CN103599144A - 蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种败酱科缬草属植物蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位的制备方法，包括：A、使用提取溶剂对蜘蛛香药材渗漉提取，得到提取液；B、将提取液浓缩，加水混悬，用二氯甲烷进行萃取，得到萃取液，萃取液浓缩，得到环氧环烯醚萜酯粗提物；C、环氧环烯醚萜酯粗提物进行正相柱层析，用洗脱剂进行洗脱；收集洗脱液，干燥，得到蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位；所述的洗脱剂至少包括由体积比为15～2︰1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱剂。该方法制备的蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位，生物活性强，操作简单，生产成本低，并且具有质量稳定、可控等优点，可用于癌症治疗药物的制备。

Description

蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位的制备方法

（一）技术领域

本发明涉及蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位的制备方法。

（二）背景技术

败酱科（Valerianaceae）缬草属（Valeriana L.）植物全世界约200余种，广泛分布于美洲、欧洲、亚洲的北温带地区。我国有17种，2个变种，以西部及西南部分布的种类最多。缬草作为药用植物，目前应用较多的有缬草（Valeriana officinalis Linn）、黑水缬草（Valeriana amurensisSmir.ex Kom）、蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）、宽叶缬草（Valerianaofficinalis Linn.var.latifolia Miq）等。该属植物在欧洲具有悠久的用药历史，在欧美等国可用于治疗轻、中度失眠。

蜘蛛香为败酱科缬草属植物，在我国分布较广，具有多年用药历史，现被我国2010版药典收载，具有理气止痛、消食止泻、祛风除湿、镇静安神等功效。《本草纲目》记载：“蜘蛛香，辛，温，无毒；辟瘟疫，中恶邪精，鬼气尸疰”。

蜘蛛香含有几十种非苷环烯醚萜类成分。环烯醚萜为臭蚁二醛的缩醛衍生物，非苷环烯醚萜主要以C₁、C₁₀、C₁₁等-OH与已戊酰基（isovaleryl）、乙酰基（Acetyl）等成酯的形式存在，“C-8(10)-环氧”为其结构的一大特征，称为环氧环烯醚萜酯。迄今为止，对败酱科缬草属植物中含有的环氧环烯醚萜酯类化合物的有效部位的研究鲜有报道。虽然文献报道，对败酱科缬草属植物进行了一系列常规的提取、分离，并且得到一系列环氧环烯醚萜酯类化合物，但并没有提供一种工艺科学合理，有效部位性能稳定、生物活性高的蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位的制备方法。

目前，在提取溶剂方面，文献“蜘蛛香的化学成分研究”（许婧；蜘蛛香的化学成分研究；药物评价研究；2010年第33卷第2期）公开了蜘蛛香中环烯醚萜酯类成分的提取方法，该研究用95%的甲醇冷浸提取。95%的甲醇在提取蜘蛛香脂溶性较强的环烯醚萜酯方面具有明显优势，且能最大限度避免极性较强的非环烯醚萜酯类杂质的引入，但甲醇具有较强的毒性，高浓度的甲醇不适合工业化生产，存在一定的技术缺陷。

文献“蜘蛛香中环烯醚萜类成分大孔树脂纯化工艺的研究”（宋歌；蜘蛛香中环烯醚萜类成分大孔树脂纯化工艺的研究；北京中医药大学学报；2012年第35卷第3期）公开了蜘蛛香总环烯醚萜酯类成分的提取方法，包括用70%的乙醇浸润0.5h，加热回流提取。该法在一定程度上能提取出蜘蛛香中环烯醚萜酯类成分，但70%的乙醇极性较大，对于极性较小的环烯醚萜酯，提取得率会比较低；另外，70%的乙醇在提取出环烯醚萜酯的同时，会引入大量极性较大的非环烯醚萜酯类杂质，存在一定的技术缺陷。

