CN103599148A - 沙蓬总黄酮提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属中药、天然药物制药领域，涉及一种制造沙蓬总黄酮有效部位提取物的生产工艺及其在制药领域的用途，提供一种能保证药品疗效的沙蓬总黄酮有效部位提取物的生产工艺。本发明所述的沙蓬总黄酮提取物，是从我国产的藜科沙蓬属植物沙蓬的干燥地上部分，分离纯化得到的总黄酮有效部位提取物。本发明的沙蓬总黄酮有效部位提取物，其中总黄酮含量超过50%（紫外法），异鼠李素-3-O-芸香糖苷含量为5%-10%（高效液相色谱法）。本发明的制备方法工艺经济、简便、适用于工业化大生产。所述的总黄酮有效部位提取物具有降血糖药理作用，可制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液等剂型及其复方制剂，用于治疗糖尿病。

Description

沙蓬总黄酮提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属中药、天然药物制药领域，涉及沙蓬总黄酮提取物及其制备方法和应用。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由于胰岛素绝对或相对不足引起的以高血糖和多并发症并存为特征的内分泌代谢性常见病、多发病，成为一种仅次于癌症、心脑血管疾病，严重威胁人类健康的常见终身性慢性疾病。目前中国糖尿病的患病率为3.21％，并呈递增趋势，大城市的患病率已经达到5%～6%。我国的糖尿病患者人数已达4000万左右，占世界糖尿病人群总数的五分之一，每年新增加糖尿病患者超过120万人。我国已成为糖尿病发病的“重灾区”，是全球糖尿病第二大国，并有向年轻化发展的趋势。糖尿病在发生发展过程中，并发症发病率高达96.15%，表现复杂，是导致糖尿病患者致死、致残的主要原因。糖尿病主要并发症有感染、低血糖昏迷、糖尿病酮症酸中毒、糖尿病肾病、糖尿病血管病变（包括糖尿病视网膜病变，即微血管病变）、神经病变、糖尿病高渗性昏迷等。

目前糖尿病患者临床上主要采用注射胰岛素（1型糖尿病）、口服降糖药（2型糖尿病）和中医中药等方法治疗。1型糖尿病属于胰岛素依赖型糖尿病，主要通过补充胰岛素治疗。治疗2型糖尿病主要通过口服降糖药物。临床应用的降糖药物主要有磺酰脲类(sulfonylurea)、双胍类(biguanide)、餐时血糖调节剂(胰升糖素抑制剂，insulin antagonist inhibitor)、胰岛素增敏剂(insulin sensitizer)、α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-glucosidase inhibitor)等。这些口服降糖药物均为化学合成药物，分别具有很强的毒副作用，长期使用将对患者的各个药物代谢器官造成严重损害。开发疗效高、毒副作用低的新型降糖药物，解除糖尿病患者的痛苦，具有十分重要的科学意义和社会效益，是医药工作者的重大课题和任务。

蒙药具有悠久的历史和鲜明的特点，是蒙古族农牧民在与疾病长期斗争中积累的宝贵知识财富。藜科植物沙蓬Agriophyllum squarrosum(L.)Moq.的干燥全草，自古以来蒙医作为一种常用的蒙药“楚力格日”应用，具有祛疫，清热，解毒，利尿功效。主要用于治疗疫热增盛、头痛、身目黄疸、口糜、齿龈溃烂、尿道灼痛、肾热、口渴、胃“赫依”以及毒热等疾病。内蒙古地区农牧民用于治疗糖尿病，效果极佳。可利用这种药用植物资源开发一种治疗糖尿病新药。

沙蓬中主要化学成分为黄酮类、三萜皂苷类、生物碱类及甾醇类等。通过对沙蓬的前期研究证实，沙蓬总黄酮提取物具有较好的降血糖药理作用。

目前沙蓬总黄酮提取物的生产工艺国内外还是空白。纵观国内外文献报道，均未见沙蓬Agriophyllum squarrosum(L.)Moq.的干燥地上部分总黄酮提取物的制备工艺研究；未见对沙蓬总黄酮提取物进行降血糖药理作用研究；未见用沙蓬总黄酮提取物开发治疗糖尿病药物的研究。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种沙蓬总黄酮提取物及其制备方法和在制备治疗糖尿病药物方面的应用。

