CN107243005A - 一种从野马追中提取的抗癌组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从野马追中提取的抗癌组合物及其制备方法和应用，该抗癌组合物由以Eupalinolide G、Eupalinolide I、Eupalinolide J为主要活性成分，依次通过渗漉、正相硅胶柱层析、反相中压柱层析等方法从野马追中进行分离得到。MTT法及人源肿瘤裸鼠异种移植瘤实验，分别研究了所述野马追三个倍半萜内酯天然组合物体外及体内抗乳腺癌活性，结果表明，该组合物可用于乳腺癌的治疗。该方法制备的野马追三个倍半萜内酯天然组合物，生物活性强，操作简单，生产成本低，并且具有质量稳定、可控等优点，可用于乳腺癌治疗药物的制备。

Description

一种从野马追中提取的抗癌组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于天然药物活性组分技术领域，涉及从中药中提取、制备有效组分及其应用的领域，尤其是涉及一种菊科泽兰属中药野马追中三个倍半萜内酯天然组合物的制备方法及其在乳腺癌治疗中的应用。
背景技术
菊科(Compositae)泽兰属(Eupatorium L.)植物全世界约有600余种，主要分布于中南美洲的温带及热带地区。我国有14个种，若干个变种，除新疆、西藏外全国均产。泽兰属作为药用的植物，目前应用较多的有林泽兰、华泽兰等八个种。该属植物具有悠久的用药历史。
野马追为菊科泽兰属植物林泽兰(Eupatorium lindleyanum DC.)的干燥地上部分，在我国分布较广，具有多年用药历史，现被我国2015版药典收载。野马追，味苦、性平，归肺经，具有清热解毒，化痰止咳、平喘等功效，可用于劳伤咳嗽、吐血咳血以及淋浊白带、无名肿痛等治疗。
野马追已被开发成颗粒剂、糖浆剂等多种中成药应用于临床。野马追糖浆是名优中成药，主要用于呼吸系统疾病，如咳嗽等治疗，产生了显著的社会及经济效益。
野马追含有黄酮、倍半萜内酯等化学成分。黄酮类成分与其呼吸系统生物活性相关，2015版药典以金丝桃苷为其指标性活性成分。野马追倍半萜内酯类成分亦为野马追重要生理活性成分。迄今为止，虽然文献报道，对野马追进行了较系统的化学成分研究，已从野马追中提取、分离得到了一系列新颖倍半萜内酯类化合物，并且鉴定了其化学结构；文献亦报道多个倍半萜内酯类化合物单体体外具有抗肿瘤活性。但迄今未有对野马追中含有的特定倍半萜内酯类成分组合物的研究报道，亦没有提供一种工艺科学合理，组合物性能稳定、药效物质明确、纯度高、生物活性强的野马追倍半萜内酯组合物的制备方法，及其在临床发病率高的乳腺癌治疗方面的应用。
目前，在提取溶剂及提取方法方面，文献“野马追地上部分的化学成分研究(Ⅱ)”(杨念云；中国天然药物；2005年第3卷)；文献“Six New Sesquiterpenes from Eupatoriumlindleyanum”(Shuang-Qing Wu；2012年第95卷)均公开了野马追中倍半萜内酯类成分的提取方法，两个研究均用80％的乙醇加热回流提取。80％的乙醇在提取野马追倍半萜内酯类成分方面具有优势，但该提取溶剂亦能引入较多非倍半萜内酯类杂质，对后续的分离、纯化造成一定的影响；加热回流提取亦可能造成热敏性倍半萜内酯类成分的降解；加热提取亦有较大的能耗。
在萃取溶剂方面，文献“Cytotoxic sesquiterpene lactones from Eupatoriumlindleyanum”(N.-Y.Yang；Journal of Asian Natural Products Research；2007年第9卷)公开了野马追倍半萜内酯的提取、纯化方法。该方法在纯化倍半萜内酯粗提物时，用氯仿对野马追95％乙醇提取物进行萃取，氯仿的极性在萃取倍半萜内酯类成分方面具有一定优势，但氯仿有一定肝毒性，作为工业生产不符合绿色、环保等理念，存在一定的技术缺陷。
文献“Cytotoxic Sesquiterpene Lactones from Eupatorium lindleyanum”(Jun Huo；Journal of Natural Products；2004年第64卷)公开了野马追中倍半萜内酯类成分的提取、纯化方法，该方法未对95％的野马追乙醇提取物进行萃取，乙醇提取物直接进行硅胶柱层析分离，会引入大量非倍半萜内酯类杂质，且影响硅胶柱层析的分离效能。