在萃取溶剂方面，文献“蜘蛛香中的环烯醚萜和木脂素”（Sheng Lin,Tao Chen,Xiao-Hua Liu,et al.Iridoids and Lignans from Valeriana jatamansi.J.Nat.Prod2010;73,632–638）公开了蜘蛛香乙醇提取物用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析分离。该方法从乙酸乙酯萃取物中分离得到了大量环烯醚萜类成分，包括13个新的环烯醚萜，但乙酸乙酯极性较大，在萃取出环烯醚萜类成分的同时，会引入非环烯醚萜酯类杂质，比如，本研究从乙酸乙酯提取物中亦分离到了14个木脂素类成分，存在一定技术缺陷。

在环烯醚萜酯有效部位提取方法方面，冷浸法、回流提取法、超临界流体萃取法均有应用。冷浸法提取效率低，提取溶剂用量大；回流提取法可能会造成一些热敏性环烯醚萜酯类成分的降解；超临界流体萃取法提取效率高，但设备昂贵，会增加生产成本。

在环烯醚萜酯纯化工艺方面，大孔吸附树脂法应用较多。该法首先要用一定量的水将环烯醚萜酯粗提物溶解，上样，再用一定质量分数的乙醇溶液梯度洗脱。环烯醚萜酯大多为脂溶性较强的油状物质，在水中溶解度非常小，故上样时，水溶液体积会比较大，若溶解不完全，有环烯醚萜酯析出，还会造成大孔吸附树脂上网状孔穴的堵塞，影响纯化效果；乙醇极性较大，既使高质量分数的乙醇（如95%乙醇）洗脱时，亦会将大量极性较大的非环烯醚萜酯类杂质洗脱到有效部位，进而，影响环烯醚萜酯有效部位的纯度。

在败酱科缬草属植物环烯醚萜酯有效部位应用方面，文献报道多集中在镇静、催眠、抗抑郁等方面，其在癌症治疗方面的应用研究鲜有报道。

经检索专利文献，中国专利文献公开了“蜘蛛香及其提取物在制备治疗焦虑症的药物中的用途”[申请号：200510021662.8]。该专利公开的蜘蛛香提取物制备方法主要包括以下步骤：蜘蛛香药材打粉，用90%乙醇回流提取，提取物回收乙醇，加水溶解，上大孔树脂纯化，收集70%的乙醇洗脱液，减压回收溶剂，即得到所述提取物，该提取物中，环烯醚萜类成分的质量分数为30～80%，所述蜘蛛香提取物主要用于治疗焦虑症。

（三）发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种科学合理，工艺操作简单的败酱科缬草属植物蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位的制备方法。

本发明采用的技术方案是：

一种蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位的提取方法，所述方法包括：

（1）取蜘蛛香药材粉碎，过筛，以75～95%（v/v）乙醇水溶液浸泡24～48h后用75～95%乙醇水溶液渗漉提取，收集渗漉液；所述75～95%乙醇水溶液总用量蜘蛛香药材质量的10～20倍（即乙醇水溶液用量为10～20mL/g蜘蛛香药材）；渗漉法提取效率高，提取溶剂用量少，常温提取能耗低，简便可行。文献报道，环烯醚萜酯对酸、热、光不稳定，易降解（张振学；药用植物缬草的化学研究进展；中国药物化学杂志；2000年第10卷第3期），因此本发明采用渗漉法在常温下操作，不会造成热敏性有效成分的破坏。所用蜘蛛香药材为蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）的根茎，被2010版中国药典收载，价廉易得；

（2）步骤（1）渗漉液浓缩回收乙醇，所得浸膏用3～10倍量的水混悬后（即水用量为3～10mL/g浸膏），再用浸膏3～10倍量（即二氯甲烷用量为3～10mL/g浸膏）的二氯甲烷萃取3～5次，合并萃取液，萃取液回收溶剂，得到蜘蛛香的二氯甲烷提取物；二氯甲烷极性大于现有技术中的石油醚，能够将蜘蛛香提取物中环氧环烯醚萜酯类成分萃取完全；二氯甲烷极性小于现有技术中的乙酸乙酯，不但能将环氧环烯醚萜酯类成分完全萃取出来，还能够剔除一些易溶于乙酸乙酯的极性略大的非环烯醚萜酯类杂质，从而使得蜘蛛香有效部位中环氧环烯醚萜酯类活性成分的含量更高，纯度更高。