本发明通过如下技术方案实现：

本发明以异鼠李素-3-O-芸香糖苷为定量指标，其中总黄酮含量超过50%，异鼠李素-3-O-芸香糖苷含量为5%～8%。

本发明具体采用下述步骤制备沙蓬总黄酮提取物：

（1）取沙蓬干燥药材，粉碎，加10～15倍量的50%～95%的乙醇水溶液浸泡1～5小时，加热回流提取2～3次，每次2～3小时；

（2）过滤，合并滤液，浓缩至相对密度为1.00～1.20，浓缩液备用；

（3）将步骤（2）所得浓缩液，按浓缩液：有机溶剂1:1的比例用石油醚萃取3次，去除非极性或低极性的化学成分。然后再用正丁醇萃取3次，合并正丁醇层萃取液减压回收溶剂，浓缩得浸膏。按浸膏：蒸馏水1：20～40的比例将浸膏加蒸馏水溶解，抽滤，滤液备用；

（4）将步骤（3）所得滤液，按药材：树脂重量比为10：8.5～12.0上大孔树脂柱，大孔树脂型号为AB-8型、HPD300型、HPD400型、D101型。静态吸附3～12小时，依次用蒸馏水（1kg药材：0.5～1L蒸馏水）洗脱4～8个柱体积、8%～20%的乙醇水溶液（1kg药材：0.5～1L乙醇水溶液）洗脱5～8个柱体积除去杂质，洗脱速度为0.1～0.2L/h。再用25%～35%的乙醇水溶液（1kg药材：1～2L乙醇溶液）洗脱8～15个柱体积，洗脱速度为0.1～0.2L/h。收集25%～35%的乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，粉碎，过筛，得沙蓬总黄酮提取物。

本发明所涉及的制备沙蓬总黄酮提取物的方法，是经过大量实验优化后制定的方法。将正丁醇萃取物浸膏水溶液上大孔树脂吸附后，采用蒸馏水和8%-20%的乙醇水溶液洗脱去除极性大的杂质，然后用25%～35%的乙醇水溶液洗脱总黄酮类化合物，具有去除杂质率高，可获得具有明确降血糖药理作用的沙蓬总黄酮有效部位提取物的特点。若用高于35%乙醇水溶液浓度的乙醇洗脱，则得到的总黄酮提取物中其他类化合物杂质含量高，总黄酮和异鼠李素-3-O-芸香糖苷含量过低。

所得沙蓬总黄酮提取物的成分分析：经TLC和HPLC分析方法定性分析，并通过ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR波谱数据解析验证，确定其中含有异鼠李素-3-O-芸香糖苷。

                           异鼠李素-3-O-芸香糖苷

所得沙蓬总黄酮有效部位提取物进行含量测定：

（1）总黄酮的含量：以异鼠李素-3-O-芸香糖苷为对照品，采用紫外分光光度法测定总黄酮的含量。结果显示，沙蓬总黄酮提取物中总黄酮的含量超过50%。

（2）异鼠李素-3-O-芸香糖苷的含量：采用高效液相色谱法（HPLC-UV）测定其含量，结果表明，沙蓬总黄酮提取物中异鼠李素-3-O-芸香糖苷的含量为5%～8%。

为进一步说明本发明沙蓬总黄酮提取物在制备降糖药物中的应用，对本发明提取物进行了体外、体内降糖药理作用实验。实验结果表明，本发明的沙蓬总黄酮提取物，在动物体内可显著地降低链脲佐菌素（STZ）致实验性高血糖模型大鼠的血糖值；可显著地降低四氧嘧啶（ALX）致实验性高血糖模型小鼠的血糖值。细胞水平实验表明，在体外当其浓度为10^-4g/L～10^-8g/L时，对高糖致胰岛素抵抗HepG2细胞模型有显著的降糖作用以及促进细胞生长的作用。

本发明的沙蓬总黄酮提取物的制备工艺经济、简便，适用于工业化大生产。

本发明沙蓬总黄酮提取物作为原料药，可进一步制备治疗糖尿病的药物，如制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等剂型。