在纯化方法方面，“Preparative Isolation and Purification of ThreeSesquiterpenoid Lactones from Eupatorium lindleyanum DC.by High-SpeedCounter-Current Chromatography”(Guilong Yan；Molecules；2012年第17卷)公开了三个倍半萜内酯类成分的分离、纯化方法，该方法主要利用高速逆流色谱法分离、纯化倍半萜内酯类单体。高速逆流色谱法具有绿色、环保等特点，配合HPLC分析，在确定两相溶剂基础上，能高效分离到高纯度单体，但迄今未有利用高速逆流色谱用于分离、纯化野马追倍半萜内酯组合物的研究报道。
中国专利“野马追在制备抗乙肝病毒药物中的应用”(张健，专利申请号：201410244607.4)公开了一种野马追乙醇提取物的制备方法，该方法用一定比例乙醇回流提取野马追药材，提取物上大孔树脂除杂，大孔树脂部位再上ODS柱纯化，纯化后产物再上聚酰胺柱层析，用70％乙醇水洗脱，即得所述乙醇提取物。该纯化方法所得乙醇提取物在抗乙肝病毒药物应用方面具有生物活性强等优势。但在制备高纯度特定倍半萜内酯组合物方面，步骤略显复杂，且所得野马追乙醇提取物化学物质类别有黄酮类、倍半萜内酯类、链状二萜类。文献报道，野马追倍半萜内酯类成分具有显著体外抗肿瘤活性，其它类别化学成分的引入，可能使其抗肿瘤活性减弱。
在野马追倍半萜内酯纯化工艺方面，硅胶柱层析法应用较多。该法对野马追倍半萜内酯的分离、纯化具有一定优势。文献报道的多是某些倍半萜内酯单体的分离、纯化，较少涉及野马追倍半萜内酯有效流分。
在野马追倍半萜内酯应用方面，文献报道野马追倍半萜内酯可用于抗肿瘤方面的应用，但文献多集中在倍半萜内酯单体的体外抗肿瘤活性，倍半萜内酯单体开发抗肿瘤新药具有高成本、高风险等缺陷。特定倍半萜内酯天然组合物，具有抗肿瘤活性确切，药效物质明确，质量稳定、可控等优势，且组合物具有多组分协同，增效减毒等优势，亦符合中药多组分、多靶点协同发挥药效的特色。倍半萜内酯组合物可用于制备中药五类抗肿瘤新药，符合中国新药研发的特色与优势。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种科学合理，工艺操作简单的菊科泽兰属中药野马追三个倍半萜内酯天然组合物的制备方法。所述野马追三个倍半萜内酯天然组合物药效物质明确，纯度高，野马追三个倍半萜内酯协同，亦符合中药多组分、多靶点协同发挥药效的优势及特点，其对发病率较高的乳腺癌的体内、外抑制活性亦预示其具有重要的应用价值。
一种从野马追中提取的抗癌组合物，其活性成分由Eupalinolide G、Eupalinolide I、Eupalinolide J组成，Eupalinolide G、Eupalinolide I、EupalinolideJ化学结构式分别如A、B、C所示：
其中，组分A、组分B和组分C的质量比为30～40：40～60：10～20。
本发明还提供了一种所述的抗癌组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将野马追药材粉碎、过筛，用乙醇浸泡24～48h后，然后用乙醇渗漉提取，收集渗漉液；
(2)将步骤(1)的渗漉液减压回收乙醇，所得浸膏用混悬后，再用乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液，萃取液回收溶剂，得到野马追乙酸乙酯粗提物；
(3)乙酸乙酯粗提物上正相氧化铝或100～200目硅胶柱，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含有所述抗癌组合物的有效流分，减压回收溶剂，得到粗产物；
(4)将步骤(3)制备得到的粗产物，进行ODS中压柱层析分离，进一步收集富含所述抗癌组合物的流分，减压回收溶剂，即得到所述的抗癌组合物。
步骤(1)中，渗漉法提取效率高，提取溶剂用量少，常温提取能耗低，简便可行。此外，采用渗漉法在常温下操作，亦不会造成热敏性有效成分的破坏或降解。所用野马追药材为菊科泽兰属中药野马追(Eupatorium lindleyanum DC.)的地上部分和或全草，野马追被2015版中国药典收载，价廉易得。