（3）二氯甲烷提取物上正相氧化铝或100～200目硅胶柱，以石油醚和乙酸乙酯体积比40～0:1的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，收集石油醚和乙酸乙酯体积比15～2:1的洗脱液；所述洗脱溶剂洗脱能力强，能够保证得到性能稳定、药理活性好的蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位。洗脱溶剂有比较严格的要求，并对体积比有限定，所述洗脱溶剂洗脱能力强，能够保证得到性能稳定、药理活性好的蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位。通过薄层色谱（TLC）分离，Epstahl试剂显色后检识，蜘蛛香环氧环烯醚萜酯类成分几乎全部位于由体积比为15～2︰1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱剂洗脱后的洗脱液中，使得蜘蛛香有效部位中环氧环烯醚萜酯类活性成分含量更高，分布更加集中。

（4）洗脱液用旋转蒸发仪在40～45℃减压回收溶剂，得到所述蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位，该有效成分中包含多个具有“三元氧环”的环烯醚萜酯。

优选的，步骤（1）浸泡和渗漉所用溶剂为95%乙醇。该提取溶剂的性质非常适合于提取蜘蛛香的根茎和/或根，能够更加高效、完全地获取植物药用部位中的环氧环烯醚萜酯类活性成分，且能避免大量极性较大的非环烯醚萜酯类杂质被提取出来。

优选的，步骤（3）所用洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯体积比15～2:1的混合溶剂。

按照本发明方法制备得到的环氧环烯醚萜酯有效部位，可作为治疗癌症药物的应用。更具体地说，该环氧环烯醚萜酯有效部位对人胃癌、人肺癌、人胰腺癌、人结肠癌等四种人源肿瘤细胞株，具有一定的抑制作用。以MTT法，对得到的蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位，进行了抑制人源肿瘤细胞株增殖活性研究，结果显示，本发明制备的环氧环烯醚萜酯有效部位对人胃癌、人肺癌、人胰腺癌、人结肠癌四种人源肿瘤细胞株具有显著的抑制作用，半数抑制浓度IC₅₀约为：1.39～5.94μg/mL。上述细胞株可采用市售产品，如：可采用美国模式培养物集存库ATCC（Americantype culture collection）的各种细胞株。

本发明蜘蛛香有效部位可与市售或者常用的载体结合，可用于制备预防或者/和治疗，或者/和协同治疗癌症的药物。所述的药物可以为脂肪乳剂、注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂等形式。

与现有的技术相比，本发明的有益效果主要体现在：按照本发明方法制得的环氧环烯醚萜酯有效部位生理活性强，含有多个在生物医药领域具有广阔应用前景的环氧环氧环烯醚萜酯小分子。有效部位，多个成分之间具有“多组分、多靶点”的协同作用，能够一定程度上代表药材的整体药效，并且具有质量可控、剂量小、使用方便等优点，有别于传统中药“粗、大、黑”的落后应用形式。本发明利用系统溶剂法及正相色谱法，分离、纯化得到了富含环氧环烯醚萜酯的有效部位。使用的溶剂廉价易得，且毒性较低。正相色谱与大孔吸附树脂等分离、纯化方法相比，更适合进行工业化生产，制得的有效部位纯度更高。本发明蜘蛛香有效部位的制备方法科学合理，操作简单，生产成本低，适于工业化大生产。

（四）附图说明

图1为本发明蜘蛛香环烯醚萜酯有效部位超高效液相色谱图。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

本蜘蛛香环烯醚萜酯有效部位的制备方法包括下述步骤：

A、提取：蜘蛛香药材打粉，过40目筛备用。取蜘蛛香药材粗粉7kg，加适量提取溶剂润湿后装柱，再加适量95%乙醇冷浸24h后渗漉提取，收集渗漉液。提取总溶剂体积相当于药材质量的15倍量（总计用去95%的乙醇105L）。

