CN101732377B - 具有抗癌作用的刺人参叶总皂苷提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种刺人参叶总皂苷提取物的制备方法及其在抗癌药物方面的应用。该方法包括如下步骤：1)将刺人参叶粉碎成粗粉；2)将刺人参叶粉末用水或含水乙醇进行提取，过滤后合并滤液，浓缩，得到浓缩液；3)将浓缩液进行减压浓缩，干燥后，得到所述刺人参叶总皂苷提取物。该方法制备所得刺人参叶总皂苷提取物中，总皂苷的重量含量为20％以上，收率为1％～30％。经药理试验证明该提取物具有较好的抗癌作用。刺人参叶总皂苷提取物可单独或与其它药物组合作为原料药应用于具有抗癌作用的药物制剂中。该方法制备产物纯度高，方法简便实用，适合工业化生产。

Description

具有抗癌作用的刺人参叶总皂苷提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有抗癌作用的刺人参叶总皂苷的制备方法，具体涉及一种制备含高纯度刺人参叶总皂苷提取物的制备方法及其在抗癌药物制备方面的应用。

背景技术

癌症是人类目前面临的重大疾病之一，已成为威胁人类生命的第二大疾病。根据世界卫生组织的数据显示，2004年癌症死亡人数达740万人(约占所有死亡人数的13％)，而超过70％的癌症死亡发生在低收入和中等收入国家。预计全世界癌症死亡人数将继续增加，2030年估计将有1200万人死于癌症。肝癌与肺癌、胃癌、结肠癌和乳癌一起成为每年导致癌症总死亡率的主要癌症，每年约有61万死亡人死于肝癌。而我国年均癌症发病人数约180万～200万，死亡人数约140万～150万；目前，我国每死亡5人，即有1人死于癌症；在0岁～64岁国民中，每死亡4人，即有1人死于癌症；癌症位居国人各类死因首位，尤以西部和农村地区增长明显(人民网.我国的癌症流行现状2006-4-30)。因此抗癌药物的开发具有重要意义。

刺人参为五加科刺参属植物，目前世界上仅有三种，分别为北美刺人参(Oplopanax horridus Miq)、东北刺人参(Oplopanax elatus Nakai)和日本刺人参(Oplopanax japonicus Nakai)，均为多年生落叶灌木。近年来研究表明，刺参属植物具有多方面的药理作用，是非常具有开发前景的药用植物。北美刺人参主要分布在阿拉斯加及不列颠哥伦比亚。北美刺人参的茎皮及根是当地的传统药用植物，用于治疗各种疾病，包括关节炎、感冒、发烧以及糖尿病等(Trevor C.Lantz，Kristina Swerhun and Nancy J.Turner.Devil’s Club(Oplopanax horridus)：AnEthnobotanic Review.Herbal Gram，American Botanical Council 2004，62：33-48.)。

东北刺人参主要分布于中国东北、俄罗斯、朝鲜三国境内。其根茎入药，具有滋补强壮、调节血压、兴奋中枢神经等功效，有类似人参的作用。近年来由于资源破坏，刺人参处于濒危状态，已列为国家二级保护植物。

