CN102138957B

CN102138957B - 药西瓜提取物及其生产方法和应用

Info

Publication number: CN102138957B
Application number: CN 201110080504
Authority: CN
Inventors: 杨伟俊; 刘冲; 满尔哈巴; 地力努尔; 黄华
Original assignee: XINJIANG INSTITUTE OF MATERIA MEDICA
Current assignee: XINJIANG INSTITUTE OF MATERIA MEDICA
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2011-03-31
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2031-03-31
Also published as: CN102138957A

Abstract

一种药西瓜提取物及其生产方法和应用。该提取物的生产方法为：第一步，药西瓜果实粉碎，以水或乙醇粗提，得提取液；第二步，提取液过滤浓缩后加无水乙醇放置沉淀,滤除沉淀得乙醇溶液；第三步，将所得乙醇溶液浓缩后调节pH值，上大孔树脂和/或聚酰胺树脂层析柱吸附；第四步，将所得溶液浓缩，回收乙醇，再干燥，即得到所需的药西瓜提取物。本发明所述的药西瓜提取物具有显著的抗肿瘤作用，且口服给药安全，可用于制备抗肿瘤药物；本发明首次提出药西瓜提取物具有抗肿瘤活性。该生产方法简单易行，工艺可靠，所得提取物质量稳定；生产中所使用的材料可通过乙醇回收和树脂再生循环利用，生产成本低，适合产业化。

Description

药西瓜提取物及其生产方法和应用

技术领域

本发明涉及从植物药西瓜的果实中提取的提取物及其生产方法和应用的技术领域，是一种药西瓜提取物及其生产方法和应用。

背景技术

随着人类生活节奏的加快，生活模式的改变，人类疾病的模式已经改变，已经转化为以肿瘤、心脏病、糖尿病等慢性疾病为主。调查表明，肿瘤疾病已成为当今世界威胁人类健康最严重的疾病之一，其发病呈现年轻化趋势，我国肿瘤发病率每年以3%到5%的速度在提高，世界上每年新发肿瘤80%发生在中国、印度、巴西等发展中国家。相关调查显示，我国城市当中男性发病率最高的肿瘤，是肺癌、胃癌、肝癌，而女性以乳腺癌、宫颈癌为多。其中恶性肿瘤患者的每年医疗费用高达800亿，约占医疗卫生总费用的20%，肿瘤已成为造成我国最佳劳动力损失、医疗费用上涨的一大原因。然而，国内抗肿瘤新药长期处于“饥渴状态”。目前，肿瘤疾病的高死亡率不仅使无数家庭遭受痛苦，也使他们背负了沉重的经济负担。因此，抗肿瘤疾病药物的研究一直是医药界关注的热点，发现新的抗肿瘤药物从来都是困扰医药学界的难题。

国内外对肿瘤药物的研发投入正在逐步加大。目前抗肿瘤药物主要分为烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、抗肿瘤植物药及其衍生物、其他抗肿瘤药与辅助治疗药5个亚类。根据现代药理学研究，抗肿瘤中药主要有两类：一类是细胞毒药物，即对肿瘤细胞具有直接杀伤作用，主要含有天然抗肿瘤活性成分，可直接抑制肿瘤细胞的生长。第二类是具有免疫增强作用、生物反应调节剂样作用的药物，通过调节脏腑气血阴阳的失衡，改善机体全身的病理状态，增加机体自身的抗病力。其中抗肿瘤植物药的药用成分则属于免疫促进剂，携带特定信息，易被遭受肿瘤细胞作用的机体正常组织所识别，使受损的免疫功能恢复至正常水平。由于化学合成的抗肿瘤药物的毒副作用及成本、环保等问题逐渐受到重视，近年来，从中药和天然药物中寻找新的抗肿瘤药物成为世界关注的热点，它可以与化疗同时应用，能提高疗效，减轻化疗药物的毒副作用。现代中药配合手术、放疗、化疗，能够增效减毒，提高治愈率，不能做手术和放化疗的中晚期病人，用中药可以控制病情、延长寿命、提高生存质量，实现带瘤生存。另外，有并发症的病人也可以加用一些对症治疗的中药。