B、萃取：将步骤A得到的渗漉液减压浓缩至近干，得稠浸膏527.4g，加水混悬至3L，分别用3L的二氯甲烷、3L的乙酸乙酯、3L的正丁醇萃取，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次的萃取液，分别得到蜘蛛香二氯甲烷萃取液，乙酸乙酯萃取液，正丁醇萃取液，通过薄层色谱（TLC）分离，经Epstahl试剂显色，蜘蛛香环烯醚萜酯蓝色斑点主要集中在二氯甲烷萃取液中，二氯甲烷萃取液减压回收溶剂，得到蜘蛛香二氯甲烷提取物361.8g。

C、柱层析：取上述蜘蛛香二氯甲烷提取物，上100～200目的正相硅胶柱进行分离，然后分别使用多个不同的洗脱溶剂洗脱，各个洗脱溶剂均由石油醚和乙酸乙酯组成，且体积均为23L，各个洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为40︰1，20︰1，15︰1，12︰1，10︰1，8︰1，6︰1，4︰1，2︰1，1︰1，0︰1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分经薄层色谱（TLC）分离，Epstahl试剂显色，蜘蛛香环氧环烯醚萜酯蓝色斑点主要集中在石油醚和乙酸乙酯15～2︰1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，得到蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位199.0g。

取上述制备的蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位约0.1g，精密称定，用甲醇定容至5mL容量瓶中，配成约20mg/mL的样品，样品10000r/min离心10min，取上清液，备用。取上述样品供试液，进行Waters AcquityUPLC/TUV超高效液相色谱分析，色谱条件为：流速0.25mL/min，紫外吸收波长：210nm，洗脱体系：乙腈-水，洗脱条件：0～10min，20～45%乙腈；10～35min，45～75%乙腈；35～39min，75～100%乙腈；39～40min，100%乙腈，进样量1μL。其超高效液相色谱如图1所示。

实施例2：

A、提取：取蜘蛛香药材7kg，加8倍量（56L）95%乙醇，85℃回流提取，每次提取时间为2h，共提取2次，合并两次提取液。总计用去95%的乙醇112L。

B、萃取：将步骤A得到的提取液减压浓缩至近干，得稠浸膏586.4g，加水混悬至3L，分别用3L的二氯甲烷、3L的乙酸乙酯、3L的正丁醇萃取，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次的萃取液，分别得到蜘蛛香二氯甲烷萃取液、乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液，通过薄层色谱（TLC）分离，经Epstahl试剂显色，蜘蛛香环氧环烯醚萜酯蓝色斑点主要集中在二氯甲烷萃取液中，二氯甲烷萃取液减压回收溶剂，得到蜘蛛香二氯甲烷提取物358.5g。

C、柱层析：取上述蜘蛛香二氯甲烷提取物，上100～200目的正相硅胶柱进行分离，然后分别使用多个不同的溶剂梯度洗脱，各个洗脱溶剂均由石油醚和乙酸乙酯组成且体积均为23L，各个洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为40︰1，20︰1，15︰1，12︰1，10︰1，8︰1，6︰1，4︰1，2︰1，1︰1，0︰1，，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分经薄层色谱（TLC）分离，Epstahl试剂显色，蜘蛛香环氧环烯醚萜酯蓝色斑点集中于石油醚和乙酸乙酯15～2︰1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，即得到蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位184.7g。

实施例2提取溶剂较实施例1多了1倍量，但有效部位的得率较实施例1略低，可见渗漉法对有效部位的提取效率较回流提取法高。回流提取法在85℃操作，若工业化大生产，其能源消耗将增加生产成本；另外，85℃的高温也可能会引起热敏性环烯醚萜酯的降解。

实施例3：

A、提取：蜘蛛香药材打粉，过40目筛备用。取蜘蛛香药材粗粉7kg，加提取溶剂润湿后装柱，加适量75%乙醇冷浸24h后渗漉提取，提取溶剂体积相当于药材质量的15倍量（总计用去75%的乙醇105L），收集渗漉液。

B、萃取：将步骤A得到的渗漉液减压浓缩至近干，得稠浸膏613.5g，加水混悬至3L，分别用3L的二氯甲烷、3L的乙酸乙酯、3L的正丁醇萃取，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次的萃取液，分别得到蜘蛛香二氯甲烷萃取液，乙酸乙酯萃取液，正丁醇萃取液，通过薄层色谱（TLC）分离，经Epstahl试剂显色，蜘蛛香环氧环烯醚萜酯蓝色斑点主要集中在二氯甲烷萃取液中，二氯甲烷萃取液减压回收溶剂，得到蜘蛛香二氯甲烷提取物372.9g。