作为优选，步骤(1)中，所述乙醇的体积百分含量为75～95％，用量为野马追药材质量的10～20倍。作为进一步的优选，步骤(1)浸泡和渗漉所用溶剂为95％乙醇。该提取溶剂的性质非常适合于提取野马追的全草和/或地上部分，能够更加高效、完全地获取药用部位中所述倍半萜内酯类活性成分，且能避免大量极性较大的非倍半萜内酯类杂质被提取出来。
步骤(2)中，乙酸乙酯极性大于现有技术中的石油醚，能够将野马追乙醇提取物中倍半萜内酯类成分萃取完全；乙酸乙酯萃取，亦剔除了野马追醇提物中极性较大的非倍半萜内酯类杂质，乙酸乙酯毒性较小，工业生产亦符合绿色、环保等理念。作为优选，步骤(2)中，混悬所用的水的量为浸膏质量的3～10倍，萃取所用的乙酸乙酯的量为浸膏质量的3～10倍。
作为优选，步骤(3)中，收集石油醚-乙酸乙酯体积比为：3︰2～0︰1的流分作为有效流分。所述洗脱溶剂洗脱能力强，能够保证得到性能稳定、药理活性好的富含野马追倍半萜内酯的有效流分。洗脱溶剂有比较严格的要求，并对体积比有限定，所述洗脱溶剂洗脱能力强，能够保证得到性能稳定、药理活性好的野马追倍半萜内酯有效流分。体外抗乳腺癌活性追踪显示：野马追倍半萜内酯类成分几乎全部位于由体积比为3:2～0:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱剂洗脱后的洗脱液中，使得野马追有效流分中倍半萜内酯类活性成分含量更高，分布更加集中。利用常规中药化学研究方法，研究了有效流分的药效物质，并对所得化合物体外抗肿瘤活性进行了评估，综合考虑，确定制备以Eupalinolide G、EupalinolideI、Eupalinolide J为主要成分的野马追三个倍半萜内酯天然组合物。
作为优选，步骤(4)中，中压柱层析分离采用40～60μm的十八烷基键合相硅胶作为填料，上样后分别用体积分数45％，60％，75％甲醇水溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱约3～4个柱体积。
本发明还提供了一种所述的抗癌组合物在制备抗癌药物中的应用，所述的抗癌药物用于乳腺癌的治疗。
该倍半萜内酯组合物体内、外对人源乳腺癌，均具有一定的抑制作用。以MTT法对得到的野马追倍半萜内酯组合物，进行了抑制人源乳腺癌细胞株增殖活性研究，结果显示，本发明制备的野马追三个倍半萜内酯天然组合物对MDA-MB-468、MDA-MB-231两种人源乳腺癌细胞株具有显著的抑制作用，半数抑制浓度IC50约为：3.06～4.30μg/mL，上述细胞株可采用市售产品，如：可采用美国模式培养物集存库ATCC(American type culturecollection)的各种细胞株。以人源乳腺癌细胞株裸鼠异种移植瘤实验，评价了所述抗癌组合物体内抗乳腺癌活性，结果显示，25mg/kg剂量的所述抗癌组合物腹腔注射给药20天，抑瘤率为40.2％，且未见毒性反应。
本发明野马追三个倍半萜内酯天然组合物可与市售或者常用的载体结合，可用于制备预防或者/和治疗，或者/和协同治疗乳腺癌的药物。所述的药物可以为脂肪乳剂、注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂等形式。
与现有的技术相比，本发明的有益效果主要体现在：按照本发明方法制备所得的野马追三个倍半萜内酯天然组合物，生物活性强，含有多个在生物医药领域具有广阔应用前景的倍半萜内酯类成分。三个倍半萜内酯天然组合物“多组分、多靶点”协同，能在一定程度上发挥中药多组分协同的整体优势，并且，该倍半萜内酯天然组合物药效物质明确，纯度高，质量稳定、可控，具有剂量小、使用方便等优点，有别于传统中药“粗、大、黑”的落后应用形式。本发明利用系统溶剂法、正相硅胶柱色谱、反相中压柱色谱，配合有效流分的药效物质研究，及体内、外抗乳腺癌活性研究，分离、纯化得到了由野马追三个特定倍半萜内酯Eupalinolide G、Eupalinolide I、Eupalinolide J组成的天然组合物。使用的溶剂廉价易得，毒性较低。正相色谱及反相中压柱色谱均适合进行工业化生产，制得的所述倍半萜内酯组合物纯度更高，抗乳腺癌活性更强。本发明野马追三个倍半萜内酯天然组合物的制备方法科学合理，操作简单，生产成本低，适于工业化大生产。
附图说明
图1为本发明野马追三个倍半萜内酯天然组合物UPLC-MS色谱图。