国内外学者对刺人参进行了研究。Moerman，Turner等报道北美刺人参具有抗糖尿病作用。药理实验表明北美刺人参提取夜，对分支杆菌有很强的抑制活性。Kobaisy等分离了五个聚炔类化合物，有显著的抗念珠菌，抗细菌，抗分支杆菌活性，在10微克能够杀死结核分支杆菌和耐异烟肼的鸟型分枝杆菌(Kobaisy M，Abramowski Z，Lermer L，Saxena G，Hancock RE，Towers GH，Doxsee D，Stokes RW Antimycobacterial polyynes of Devil′s Club(Oplopanaxhorridus)，a North American native medicinal plant.J Nat Prod.1997Nov；60(11)：1210-13.)。Taichi Inui通过逆流色谱技术从北美刺人参根茎皮提取液进行了粗分，分离了一些化合物，并通过生物活性筛选得出北美刺人参的提取液对结合杆菌有很强的药理作用，这些药理作用有可能是通过协同作用实现的(Inui T，et.Counter-current chromatography based analysis of synergy in ananti-tuberculosis ethnobotanical.J Chromatogr A.2007 Jun 1；1151(1-2)：211-5.)。TaiJ等报道北美刺人参干燥根皮的乙醇提取液对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用和具有抗氧化作用，如K562，HL60，MCF7和MDA-MB-468均有抑制作用(Tai J，et.In vitro anti-proliferative and antioxidant studies on Devil′s ClubOplopanax horridus.J Ethnopharmacol.2006 Nov 24；108(2)：228-3)。前期我们对刺人参根及茎皮抗银痟病的活性成分进行研究(De-Qiang Dou，Xiao-Yan Hu，Yue-Ran Zhao，Ting-Guo Kang，Feng-Yun Liu，Hai-Xue Kuang，David C.Smith.Studies on the anti-psoriasis constituents of Oplopanax elatus Nakai.Natural ProductResearch 2009，23(4)：334-342.)。进一步我们对刺人参叶的化学成分和抗癌作用进行研究。

目前国内外尚无关于刺人参叶总皂苷制备方法及其抗癌作用的相关报道。我们经过多次的实验考查，总结出一套适合工业生产的总皂苷的制备方法，并发现其具有抗癌作用，而实现了本发明。

发明内容

本发明是关于具有抗癌作用的刺人参叶总皂苷制备方法的发明，本发明首次证明刺人参叶总皂苷提取物具有抗癌作用，并经过正交实验等考查，建立一套完备的制备具有抗癌作用刺人参叶总皂苷提取物的方法。

本发明的目的在于寻找出一种制备刺人参叶总皂苷类提取物的方法。本发明的目的还在于证明刺人参叶总皂苷提取物具有抗癌作用，可作为抗癌药物的原料药。

本发明的目的实现如下：

具有抗癌作用的刺人参叶总皂苷提取物的制备方法，其特征在于：刺人参叶，粉碎成粗粉，用水或含水乙醇提取，提取液过滤，合并滤液，减压浓缩得浓缩液，经分离纯化，得刺人参叶总皂苷浸膏，总皂苷浸膏经干燥得刺人参叶总皂苷。本提取物可作为原料药应用于治疗癌症疾病的药物制剂中。

本发明所用刺人参叶来源于东北刺人参(Oplopanax elatus Nakai)、北美刺人参(Oplopanax horridusMiq)和日本刺人参(Oplopanax japonicus Nakai)的叶。所用刺人参叶含叶柄，阴干，粉碎，得刺人参叶粗粉(2～60目)。

本发明所用的水或含水乙醇的提取方法如下：乙醇浓度为0％～100％(体积比，下同)，优选60％乙醇；提取方式可采用渗漉、超声、闪式提取和回流提取，优选回流提取法。回流提取的溶剂用量为药材量的3～20倍量；回流提取1～3次；每次1～3小时。提取液过滤，合并，减压浓缩至药材量的1～3倍。

本发明的分离纯化方法采用溶剂萃取法和大孔树脂吸附法。溶剂萃取法是将上述所得的浓缩溶液置水中悬浮，用1～3倍体积水饱和的正丁醇萃取三次，水饱和正丁醇的用量优选与水的体积相当萃取。减压回收正丁醇得浸膏，获得刺人参叶总皂苷提取物浸膏。所用的大孔吸附树脂法是将上述浓缩液经大孔树脂色谱柱分离，依次用水和20％～80％乙醇冲洗，优选70％乙醇。大孔树脂型号可以是AB-8、D-101、HPD-100、DA201和DM301。收集乙醇洗脱液，回收乙醇，即得刺人参叶总皂苷提取物浸膏。