C、柱层析：取上述蜘蛛香二氯甲烷提取物，上100～200目的正相硅胶柱进行分离，然后分别使用多个不同的溶剂梯度洗脱，各个洗脱溶剂均由石油醚和乙酸乙酯组成且体积均为23L，各个洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为40︰1，20︰1，15︰1，12︰1，10︰1，8︰1，6︰1，4︰1，2︰1，1︰1，0︰1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。各流分经薄层色谱（TLC）分离，Epstahl试剂显色，蜘蛛香环氧环烯醚萜酯蓝色斑点集中于石油醚和乙酸乙酯15～2︰1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，即得到蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位174.5g。

实施例3用75%的乙醇渗漉提取，乙醇提取物得率及二氯甲烷萃取物得率均较实施例1高，但有效部位得率却低于实施例1。75%乙醇极性较大，根据相似相容原理，其对极性小的环氧环烯醚萜酯必然提取不完全，又容易将极性较大的非环烯醚萜酯类杂质也提取出来，影响后续硅胶柱层析及有效部位得率。

实施例4：

A、提取：取蜘蛛香药材7kg，加10倍量水，100℃回流提取，每次提取时间为2h，共提取2次，合并两次提取液。总计用去140L水。

B、萃取：将步骤A得到的提取液减压浓缩至近干，得稠浸膏783.6g，加水混悬至3L，分别用3L的二氯甲烷、3L的乙酸乙酯、3L的正丁醇萃取，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次萃取液，分别得到蜘蛛香二氯甲烷萃取液，乙酸乙酯萃取液，正丁醇萃取液，通过薄层色谱（TLC）分离，经Epstahl试剂显色，蜘蛛香环氧环烯醚萜酯蓝色斑点主要集中在二氯甲烷萃取液中，二氯甲烷萃取液减压回收溶剂，得到蜘蛛香二氯甲烷提取物294.7g。

C、柱层析：取上述蜘蛛香二氯甲烷提取物，上100～200目的正相硅胶柱进行分离，然后分别使用多个不同的溶剂梯度洗脱，各个洗脱溶剂均由石油醚和乙酸乙酯组成且体积均为23L，各个洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为40︰1，20︰1，15︰1，12︰1，10︰1，8︰1，6︰1，4︰1，2︰1，1︰1，0︰1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。各流分经薄层色谱（TLC）分离，Epstahl试剂显色，蜘蛛香有效部位蓝色斑点集中于石油醚和乙酸乙酯15～2︰1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，即得到蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位137.3g。

实施例4以水作提取溶剂。水的极性较大，而环氧环烯醚萜酯的极性较小，按相似相容原理，有效部位得率必然低。因此实施例4水提浸膏得率虽远高于实施例1，但二氯甲烷萃取物得率及环氧环烯醚萜酯有效部位得率均远低于实施例1。水提法，能耗也较大，且可能会造成热敏性活性成分的降解。

实施例5：

A、提取：蜘蛛香药材打粉，过40目筛备用。取蜘蛛香药材粗粉7kg，加适量提取溶剂润湿后装柱，再加适量95%乙醇冷浸24h后渗漉提取，提取总溶剂体积相当于药材质量的15倍量，收集渗漉液。总计用去95%的乙醇105L。

B、萃取：将步骤A得到的渗漉液减压浓缩至近干，得稠浸膏531.6g，加水混悬至3L，分别用3L的乙酸乙酯、3L的正丁醇萃取，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次的萃取液，分别得到蜘蛛香乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液，通过薄层色谱（TLC）分离，经Epstahl试剂显色，蜘蛛香环氧环烯醚萜酯蓝色斑点主要集中在乙酸乙酯萃取液中，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到蜘蛛香乙酸乙酯提取物406.4g。