图2(A、B、C、D)分别为色谱峰1对应倍半萜内酯Eupalinolide G的化学结构式、1HNMR、13C NMR、图1中色谱峰1对应质谱图。
图3(A、B、C、D)分别为色谱峰2对应倍半萜内酯Eupalinolide I的化学结构式、1HNMR、13C NMR、图1中色谱峰2对应质谱图。
图4(A、B、C、D)分别为色谱峰3对应倍半萜内酯Eupalinolide J的化学结构式、1HNMR、13C NMR、图1中色谱峰3对应质谱图。
图5(A、B、C、D)分别为对照组与25mg/kg剂量组合物给药20天后瘤块形态学图；各组别瘤块体积-时间曲线；各组别平均瘤块重量；各组别裸鼠体重-时间曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
野马追三个倍半萜内酯天然组合物的制备方法包括下述步骤：
A、提取：野马追药材打粉，过40目筛备用。取野马追药材粗粉7kg，加适量95％乙醇冷浸48h后渗漉提取，收集渗漉液。提取总溶剂体积相当于药材质量的18倍量(总计用去95％的乙醇126L)。
B、萃取：将步骤A得到的渗漉液减压浓缩至无醇味，加水混悬至2L，用2L的乙酸乙酯、2L的正丁醇萃取，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次的萃取液，分别得到野马追乙酸乙酯萃取液，正丁醇萃取液，通过体外抗乳腺癌活性追踪，野马追抗乳腺癌有效成分主要集中在乙酸乙酯萃取液中，得到野马追乙酸乙酯提取物194.0g。
C、柱层析：取上述野马追乙酸乙酯提取物约190g，上100～200目的正相硅胶柱进行分离，然后分别使用多个不同的洗脱溶剂洗脱，各个洗脱溶剂均由石油醚和乙酸乙酯组成，且体积均为12L(约3个柱体积)，各个洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为20︰1，15︰1，12︰1，10︰1，8︰1，6︰1，4︰1，3︰1，2︰1，3︰2，1︰1，0︰1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分，通过体外抗乳腺癌活性追踪，野马追有效成分主要集中在石油醚和乙酸乙酯3:2～0:1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，得到野马追有效流分54.7g。
D、野马追有效流分进行抗乳腺癌药效物质研究：按照常规中药化学研究方法，通过反相中压柱层析、制备型高效液相柱层析等，从野马追有效流分中分离鉴定了六个倍半萜内酯类化合物，经单体抗乳腺癌活性评估，综合考虑，确定制备以Eupalinolide G、Eupalinolide I、Eupalinolide J为药效物质的野马追三个倍半萜内酯天然组合物。
E、取C制备所得野马追有效流分约3g，用适量四氢呋喃溶解后，进行ODS中压柱层析分离，分别以45％、60％、75％甲醇水溶液梯度洗脱，每个溶剂梯度洗脱约2L(3～4个柱体积)，100mL/瓶，所得流分进行HPLC分析，以D中制备的Eupalinolide G、Eupalinolide I、Eupalinolide J对照品对照，收集富含三个倍半萜内酯的流分，合并，减压回收溶剂，即得所述野马追三个倍半萜内酯天然组合物，约1.11g。
取上述制备的野马追三个倍半萜内酯天然组合物约10mg，精密称定，用甲醇定容至2mL容量瓶中，配成约5mg/mL的样品，样品10000r/min离心10min，取上清液，备用。取上述样品供试液，进行UPLC-MS分析，色谱仪为Waters UPLC H-Class，质谱仪为AB QTRAP 5500。色谱条件为：流速0.2mL/min，洗脱体系：甲醇-水，洗脱条件：50％甲醇等度洗脱，进样量1μL。其UPLC-MS色谱图如图1所示。
实施例2
A、提取：取野马追药材7kg，加10倍量(70L)95％乙醇，回流提取，每次提取时间为2h，共提取2次，合并两次提取液。总计用去95％的乙醇140L。