本专利中所得刺人参叶总皂苷提取物浸膏的干燥方法可以采用减压干燥法、冷冻法或喷雾干燥法，优选减压干燥法。经干燥后即得刺人参叶总皂苷提取物。

本专利所得的刺人参总皂苷提取物中，总皂苷的重量百分含量(比色法)为30％以上，收率为1％～30％。

本专利所得的刺人参总皂苷提取物具有抗癌作用，可单独或与其它药物组合作为原料药应用于抗癌药物的制剂中。

本发明中的刺人参叶总皂苷提取物中包括含通式1～4在内的以羽扇豆烷和齐墩果烷为主的皂苷元和皂苷所组成的。其中不同种类的刺人参叶中成分的含量有差别。

其中R₁＝H，OH，Glc；R₂＝H，OH，Glc；R₃＝CH₃，OH，CH₂OH，CHO，COOH；R4＝H，Glc或Glc与Rha组成的糖链。

通式(1)

其中R₁＝H，OH，Glc；R₂＝H，OH，Glc；R₃＝CH₃，OH，CH₂OH，CHO，COOH。

通式(2)

其中R₁＝H，OH，Glc；R₂＝H，OH，Glc；R₃＝CH₃，OH，CH₂OH，CHO，COOH。

通式(3)

其中R₁＝H，OH，Glc；R₂＝H，OH，Glc；R₃＝CH₃，OH，CH₂OH，CHO，COOH。

通式(4)

总皂苷的含量测定参照文献方法(郭颖，王世成，窦德强.不同产地文冠果果壳中总皂苷含量测定.辽宁中医药大学学报 2009，11(5)：165-166.)。

(四)具体实施方式

实施例1：刺人参叶总皂苷提取物的制备方法

1、溶剂萃取法制备刺人参叶总皂苷

取刺人参叶粉末1kg，60％乙醇回流提取2次，每次2h，合并提取液，回收乙醇溶液，浓缩至小体积(约1500毫升)，经等量的水饱和正丁醇萃取三次，合并萃取液，减压浓缩正丁醇得浸膏，经减压干燥得刺人参总皂苷提取物103g，比色法测得总皂苷为70g(68.0％)，其收率为7.0％。

2、溶剂萃取法制备刺人参叶总皂苷

取刺人参叶粉末1kg，95％乙醇回流提取1次，1h，合并提取液，回收乙醇溶液，浓缩至小体积(约1500毫升)，经等量的水饱和正丁醇萃取三次，合并萃取液，减压浓缩正丁醇得浸膏，经减压干燥得刺人参总皂苷提取物70g，比色法测得总皂苷为52.5g(75％)，其收率为5.2％。

3、大孔吸附树脂法制备刺人参叶总皂苷

北美刺人参叶1kg，粉碎，过10目筛子，60％乙醇回流提取3次，每次3h，合并提取液，回收乙醇溶液，浓缩至小体积(无醇味，约2000ml)。溶液上已预先处理过的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、70％乙醇、95％乙醇洗脱，70％的乙醇洗脱液减压回收溶剂乙醇，经减压干燥得刺人参总皂苷提取物95g，测得总皂苷为74.2g(78.1％)，其收率约为7.4％。

4、大孔吸附树脂法制备刺人参叶总皂苷

北美刺人参叶1kg，粉碎，过10目筛子，纯水回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压浓缩至小体积(约1500ml)。溶液上已预先处理过的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、70％乙醇、95％乙醇洗脱，70％的乙醇洗脱液减压回收溶剂乙醇，经减压干燥得刺人参总皂苷提取物100g，测得总皂苷为70.2g(70.2％)，其收率约为7.0％。