具体实施方式

实施例一沙蓬总黄酮提取物的制备（一）

将2公斤粉碎后的沙蓬Agriophyllum squarrosum(L.)Moq.干燥地上部分，按药材：乙醇溶液的1：10比例，加入70%乙醇浸泡5小时，然后加热回流提取3次，每次提取时间分别为3h、2h、2h。合并3次提取液，过滤，回收溶剂，浓缩至相对密度为1.00～1.20。浓缩液分别用石油醚、正丁醇各萃取3次，按浓缩液：溶剂1：1的比例萃取。合并3次正丁醇萃取液，浓缩，得正丁醇萃取物浸膏61.3g。正丁醇萃取物加蒸馏水1.5L溶解，过滤，滤液以1ml/min流速通过树脂容积量为300ml的AB-8型大孔树脂柱，反复吸附3次。依次用4BV蒸馏水、5BV10%乙醇溶液洗脱除去杂质；再用10BV30%乙醇溶液洗脱。收集30%乙醇的洗脱液，浓缩至干，得本发明的沙蓬总黄酮提取物8.4g。沙蓬总黄酮提取物中总黄酮的含量为74.26%，异鼠李素-3-O-芸香糖苷含量为6.86%。

实施例二沙蓬总黄酮提取物的制备（二）

将2公斤粉碎后的沙蓬Agriophyllum squarrosum(L.)Moq.干燥地上部分，按药材：乙醇溶液的1：15比例，加入50%乙醇浸泡5小时，然后加热回流提取3次，每次提取时间分别为3h、2h、2h。合并3次提取液，过滤，回收溶剂，浓缩至相对密度为1.00～1.20。浓缩液分别用石油醚、正丁醇各萃取3次，按浓缩液：溶剂1：1的比例萃取。合并3次正丁醇萃取液，浓缩，得正丁醇萃取物浸膏65.3g。正丁醇萃取物加蒸馏水1.5L溶解，过滤，滤液以1ml/min流速通过树脂容积量为300ml的AB-8型大孔树脂柱，反复吸附3次。依次用8BV蒸馏水、8BV10%乙醇溶液洗脱除去杂质；再用15BV30%乙醇溶液洗脱。收集30%乙醇的洗脱液，浓缩至干，得本发明的沙蓬总黄酮提取物7.6g。沙蓬总黄酮提取物中总黄酮的含量为69.5%，异鼠李素-3-O-芸香糖苷含量为7.56%。

实施例三沙蓬总黄酮提取物的制备（三）

将2公斤粉碎后的沙蓬Agriophyllum squarrosum(L.)Moq.干燥地上部分，按药材：乙醇溶液的1：10比例，加入95%乙醇浸泡5小时，然后加热回流提取3次，每次提取时间分别为3h、2h、2h。合并3次提取液，过滤，回收溶剂，浓缩至相对密度为1.00～1.20。浓缩液分别用石油醚、正丁醇各萃取3次，按浓缩液：溶剂1：1的比例萃取。合并3次正丁醇萃取液，浓缩，得正丁醇萃取物浸膏56.5g。正丁醇萃取物加蒸馏水1.5L溶解，过滤，滤液以1ml/min流速通过树脂容积量为300ml的AB-8型大孔树脂柱，反复吸附3次。依次用5BV蒸馏水、5BV10%乙醇溶液洗脱除去杂质；再用15BV35%乙醇溶液洗脱。收集35%乙醇的洗脱液，浓缩至干，得本发明的沙蓬总黄酮提取物7.4g。沙蓬总黄酮提取物中总黄酮的含量为70.5%，异鼠李素-3-O-芸香糖苷含量为6.06%。

实施例四沙蓬总黄酮提取物的制备（四）

将2公斤粉碎后的沙蓬Agriophyllum squarrosum(L.)Moq.干燥地上部分，按药材：乙醇溶液的1：15比例加入70%乙醇，不经浸泡，直接加热回流提取2次，每次提取时间分别为3h、2h。合并2次提取液，过滤，回收溶剂，浓缩至相对密度为1.00～1.20。浓缩液分别用石油醚、正丁醇各萃取3次，按浓缩液：溶剂1：1的比例萃取。合并3次正丁醇萃取液，浓缩，得正丁醇萃取物浸膏56.3g。正丁醇萃取物加蒸馏水1.5L溶解，过滤，滤液以1ml/min流速通过树脂容积量为300ml的AB-8型大孔树脂柱，吸附3次。依次用6BV蒸馏水、7BV10%乙醇水溶液洗脱除去杂质；再用10BV30%乙醇水溶液洗脱。收集30%乙醇的洗脱液，浓缩至干，得本发明的沙蓬总黄酮提取物7.8g。沙蓬总黄酮提取物中总黄酮的含量为72.3%，异鼠李素-3-O-芸香糖苷含量为6.63%。