B、萃取：将步骤A得到的提取液减压浓缩至无醇味，加水混悬至2L，分别用2L的乙酸乙酯、2L的正丁醇萃取，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次的萃取液，分别得到野马追乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液，通过体外抗乳腺癌活性追踪，野马追抗乳腺癌有效成分主要集中在乙酸乙酯萃取液中，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到野马追乙酸乙酯提取物234.8g。
C、柱层析：取上述野马追乙酸乙酯提取物约190g，上100～200目的正相硅胶柱进行分离，然后分别使用多个不同的溶剂梯度洗脱，各个洗脱溶剂均由石油醚和乙酸乙酯组成且体积均为12L(约3个柱体积)，各个洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为20︰1，15︰1，12︰1，10︰1，8︰1，6︰1，4︰1，3︰1，2︰1，3︰2，1︰1，0︰1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分，通过体外抗乳腺癌活性追踪，野马追有效成分主要集中在石油醚和乙酸乙酯3:2～0:1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，得到野马追有效流分53.2g。
D、取C制备所得野马追有效流分约3g，用适量四氢呋喃溶解后，进行ODS中压柱层析分离，分别以45％、60％、75％甲醇水溶液梯度洗脱，每个溶剂梯度洗脱约2L，100mL/瓶，所得流分进行HPLC分析，以实施例1制备所得的Eupalinolide G、Eupalinolide I、Eupalinolide J对照品对照，收集富含三个倍半萜内酯的流分，合并，减压回收溶剂，即得所述野马追三个倍半萜内酯天然组合物，约1.06g。
实施例2提取溶剂较实施例1多了2倍量；回流提取，能耗大大增加；高温下提取4h，亦可能造成热敏性倍半萜内酯的降解。野马追三个倍半萜内酯天然组合物的得率较实施例1略低，可见渗漉法对有效部位的提取效率较回流提取法高。回流提取法在约85℃操作，若工业大生产，其能源消耗对生产成本的增加，亦将不容忽视。
实施例3
A、提取：野马追药材打粉，过40目筛备用。取野马追药材粗粉7kg，加适量95％乙醇冷浸48h后渗漉提取，提取溶剂体积相当于药材质量的18倍量(总计用去95％的乙醇126L)，收集渗漉液。
B、冷冻干燥：将步骤A得到的渗漉液减压浓缩至无醇味，稠浸膏采用冷冻干燥法干燥，得到冻干粉279.4g。
C、柱层析：取上述野马追醇提取物的冻干粉约190g，上100～200目的正相硅胶柱进行分离，然后分别使用多个不同的溶剂梯度洗脱，各个洗脱溶剂均由石油醚和乙酸乙酯组成且体积均为12L(约3个柱体积)，各个洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为20︰1，15︰1，12︰1，10︰1，8︰1，6︰1，4︰1，3︰1，2︰1，3︰2，1︰1，0︰1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分，通过体外抗乳腺癌活性追踪，野马追有效成分主要集中在石油醚和乙酸乙酯3:2～0:1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，得到野马追有效流分42.6g。
D、取C制备所得野马追有效流分约3g，用适量四氢呋喃溶解后，进行ODS中压柱层析分离，分别以45％、60％、75％甲醇水溶液梯度洗脱，每个溶剂梯度洗脱约2L，100mL/瓶，所得流分进行HPLC分析，以实施例1制备所得的Eupalinolide G、Eupalinolide I、Eupalinolide J对照品对照，收集富含三个倍半萜内酯的流分，合并，减压回收溶剂，即得所述野马追三个倍半萜内酯天然组合物，约0.97g。
实施例3亦用95％的乙醇渗漉提取，但醇提物未进行系统溶剂法萃取粗分离，醇提物中含水，正相硅胶柱层析一定必须将提取物中水分蒸干，故增加了稠浸膏冷冻干燥的工艺。醇浸膏按照实施例1或2相同的柱层析工艺纯化时，由于醇浸膏中含有较多的非倍半萜内酯类杂质，故有效流分得率较实施例1或2有明显降低。在对洗脱流分进行体外抗乳腺癌活性追踪时，流分的抗乳腺癌活性亦有较显著下降。
实施例4