C、柱层析：取上述蜘蛛香乙酸乙酯提取物，上100～200目的正相硅胶柱进行分离，然后分别使用多个不同的洗脱溶剂洗脱，各个洗脱溶剂均由石油醚和乙酸乙酯组成，且体积均为23L，各个洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为40︰1，20︰1，15︰1，12︰1，10︰1，8︰1，6︰1，4︰1，2︰1，1︰1，0︰1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分经薄层色谱（TLC）分离，Epstahl试剂显色，蜘蛛香环氧环烯醚萜酯蓝色斑点主要集中于石油醚和乙酸乙酯15～2︰1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，得到蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位208.7g。

实施例5以乙酸乙酯做为萃取溶剂。乙酸乙酯极性较大，萃取时会将一些极性略大的非环烯醚萜酯类也萃取出来，故乙酸乙酯萃取物得率较实施例1二氯甲烷萃取物得率高，这也影响了后续硅胶柱层析的效果，虽然有效部位得率略有提高，但石油醚-乙酸乙酯4～2︰1，流分中多了一些非环烯醚萜酯类杂质斑点，降低了有效部位中环氧环烯醚萜酯的纯度。

实施例6：

A、提取：蜘蛛香药材打粉，过40目筛备用。取蜘蛛香药材粗粉7kg，加适量提取溶剂润湿后装柱，再加适量95%乙醇冷浸24h后渗漉提取，收集渗漉液。提取总溶剂体积相当于药材质量的15倍量（总计用去95%的乙醇105L）。

B、萃取：将步骤A得到的渗漉液减压浓缩至近干，得稠浸膏529.1g，加水混悬至3L，分别用3L的二氯甲烷、3L的乙酸乙酯、3L的正丁醇萃取，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次的萃取液，分别得到蜘蛛香二氯甲烷萃取液，乙酸乙酯萃取液，正丁醇萃取液，通过薄层色谱（TLC）分离，经Epstahl试剂显色，蜘蛛香环氧环烯醚萜酯蓝色斑点主要集中在二氯甲烷萃取液中，二氯甲烷萃取液减压回收溶剂，得到蜘蛛香二氯甲烷提取物359.7g。

C、柱层析：取上述蜘蛛香二氯甲烷提取物，上正相氧化铝柱进行分离，然后分别使用多个不同的洗脱溶剂洗脱，各个洗脱溶剂均由石油醚和乙酸乙酯组成，且体积均为23L，各个洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为40︰1，20︰1，15︰1，12︰1，10︰1，8︰1，6︰1，4︰1，2︰1，1︰1，0︰1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分经薄层色谱（TLC）分离，Epstahl试剂显色，蜘蛛香环氧环烯醚萜酯蓝色斑点主要集中于石油醚和乙酸乙酯15～2︰1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，得到蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位201.5g。

实施例6以氧化铝为填料，二氯甲烷提取物上正相柱进行分离，结果显示有效部位得率与实施例1接近，故正相柱填料用氧化铝及100～200目硅胶均可。

实施例7：

A、提取：蜘蛛香药材打粉，过40目筛备用。取蜘蛛香药材粗粉7kg，加适量提取溶剂润湿后装柱，再加适量95%乙醇冷浸24h后渗漉提取，收集渗漉液。提取总溶剂体积相当于药材质量的15倍量（总计用去95%的乙醇105L）。

B、大孔树脂纯化：将步骤A得到的渗漉液减压浓缩至近干，得稠浸膏528.1g，稠浸膏加约10L水使溶解，上AB-8型大孔树脂柱纯化，采用动态吸附法上样，用95%的乙醇洗脱，收集4个柱体积的洗脱液，洗脱液减压回收溶剂，得到蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位245.9g。

实施例7采用大孔树脂法对有效部位进行分离、纯化。蜘蛛香95%的乙醇提取物，在水中很难溶解，溶解不完全，会堵塞大孔树脂上的网状孔穴，操作时加了约10L水才将提取物溶解，这导致后续上样花了较多时间。从有效部位得率看，大孔树脂法高于实施例1，但经薄层色谱分离，Epstahl试剂显色，大孔树脂法制得的有效部位中，除环氧环烯醚萜酯蓝色斑点外，还有黄色及褐色等杂质斑点，环氧环烯醚萜酯纯度低于实施例1，因此本发明选用正相氧化铝或正相硅胶柱。