实施例2刺人参叶总皂苷的体外抗癌活性研究

1、实验材料与试剂

人结肠癌细胞株(HCT116)、人肺癌细胞株(NCI-H460)、人胃癌细胞细胞株(MGC803)、人胰腺癌细胞株(PANC-1)和人肝细胞癌细胞株(HepG2)均购于中国科学院上海生命科学研究院细胞生物学研究所。RPMI-1640(美国Hyclone公司产品)，小牛血清(美国Gibco公司产品)，四甲基二氮唑蓝(美国Biosharp公司产品)，二甲基亚砜(美国Biomol公司产品)，0.25％胰蛋白酶(中国医学科学院生物医学工程研究所)

实验采用上述实施例1中的方法制备的提取物。

2、实验方法

以上各细胞在含10％小牛血清的RPMI-1640培养液、37℃，5％CO₂条件下培养，48小时换液，细胞长满单层后用0.25％胰蛋白酶消化传代。以5×10⁴个/ml细胞浓度的细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔体积200μL，37℃，5％CO₂培养24h后，加入不同浓度的治疗药物。按倍比稀释北美刺人参叶总皂苷为5，10，20，40，60mg/mL(用含0.5％DMSO、10％小牛血清的RPMI-1640培养液稀释)，每个剂量设4个复孔；另设对照组(用含0.5％DMSO、10％小牛血清的RPMI-1640培养液)。培养24h、48h、72h后，吸出培养液，每孔加入含MTT(终浓度5mg/mL)的无血清的RPMI-1640培养液200μL，继续培养4h后，吸弃上清溶液，加入100μL DMSO，在微量震荡器上振荡5min，使其充分混匀，酶标仪(Tecan Infinite M200)测定其吸光度(A值)，吸收波长为570nm。分别计算细胞存活率和细胞增殖抑制率并绘制北美刺人参叶总皂苷提取物对肝癌细胞的生长抑制曲线。细胞存活率＝(A_治疗组/A_对照组)×100％；细胞增殖抑制率＝(1-A_给药组/A_对照组)×100％。

3、实验结果

本实验对首先对刺人参叶不同提取部位的活性进行比较，发现正丁醇萃取部分和大孔吸附树脂的75％乙醇洗脱部分的对各种癌细胞增殖具有显著的抑制作用。阳性对照采用5-氟嘧啶(5-FU)的IC₅₀值为5μg/ml。实验结果如下：

表1刺人参叶总皂苷对癌细胞增值的抑制作用

实施例3刺人参叶总皂体对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤的生长抑制实验

1、材料

实验动物为6～9周龄BALB/c裸小鼠，22～30g，50只，雌雄各半，无特定病原体(SPF)条件下饲养。刺人参叶总皂苷按照上述实施例1方法制备。人肝癌细胞HepG-2购于中国科学院上海生命科学研究院细胞生物学研究所，5一氟脲嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU，合肥霍氏医药科技有限公司)。

2、方法

总皂苷溶液的制备：按实施例1制备的刺人参叶总皂苷提取物，精密称定提取物，用0.5％CMC混悬配成所需的药液浓度，给药前摇匀即可。

实验方法：取人肝癌HepG2细胞，在含10％小牛血清的RPMI-1640培养液、37℃、5％CO₂条件下培养，48小时换液，细胞长满单层后用0.25％胰蛋白酶消化。在无菌条件下接种于裸鼠腋窝皮接种HepG-2细胞悬液(1.0×10cfu/mL)0.2mL，(相当于每只裸鼠接种2×10⁶个肿瘤细胞).接种1周后可见肿瘤生长，当肿瘤大小到直径约为3～4mm时(接种10d以后)，将荷瘤裸鼠按肿瘤大小随机分为5组，每组9～10只裸鼠，雌雄兼有，(1)空白组：给生理盐水，ig，每日给药；(2)阳性对照组：5-FU，用生理盐水稀释，无菌分装，20mg/kg，ip，隔日给药；(3)给药组：分刺人参叶总皂苷高、中、低剂量组，5％CMC配制，50～200mg/kg，ig，每日给药，共给药21d.自接种后每日测量裸鼠体质量.每周用游标卡尺测量裸鼠肿瘤的长(a)短(b)径，并按以下公式计算相积。末次给药后24h时处死动物，剥离肿瘤称质量.计算各组抑瘤率，抑瘤率＝(1-用药组平均瘤质量/空白组平均瘤质量)×100％，实验重复两次.结果见表2。