实施例1所得野马追乙酸乙酯提取物，直接进行体外抗乳胰腺癌活性评价。结果显示：乙酸乙酯提取物抗乳腺癌活性，较实施例1所得野马追三个倍半萜内酯天然组合物活性显著下降。高效液相色谱分析野马追乙酸乙酯提取物也显示，乙酸乙酯提取物成分复杂，需花较多精力去阐明其物质基础，亦很难做到质量稳定、可控。
实施例5
以氧化铝为填料，野马追乙酸乙酯提取物上正相柱进行分离，结果显示野马追三个倍半萜内酯天然组合物得率与实施例1接近，故正相柱填料用氧化铝及100～200目硅胶均可。
实施例6：野马追三个倍半萜内酯天然组合物体外抗乳腺癌实验
取对数生长期的人源乳腺癌细胞株，消化计数后，按6～9×103个细胞/100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，培养24h待细胞贴壁后，用不同浓度的实施例1制备的野马追三个倍半萜内酯天然组合物处理，每孔设三个复孔。药物与肿瘤细胞孵育48h后，加MTT，37℃继续孵育4h后，终止培养，用移液枪轻轻吸掉培养液，加入DMSO(150μL/孔)，振摇均匀后，用酶标仪在570nm处测定每个孔的光密度OD值，各平行孔的OD值取平均数，将各测试孔的OD值减去本底OD值。计算药物对肿瘤细胞的抑制率。
抑制率＝(1-给药孔平均光密度值/对照组平均光密度值)×100％。根据抑制率计算药物对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)，IC50用origin软件计算。实验重复3次，IC50取mean±SD。
分别对MDA-MB-468、MDA-MB-231，两株人源乳腺癌细胞株进行试验，上述细胞株购自ATCC，具体结果如表1所示。表1的结果显示，野马追三个倍半萜内酯天然组合物体外对两株人源乳腺癌细胞株均具有显著的抑制作用。
表1：野马追三个倍半萜内酯天然组合物对人源乳腺癌细胞株的半数抑制浓度IC50值(mean±SD，n＝3)
乳腺癌细胞株 细胞来源 IC50值(μg/mL)
MDA-MB-468 乳腺癌 3.06±0.28
MDA-MB-231 乳腺癌 4.30±0.39
实施例7：野马追三个倍半萜内酯天然组合物体内抗乳腺癌实验
取对数生长期的人源乳腺癌MDA-MB-231细胞株，用生理盐水调整细胞密度为5×107个细胞/mL。在SPF级条件下，给4周龄雌性裸鼠背部按照5×106个细胞进行皮下接种，100μL细胞悬液/只。待瘤块体积长至50mm3后，将裸鼠随机分为2组，每组6只，即：0mg/kg组合物(对照组)和25mg/kg组合物给药组。每天腹腔注射给药1次，每隔1天测量瘤块体积和裸鼠体重。给药20天后，CO2法处死裸鼠，解剖裸鼠，取出瘤块拍照并称重。瘤块体积按照以下公式计算：
肿瘤体积V＝1/2×a×b2计算，其中a＞b(a为肿瘤的最长长度，b为肿瘤的最短长度)。
结果显示，与对照组比较，25mg/kg所述组合物给药组，瘤块体积明显缩小，如图5(A)所示；给药20天，每隔1天测量瘤块体积，记录各组别平均瘤块体积-时间曲线，如图5(B)所示，结果表明，在各测量时间点，25mg/kg给药组瘤块体积均明显缩小，14、16、18、20天所测平均瘤块体积与对照组比较，均有显著性差异，给药第20天，按照所测平均瘤块体积计算抑瘤率为：40.2％；给药20天后，处死裸鼠，剥取瘤块，称重，25mg/kg给药组平均瘤块重量与对照组比较，明显减轻，有显著性差异，如图5(C)所示；给药20天，每隔1天称量裸鼠体重，记录各组别裸鼠体重-时间曲线，结果显示，与对照组比较，25mg/kg给药组裸鼠平均体重不减轻，表明：本发明所述抗癌组合物未见明显毒性反应，如图5(D)所示。
本发明制备得到的野马追三个倍半萜内酯天然组合物可与市售或者常用的载体结合，用于制备预防、治疗、协同治疗乳腺癌的药物。所述药物可以为脂肪乳剂、注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂等形式。
