hz,1H,H-13)，δ_H 5.59(d,J＝3.0Hz,1H,H-13)，δ_C133.5(C-11)，δ_C123.3(C-13)，表明C-11与C-13之间有一对环外双键，δ_C 169.0(C-12)的酯羰基信号，结合¹H NMR,¹³C NMR谱，表明该化合物有一个五元不饱和内酯环。δ_H3.41(s,1H,H-3),δ_C62.1(C-3),δ_C66.1(C-4)的一组信号，表明C-3与C-4位之间存在一个三元氧环。δ_H 2.71(d,J＝4.7Hz,1H,H-14),δ_H 2.68(d,J＝4.7Hz,1H,H-14),δ_C54.5(C-10),δ_C56.6(C-14)一组信号，表明C-10与C-14之间存在一个三元氧环。综合¹H NMR，¹³C NMR谱，结合文献，表明所述化合物具有一个吉玛烷型倍半萜内酯的结构母核。所述倍半萜内酯母核¹HNMR与¹³CNMR谱数据基本与文献(New sesquiterpene lactones from Eupatoriumchinense var.simplicifolium(Makino)Kitam,Chemistry Letters,1979,8,1473-6)一致。δ_H 6.73(t,J＝5.9Hz,1H,H-R_8-3),δ_H 4.36(d,J＝5.9Hz,2H,H-R_8-4),δ_H 1.79(s,3H,H-R_8-5)一组氢信号，结合δ_C166.4,127.7,141.3,59.7,12.8一组碳信号，表明化合物存在一个4ˊ-羟基巴豆酰基，δ_H 5.64-5.59(m,1H,H-8)与δ_C166.4(C-R_8-1)碳信号具有远程相关，表明：4ˊ-羟基巴豆酰基位于C-8位。δ_H 2.12(s,3H,H-R_2-2)，δ_C169.5,21.3一组信号，表明化合物存在一个乙酰基，δ_H5.39(d,J＝5.5Hz,1H,H-2)与δ_C169.5(C-R_2-1)具有HMBC相关，表明乙酰基位于C-2位。化合物的相对构型根据NOESY谱解析。天然吉玛烷型倍半萜内酯C-6所在的内酯环均为反式，即H-6为β构型，H-7是α构型。δ_H(3.58,dd,J＝8.2,3.7Hz,1H,H-7)与δ_H 5.64-5.59(m,1H,H-8)有较强的NOESY相关，因此H-8是α构型。δ_H 1.96(dd,J＝8.6,5.5Hz,1H,H-1)，δ_H 2.60(dd,J＝11.6,8.6Hz,1H,H-5)均与δ_H 3.58(dd,J＝8.2,3.7Hz,1H,H-7)具有NOESY相关，证明H-1、H-5亦是α构型。最终推出化合物为：(E)-(2R,3a'S,4'R,6a'S,7'S,7a'R,8a'S,8b'S,8c'S)-7'-acetoxy-8a'-methyl-3'-methylene-2'-oxodecahydro-2'H-spiro[oxirane-2,6'-oxireno[2',3':2,3]azuleno[4,5-b]furan]-4'-yl4-hydroxy-2-methylbut-2-enoate。结构式如式(I)所示。

所述化合物通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、二维核磁共振谱、高分辨质谱、红外光谱等表征，具有如式(I)所示化学结构。核磁共振谱数据见表1。

表1：化合物的¹H NMR谱(600MHz)、¹³C NMR谱(150MHz)(δ，ppm，TMS，CDCl₃)

实施例3

所述新颖倍半萜内酯化合物体外抗肿瘤实验：

取对数生长期的人源三阴性乳腺癌细胞株，消化计数后，按3×10³个细胞/100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，培养24h待细胞贴壁后，用不同浓度的实施例1制备的所述新颖倍半萜内酯处理，每孔设三个复孔。药物与肿瘤细胞孵育72h后，加MTT，37℃继续孵育4h后，终止培养，用移液枪轻轻吸掉培养液，加入DMSO(150μL/孔)，振摇均匀后，用酶标仪在570nm处测定每个孔的光密度OD值，各平行孔的OD值取平均数，将各测试孔的OD值减去本底OD值。计算药物对肿瘤细胞的抑制率。