药西瓜，又名苦西瓜，系维吾尔医习用药材，维语名Aqqiktawuz（阿其克塔吾孜），为葫芦科植物药西瓜Citrullus colocynthis (L.) Schrad.的干燥成熟果实。药西瓜原植物为多年生或一年生草质藤本植物，其主要药用部位为果实。药西瓜原产于北非、中亚和西亚各国，我国不产。药西瓜是世界伊斯兰各国临床应用的药材之一，在北非民间用于治疗风湿病、血液病，同时作为腹泻药在民间应用甚为广泛。传统维吾尔医认为，药西瓜[性]“三级热，二级干”，能清除异常粘液质和黑胆质，祛散寒湿，通络止痛，开胸止咳，用于头痛，偏头痛，瘫痪痴呆，癫痫健忘，关节骨痛，心胸痹阻，耳聋眼花，水肿便秘，黄疸咳喘。目前，尚未见到药西瓜及其提取物在抗肿瘤方面的研究和报道。

发明内容

本发明提供一种应用于制备抗肿瘤药物的药西瓜提取物及其生产方法和应用，该药西瓜提取物特别能用于制备抗肿瘤药物。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种用于制备抗肿瘤药物的药西瓜提取物,其按下述步骤得到：

第一步，将药西瓜果实粉碎过10目至30目筛，得到药西瓜果实粉末，以水和/或乙醇粗提,其中,水粗提为：将药西瓜果实粉末加8倍至10倍重量份的水，在80℃至100℃下加热回流提取两次，每次1.5小时至3小时，过滤，合并滤液；乙醇粗提为：将药西瓜果实粉末加8倍至10倍重量份的30％至90％的乙醇水溶液，在80℃至100℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液；

第二步，将上述滤液浓缩至原体积的三分之一,得浓缩液，加相当于浓缩液体积1倍量至2倍量的无水乙醇，室温放置沉淀12小时至24小时，滤除沉淀得到乙醇溶液；

第三步,将上述乙醇溶液浓缩至原体积的五分之一至二分之一后以稀盐酸调节pH值为3至6，上大孔树脂和/或聚酰胺树脂层析柱吸附；其中，大孔树脂采用弱极性大孔树脂，弱极性大孔树脂选用HPD400、D-101、AB-8型弱极性大孔树脂中的一种，大孔树脂与聚酰胺树脂混合使用时,按重量比1比1进行混合；

第四步,以相当于3至8个层析柱体积的去离子水冲洗上述层析柱,再以10%至90%的乙醇为洗脱剂进行梯度洗脱，每浓度洗脱剂的用量相当于3至8个层析柱体积，流速为2至5个层析柱体积/小时，收集乙醇洗脱液并合并；

第五步,将上述合并后的乙醇洗脱液在40℃至90℃、0.07 Mpa至0.1Mpa下浓缩，回收乙醇,再在50℃至80℃、0.07 Mpa至0.1Mpa下减压干燥，即得所需的药西瓜提取物。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种用于制备抗肿瘤药物的药西瓜提取物的生产方法,其按下述步骤进行：

本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种上述药西瓜提取物的药物组合物，其以该药西瓜提取物为有效成分，与药学上可接受的载体所组成。

本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种上述药物组合物的制剂类型，选自片剂、糖衣剂片、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、滴丸剂或贴剂。

本发明的技术方案之五是通过以下措施来实现的：一种上述药西瓜提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的技术方案之五是通过以下措施来实现的：一种上述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明所述的药西瓜提取物具有显著的抗肿瘤作用，且口服给药安全,可用于制备抗肿瘤药物；本发明首次提出药西瓜提取物具有抗肿瘤活性。该生产方法简单易行，工艺可靠，所得提取物质量稳定；生产中所使用的材料可通过乙醇回收和树脂再生循环利用，生产成本低,适合产业化。