本发明野马追三个倍半萜内酯天然组合物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将本发明制备的野马追三个倍半萜内酯天然组合物配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中，pH通常约5～8，较佳的pH约为6～8，pH可根据所选辅料、基质及治疗疾病病症的不同而有所变化。配制好的药物可以通过常规途径给药，包括(但并不限于)：肌肉、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。所用载体介质包括(但并不限于)：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明野马追三个倍半萜内酯天然组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡糖糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊剂之类的药物，也可通过常规方法进行制备。药物活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天1μg/kg体重～2000mg/kg体重。此外，本发明制备的野马追三个倍半萜内酯天然组合物，还可以与其它抗乳腺癌药物协同使用。
当本发明野马追三个倍半萜内酯天然组合物被用做药物时，可将治疗有效剂量的野马追三个倍半萜内酯天然组合物施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少10μg/kg体重，而且在大多数情况下不超过50mg/kg体重，较佳的给药剂量约为10μg/kg体重～30mg/kg体重。具体剂量还应考虑给药方式、病人健康状况等因素，这些属熟练医师技能范畴以内。
本发明中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (7)

1.一种从野马追中提取的抗癌组合物，其特征在于，其活性成分由Eupalinolide G、Eupalinolide I和Eupalinolide J组成，Eupalinolide G、Eupalinolide I和Eupalinolide J化学结构式分别如A、B、C所示：
2.一种如权利要求1所述的抗癌组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将野马追药材粉碎、过筛，用乙醇浸泡24～48h后，然后用乙醇渗漉提取，收集渗漉液；
(2)将步骤(1)的渗漉液减压回收乙醇，所得浸膏用水混悬后，再用乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液，萃取液回收溶剂，得到野马追乙酸乙酯粗提物；
(3)乙酸乙酯粗提物上正相氧化铝或100～200目硅胶柱，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含有所述抗癌组合物的有效流分，减压回收溶剂，得到粗产物；
(4)将步骤(3)制备得到的粗产物，进行ODS中压柱层析分离，进一步收集富含所述抗癌组合物的流分，减压回收溶剂，即得到所述的抗癌组合物。
3.根据权利要求2所述的抗癌组合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乙醇的体积百分含量为75～95％，用量为野马追药材质量的10～20倍。
4.根据权利要求2所述的抗癌组合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，混悬所用的水的量为浸膏质量的3～10倍，萃取所用的乙酸乙酯的量为浸膏质量的3～10倍。
5.根据权利要求2所述的抗癌组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所收集的石油醚-乙酸乙酯体积比为：3︰2～0︰1的流分，为有效流分。
6.根据权利要求2所述的抗癌组合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，中压柱层析分离采用40～60μm的十八烷基键合相硅胶作为填料，上样后分别用体积分数45％、60％、75％的甲醇水溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱3～4个柱体积。
7.一种如权利要求1所述的抗癌组合物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述的抗癌药物用于乳腺癌的治疗。
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