抑制率＝(1-给药孔平均光密度值/对照组平均光密度值)×100％。根据抑制率计算药物对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)，IC₅₀用origin软件计算。实验重复3次，IC₅₀取mean±SD。

分别对人乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-468两株人源三阴性乳腺癌细胞株进行试验，上述细胞株购自ATCC，具体结果如表2所示。表2的结果显示，所述新颖倍半萜体外对两株人源三阴性乳腺癌细胞均具有较显著抑制作用。

表2：新颖倍半萜对人源三阴性乳腺癌细胞株的半数抑制浓度IC₅₀值(mean±SD,n＝3)

本发明制备得到的泽兰属植物中新颖倍半萜内酯化合物可与市售或者常用的载体结合，用于制备预防、治疗、协同治疗癌症的药物。所述药物可以为脂肪乳剂、注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂等形式。

本发明制备所得泽兰属植物中倍半萜内酯化合物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将本发明制备的倍半萜内酯化合物配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中。配制好的药物可以通过常规途径给药，包括(但并不限于)：静脉、肌肉、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。所用载体介质包括(但并不限于)：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。本发明所述新颖倍半萜内酯化合物可以被制成脂肪乳的形式，例如用注射用大豆油、卵磷脂、甘油和其它辅剂的水溶液，通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊剂之类的药物，也可通过常规方法进行制备。药物活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天1μg/kg体重～2000mg/kg体重。此外，本发明制备的所述新颖倍半萜内酯化合物，还可以与其它抗肿瘤药物协同使用。

当本发明泽兰属植物中所述新颖倍半萜内酯化合物被用做药物时，可将治疗有效剂量的倍半萜内酯化合物施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少10μg/kg体重，较佳的给药剂量约为10μg/kg体重～30mg/kg体重。具体剂量还应考虑给药方式、病人健康状况等因素，这些属熟练医师技能范畴以内。

本文中所描述的具体实施例，仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管本文较多地使用了术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。

Claims

1.一种倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取：将华泽兰药材粉碎，用提取溶剂浸泡24h~60h，渗漉提取，收集渗漉液；

所述的华泽兰药材为菊科泽兰属植物华泽兰的干燥地上部分和/或全草；

（2）萃取：将步骤（1）所得的渗漉液减压浓缩，所得浸膏用水混悬；用乙酸乙酯萃取混悬液3~5次，合并萃取液，浓缩，得到华泽兰乙酸乙酯提取物；

（3）正相柱层析：将步骤（2）所得的乙酸乙酯提取物上正相柱进行柱层析，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集富含所述倍半萜内酯的流分，减压回收溶剂，得到粗产品；

所述的洗脱剂由体积比为 30~0:1 的石油醚和乙酸乙酯组成；

（4）中压柱层析：将步骤（3）得到的粗产品，进行中压柱层析，进一步收集富含如式（I）所示化合物的目标流分；

所述的中压柱层析所用填料均为十八烷基键合相硅胶，所述的中压柱层析的流动相为体积百分数40％~65％的甲醇水溶液，洗脱时按极性由大到小依次进行梯度洗脱；

（5）反相制备型高压柱层析：将步骤（4）收集所得目标流分进行反相制备型高效液相柱层析，得到如式（I）所示的化合物；

所述的反相制备型高效液相柱层析所用填料均为十八烷基键合相硅胶，所述的反相制备型高效液相柱层析的流动相为体积百分数35~55％的甲醇水溶液；

所述的倍半萜内酯类化合物，结构如式（I）所示：

（I）。

2.如权利要求1所述的倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的提取溶剂为水、醇中的一种或两种。

3.如权利要求2所述的倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的提取溶剂为含乙醇体积百分数为70％~95％的乙醇水溶液，所述的提取溶剂与华泽兰药材的用量比为15~25L﹕1kg。

4.如权利要求1所述的倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的华泽兰药材为华泽兰的干燥全草，将华泽兰药材粉碎并过40目筛。

5.根据权利要求1所述的倍半萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的正相柱所用填料为100~200目的柱层析用硅胶或氧化铝。