具体实施方式

发明不受下述实施例的限制，可根据上述发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。

下面结合实施例对本发明作进一步论述。

实施例1：该药西瓜提取物按下述步骤得到：

第三步,将上述乙醇溶液浓缩至原体积的五分之一至二分之一后以稀盐酸调节pH值为3至6，上大孔树脂和/或聚酰胺树脂层析柱吸附；其中，大孔树脂采用弱极性大孔树脂，弱极性大孔树脂选用HPD400、D-101、AB-8型弱极性大孔树脂中的一种。大孔树脂与聚酰胺树脂混合使用时,按重量比1比1进行混合；

实施例2：将药西瓜果实粉碎过20目筛，得到药西瓜果实粉末，以水粗提：将药西瓜果实粉末加8倍至10倍重量份的水，在80℃至100℃下加热回流提取两次，每次1.5小时至3小时，过滤，合并滤液,浓缩至原体积的三分之一，加浓缩液体积1倍量至2倍量的无水乙醇放置沉淀12小时，滤除沉淀,滤液浓缩后以稀盐酸调节PH值为3至6，上AB-8型大孔树脂层析柱,待上样液全部吸附后,以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱,再以50%、70%、90%的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液, 合并后于60℃至90℃浓缩，浓缩液再于50℃至80℃减压干燥，即得药西瓜提取物。

实施例3：与实施例1至实施例2的不同之处在于：上述层析柱处理时以30%、50%、70%的乙醇进行梯度洗脱，得到药西瓜提取物。

实施例4：与实施例1至实施例3的不同之处在于：所用大孔吸附树脂选用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型号的大孔树脂中的一种，得到药西瓜提取物。

实施例5：将药西瓜果实粉碎过20目筛，得到药西瓜果实粉末，以30%乙醇水溶液粗提：将药西瓜果实粉末加8倍至10倍重量份的30%乙醇水溶液，在80℃至100℃下加热回流提取两次，每次1.5小时至3小时，过滤，合并滤液,浓缩至原体积的三分之一，加浓缩液体积1倍量至2倍量的无水乙醇放置沉淀12小时，滤除沉淀,滤液浓缩后以稀盐酸调节PH值为3至6，上AB-8型大孔树脂层析柱,待上样液全部吸附后,以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱,再以50%、70%、90%的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液, 合并后于60℃至90℃浓缩，浓缩液再于50℃至80℃减压干燥，即得药西瓜提取物。

实施例6：与实施例5的不同之处在于：上述层析柱处理时以30%、50%、70%的乙醇进行梯度洗脱，得到药西瓜提取物。

实施例7：与实施例5和实施例6的不同之处在于：所用大孔吸附树脂选用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型号的大孔树脂中的一种，得到药西瓜提取物。

实施例8：将药西瓜果实粉碎过20目筛，得到药西瓜果实粉末，以50%乙醇水溶液粗提：将药西瓜果实粉末加8倍至10倍重量份的50%乙醇水溶液，在80℃至100℃下加热回流提取两次，每次1.5小时至3小时，过滤，合并滤液,浓缩至原体积的三分之一，加浓缩液体积1倍量至2倍量的无水乙醇放置沉淀12小时，滤除沉淀,滤液浓缩后以稀盐酸调节PH值为3至6，上AB-8型大孔树脂层析柱,待上样液全部吸附后,以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱,再以50%、70%、90%的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液, 合并后于60℃至90℃浓缩，浓缩液再于50℃至80℃减压干燥，即得药西瓜提取物。

实施例9：与实施例8的不同之处在于：上述层析柱处理时以30%、50%、70%的乙醇进行梯度洗脱，得到药西瓜提取物。

实施例10：与实施例8和实施例9的不同之处在于：所用大孔吸附树脂选用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型号的大孔树脂中的一种，得到药西瓜提取物。