实施例8：蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位体外抗肿瘤实验：

取对数生长期的人源肿瘤细胞株，消化计数后，按6～9×10³个细胞/100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，培养24h待细胞贴壁后，用不同浓度的实施例1制备的蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位处理，每孔设三个复孔。药物与肿瘤细胞孵育48h后，加MTT，37℃继续孵育4h后，终止培养，用移液枪轻轻吸掉培养液，加入DMSO（150μL/孔），振摇均匀后，用酶标仪在570nm处测定每个孔的光密度OD值，各平行孔的OD值取平均数，将各测试孔的OD值减去本底OD值。计算药物对肿瘤细胞的抑制率。

抑制率=（1-给药孔平均光密度值/对照组平均光密度值）×100%。根据抑制率计算药物对肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC₅₀），IC₅₀用origin软件计算。实验重复3次，IC₅₀取mean±SD。

分别对人胃癌SGC-7901、MKN-45，人肺癌NCI-H1975，人胰腺癌BXPC-3，人结肠癌HT-29，五株人源肿瘤细胞株进行试验，上述细胞株购自ATCC，具体结果如表1所示。表1的结果显示，蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位体外对五株人源肿瘤细胞株均具有显著的抑制作用。

表1：蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位对人源肿瘤细胞株的半数抑制浓度

IC₅₀值（mean±SD，n=3）

肿瘤细胞株	细胞来源	IC50值（μg/mL）
			SGC-7901	胃癌	5.94±0.13
MKN-45	胃癌	1.39±0.07
			NCI-H1975	肺癌	2.61±0.10
BXPC-3	胰腺癌	1.71±0.06
			HT-29	结肠癌	4.43±0.12

本发明制备得到的蜘蛛香环烯醚萜酯有效部位可与市售或者常用的载体结合，用于制备预防、治疗、协同治疗癌症的药物。所述药物可以为脂肪乳剂、注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂等形式。

本发明蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位，当在治疗上进行施用（给药）时，可提供不同的效果。通常，可将本发明制备的蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中，pH通常约5～8，较佳的pH约为6～8，pH可根据所选辅料、基质及治疗疾病病症的不同而有所变化。配制好的药物可以通过常规途径给药，包括（但并不限于）：肌肉、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。所用载体介质包括（但并不限于）：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡糖糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊剂之类的药物，也可通过常规方法进行制备。药物如针剂溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。药物活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天1μg/kg体重～2000mg/kg体重。此外，本发明制备的蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位，还可以与其它抗肿瘤药物协同使用。

当本发明蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位被用做药物时，可将治疗有效剂量的蜘蛛香环烯醚萜酯有效部位施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少10μg/kg体重，而且在大多数情况下不超过50mg/kg体重，较佳的给药剂量约为10μg/kg体重～30mg/kg体重。具体剂量还应考虑给药方式、病人健康状况等因素，这些属熟练医师技能范畴以内。

本发明中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (3)

1.蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位的制备方法，所述方法包括：

（1）取蜘蛛香药材粉碎，过筛，以75～95%乙醇浸泡24～48h后，用75～95%乙醇渗漉提取，收集渗漉液；所述75～95%乙醇总用量为蜘蛛香药材质量的10～20倍；

（2）步骤（1）渗漉液减压回收乙醇，所得浸膏用3～10倍量的水混悬后，再用浸膏3～10倍量的二氯甲烷萃取3～5次，合并萃取液，萃取液回收溶剂，得到蜘蛛香的二氯甲烷提取物；

（3）二氯甲烷提取物上正相氧化铝或100～200目硅胶柱，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，收集石油醚和乙酸乙酯体积比15～2:1的洗脱液；

（4）洗脱液用旋转蒸发仪在40～45℃减压回收溶剂，得到所述蜘蛛香环氧环烯醚萜酯有效部位。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中浸泡和渗漉所用溶剂为95%乙醇。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）所用洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯体积比15～2:1的混合溶剂。

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