表2刺人参叶总皂体对HepG2裸鼠移植瘤的生长抑制实验(X±S，n＝10)

与空白对照相比：^＊P＜0.05^＊＊P＜0.01

3、实验结果

结果如表2所示，刺人参叶总皂苷对裸小鼠移植瘤的生长具有一定的抑制作用，并呈剂量依赖性。观察其活动进食状况均无明显异常，对体重增加也无影响，表明刺人参叶总皂苷对裸鼠的生长无明显的毒副作用。刺人参叶总皂苷50～200mg/Kg连续应用21天，对肝肿瘤有显著的剂量依赖性抑制作用，其低剂量组抑瘤率为19.9％，与对照组比较有显著差异(P＜0.05)，中及高剂量组抑瘤率分别为38.3％，61.0％，瘤重与对照组相比差异有极显著意义(P＜0.01)。

Claims (10)

1.具有抗癌作用的刺人参叶总皂苷的制备方法，其特征在于：刺人参叶，粉碎成粗粉，用水或含水乙醇提取，提取液过滤，合并滤液，减压浓缩得浓缩液，经分离纯化，得刺人参叶总皂苷浸膏，总皂苷浸膏经干燥得刺人参叶总皂苷。

2.根据权利要求1所述的刺人参叶总皂苷的制备方法，其特征是所用刺人参叶来源于东北刺人参、北美刺人参和日本刺人参的叶。

3.根据权利要求1所述的刺人参叶总皂苷的制备方法，其特征是所用刺人参叶含叶柄，阴干，粉碎，得刺人参叶粗粉，粒度为10～60目。

4.根据权利要求1所述的刺人参叶总皂苷的制备方法，其特征是水或含水乙醇的提取方法如下：乙醇浓度为0％～100％；提取方式采用回流提取，回流提取的溶剂用量为药材量的3～20倍量；回流提取1～3次；每次1～3小时，提取液过滤，合并，减压浓缩至药材量的1～3倍，经分离纯化即得。

5.根据权利要求4所述的刺人参叶总皂苷的制备方法，其特征是分离纯化方法采用溶剂萃取法和大孔树脂吸附法。

6.根据权利要求5所述的刺人参叶总皂苷的制备方法，其特征在于所述溶剂萃取法是将权利要求4中所得的浓缩溶液置水中悬浮，用1～3倍体积水饱和的正丁醇萃取三次，减压回收正丁醇得浸膏，获得刺人参叶总皂苷提取物浸膏。

7.根据权利要求5所述的刺人参叶总皂苷的制备方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂法是将权利要求4中所得浓缩溶液经大孔树脂色谱柱分离，依次用水和20％～80％乙醇冲洗，大孔树脂型号为AB-8、D-101、HPD-100、DA201或DM301，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，即得刺人参叶总皂苷提取物浸膏。

8.根据权利要求1所述的刺人参叶总皂苷的制备方法，其特征是权利要求6、7中所得刺人参叶总皂苷提取物浸膏的干燥方法采用减压干燥法、冷冻法或喷雾干燥法，经干燥后即得刺人参叶总皂苷提取物。

9.根据权利要求1所述刺人参叶总皂苷的制备方法，其特征在于：所述的提取物中，总皂苷的重量百分含量，比色法为20％以上，收率为1％～30％。

10.根据权利要求1所述的刺人参叶总皂苷的制备方法，其特征在于：用该方法制得的刺人参叶总皂苷可单独或与其它药物组合作为原料药应用于抗癌药物的制剂中。