实施例11：将药西瓜果实粉碎过20目筛，得到药西瓜果实粉末，以70%乙醇水溶液粗提：将药西瓜果实粉末加8倍至10倍重量份的70%乙醇水溶液，在80℃至100℃下加热回流提取两次，每次1.5小时至3小时，过滤，合并滤液,浓缩至原体积的三分之一，加浓缩液体积1倍量至2倍量的无水乙醇放置沉淀12小时，滤除沉淀,滤液浓缩后以稀盐酸调节PH值为3至6，上AB-8型大孔树脂层析柱,待上样液全部吸附后,以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱,再以50%、70%、90%的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液, 合并后于60℃至90℃浓缩，浓缩液再于50℃至80℃减压干燥，即得药西瓜提取物。

实施例12：与实施例11的不同之处在于：上述层析柱处理时以30%、50%、70%的乙醇进行梯度洗脱，得到药西瓜提取物。

实施例13：与实施例11和实施例12的不同之处在于：所用大孔吸附树脂选用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型号的大孔树脂中的一种，得到药西瓜提取物。

实施例14：将药西瓜果实粉碎过20目筛，得到药西瓜果实粉末，以90%乙醇水溶液粗提：将药西瓜果实粉末加8倍至10倍重量份的90%乙醇水溶液，在80℃至100℃下加热回流提取两次，每次1.5小时至3小时，过滤，合并滤液,浓缩至原体积的三分之一，加浓缩液体积1倍量至2倍量的无水乙醇放置沉淀12小时，滤除沉淀,滤液浓缩后以稀盐酸调节PH值为3至6，上AB-8型大孔树脂层析柱,待上样液全部吸附后,以3至8个层析柱体积去离子水冲洗层析柱,再以50%、70%、90%的乙醇进行梯度洗脱，每浓度乙醇用量为3至8个层析柱体积，流速为每小时2至5个层析柱体积，收集乙醇洗脱液, 合并后于60℃至90℃浓缩，浓缩液再于50℃至80℃减压干燥，即得药西瓜提取物。

实施例15：与实施例14的不同之处在于：上述层析柱处理时以30%、50%、70%的乙醇进行梯度洗脱，得到药西瓜提取物。

实施例16：与实施例14和实施例15的不同之处在于：所用大孔吸附树脂选用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型号的大孔树脂中的一种，得到药西瓜提取物。

通过以下实验列对本发明药西瓜提取物的抗肿瘤作用进行说明：

实验例1 本发明药西瓜提取物对人肺腺癌细胞和人宫颈癌细胞病变的抑制作用

1.实验材料和仪器

1.1 样品：1号至5号样品，5个批次的1号至5号的样品是从上述实施例1至实施例16所得药西瓜提取物中随机抽样而得。

1.2 细胞株人肺腺癌细胞A549,人宫颈癌Hela细胞，均由中国医学科学院药物研究所肿瘤室提供。

1.3试剂 F12培养基，MEM培养基，Gibco出品；DMSO，Sigma出品；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；MTT、胰蛋白酶，Amresco，北京三博远志生物技术有限公司分装。

1.4仪器 BHC-1300 A-B3生物安全柜，苏净集团安泰公司；HH.CP-01型CO₂培养箱，上海福玛实验设备有限公司；XDS-1B倒置显微镜；AL204电子天平，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；550型酶标仪，Bio-Rad公司；SZ-96自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂。

2.实验方法

细胞培养及接种 A549用含10 %体积百分比的胎牛血清的F12培养液于37℃、5%CO₂条件下培养。Hela用含10 %体积百分比的胎牛血清的MEM培养液于37℃、5 %CO₂条件下培养。两种细胞分别取生长活跃、形态良好的单层培养细胞用0.25 %的胰酶消化后，以各自的培养液配成浓度为4.5×10⁵/ml的细胞悬液，接种于无菌96孔板，200μl/hole，24小时后，吸弃上清，1-5号样品分别以培养液配成5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.78 mg/ml等浓度加药，每浓度4个复孔,培养48小时后,加入以PBS配制的MTT（5mg/ml）10μl/hole，继续培养4小时，吸弃上清，加DMSO 100μl/hole，振摇后在酶标仪上于570nm测定OD值。实验重复一批。计算样品对细胞生长的抑制率CT，并用SPSS软件11.5计算样品对肿瘤细胞的半数抑制浓度IC₅₀。

CT=(对照孔OD值-加样孔OD值)/对照孔OD值×100 %

3.实验结果 1-5号样品对A549和Hela细胞的生长均有抑制作用。（见表1、2、3）

4.结论：以上实验结果表明：1-5号样品均具有一定的抗肿瘤活性。

实验例2：本发明药西瓜提取物对人肝癌细胞和白血病细胞病变的抑制作用

使用人肝癌细胞株HepG₂和人急性早幼粒白血病细胞株HL-60(美国ATCC公司)，以含10%体积百分比的胎牛血清（Hyclone公司）的RPMI-1640完全培养（Sigma公司）在37℃，饱和湿度，含体积分数为5%CO₂、95%空气的二氧化碳培养箱中常规培养，2—3天传代一次。取对数生长期细胞，以0.125%胰酶（Sigma公司）消化后，PBS（磷酸盐缓冲液）（0.05mol/L ，PH7.4）洗涤2次，完全培养基重新悬浮，显微镜下细胞计数板计数并调整细胞浓度为1×10⁵/ml，铺96孔细胞培养板，100ul/孔，培养过夜，使细胞贴壁。加入待测样品，10ul/孔，空白孔加10ul生理盐水，培养48小时。弃去上清液，PBS洗涤细胞2次，加入含0.04%MTT（Amresco 公司）的培养基，100ul/孔，再培养4小时。弃去上清，加DMSO（二甲基亚砜）100ul/孔，震荡10分钟使生成物formazan充分溶解，在Zenyth200st酶标仪上测定各孔吸光度值，测定波长570nm。肿瘤细胞增殖抑制活性率计算：

抑制率（%）=（A_空白-A_样品）/A_空白×100% （见表4）

计算50%细胞杀伤时药物浓度（IC₅₀），IC₅₀采用加权直线回归法处理。

其中：A_空白：空白的吸光度值； A_样品：样品吸光度值

实验结果表明：1-5号样品均具有一定的抗肿瘤活性

在本发明中：每个批次的1号至5号的样品是分别做试验的，本发明中的1号的样品试验结果数据为5个批次的1号的样品分别做试验的平均结果，其它2号至5号的样品试验结果数据的方式都与1号的样品试验结果数据的方法相同。

在本发明中：乙醇水溶液浓度均为体积百分比。

Claims

1.一种用于制备抗肿瘤药物的药西瓜提取物,其特征在于按下述步骤得到：

第一步，将药西瓜果实粉碎过10目至30目筛，得到药西瓜果实粉末，以水或乙醇粗提,其中,水粗提为：将药西瓜果实粉末加8倍至10倍重量份的水，在80℃至100℃下加热回流提取两次，每次1.5小时至3小时，过滤，合并滤液；乙醇粗提为：将药西瓜果实粉末加8倍至10倍重量份的30％至90％的乙醇水溶液，在80℃至100℃提取两次，每次2小时至3小时，过滤，合并滤液；

2.一种用于制备抗肿瘤药物的药西瓜提取物的生产方法,其特征在于按下述步骤进行：

第五步,将上述合并后的乙醇洗脱液在40℃至90℃、0.07Mpa至0.1Mpa下浓缩，回收乙醇,再在50℃至80℃、0.07Mpa至0.1Mpa下减压干燥，即得所需的药西瓜提取物。

3.一种根据权利要求1所述的药西瓜提取物的药物组合物，其特征在于以该药西瓜提取物为有效成分，与药学上可接受的载体所组成。

4.一种根据权利要求3所述的药物组合物的制剂类型，选自片剂、胶囊剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉剂、栓剂、喷雾剂、滴剂、滴丸剂或贴剂。

5.根据权利要求4所述的药物组合物的制剂类型，其特征在于片剂包括糖衣剂片、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂。

6.根据权利要求4所述的药物组合物的制剂类型，其特征在于胶囊剂包括硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂。

7.根据权利要求4所述的药物组合物的制剂类型，其特征在于膏剂包括软膏剂、硬膏剂、霜剂。

8.一种根据权利要求1所述的药西瓜提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.一种根据权利要求3所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。