实施例五沙蓬总黄酮提取物的制备（五）

将2公斤粉碎后的沙蓬Agriophyllum squarrosum(L.)Moq.干燥地上部分，按药材：乙醇溶液的1：10比例，加入70%乙醇浸泡5小时，然后加热回流提取3次，每次提取时间分别为3h、2h、2h。合并3次提取液，过滤，回收溶剂，浓缩至相对密度为1.00～1.20。浓缩液分别用石油醚、正丁醇各萃取3次，按浓缩液：溶剂1：1的比例萃取。合并3次正丁醇萃取液，浓缩，得正丁醇萃取物浸膏61.3g。正丁醇萃取物加蒸馏水1.5L溶解，过滤，滤液以1ml/min流速通过树脂容积量为300ml的AB-8型大孔树脂柱，反复吸附3次。依次用4BV蒸馏水、5BV10%乙醇溶液洗脱除去杂质；再用10BV25%乙醇溶液洗脱。收集25%乙醇的洗脱液，浓缩至干，得本发明的沙蓬总黄酮提取物6.5g。沙蓬总黄酮提取物中总黄酮的含量为59.4%，异鼠李素-3-O-芸香糖苷含量为7.45%。

实施例六沙蓬总黄酮提取物的制备（六）

将2公斤粉碎后的沙蓬Agriophyllum squarrosum(L.)Moq.干燥地上部分，按药材：乙醇溶液的1：10比例，用50%乙醇浸泡5小时，加热回流提取3次，每次提取时间分别为3h、2h、2h。合并3次提取液，过滤，回收溶剂，浓缩至相对密度为1.00～1.20。浓缩液分别用石油醚、正丁醇各萃取3次，按浓缩液：溶剂1：1的比例萃取。合并3次正丁醇萃取液，浓缩，得正丁醇萃取物浸膏55.6g。正丁醇萃取物加蒸馏水2.0L溶解，过滤，滤液以1ml/min流速通过树脂容积量为300ml的HPD300型大孔树脂柱，反复吸附3次。依次用6BV蒸馏水、6BV10%乙醇水溶液洗脱除去杂质；再用15BV30%乙醇水溶液洗脱。收集30%乙醇的洗脱液，浓缩至干，得本发明的沙蓬总黄酮提取物7.6g。沙蓬总黄酮提取物中总黄酮的含量为70.25%，异鼠李素-3-O-芸香糖苷含量为6.12%。

实施例七沙蓬总黄酮提取物的制备（七）

将2公斤粉碎后的沙蓬Agriophyllum squarrosum(L.)Moq.干燥地上部分，按药材：乙醇溶液的1：10比例加入70%乙醇，不经浸泡，直接加热回流提取3次，每次提取时间分别为3h、2h、2h。合并3次提取液，过滤，回收溶剂，浓缩至相对密度为1.00～1.20。浓缩液分别用石油醚、正丁醇各萃取3次，按浓缩液：溶剂1：1的比例萃取。合并3次正丁醇萃取液，浓缩，得正丁醇萃取物浸膏62.3g。正丁醇萃取物加蒸馏水1.5L溶解，过滤，滤液以1ml/min流速通过树脂容积量为300ml的HPD400型大孔树脂柱，吸附3次。依次用6BV蒸馏水、7BV10%乙醇水溶液洗脱除去杂质；再用10BV30%乙醇水溶液洗脱。收集30%乙醇的洗脱液，浓缩至干，得本发明的沙蓬总黄酮提取物7.5g。沙蓬总黄酮提取物中总黄酮的含量为62.3%，异鼠李素-3-O-芸香糖苷含量为5.63%。

实施例八沙蓬总黄酮提取物的制备（八）

将2公斤粉碎后的沙蓬Agriophyllum squarrosum(L.)Moq.干燥地上部分，按药材：乙醇溶液的1：10比例，加入70%乙醇浸泡5小时，然后加热回流提取3次，每次提取时间分别为3h、2h、2h。合并3次提取液，过滤，回收溶剂，浓缩至相对密度为1.00～1.20。浓缩液分别用石油醚、正丁醇各萃取3次，按浓缩液：溶剂1：1的比例萃取。合并3次正丁醇萃取液，浓缩，得正丁醇萃取物浸膏61.3g。正丁醇萃取物加蒸馏水1.5L溶解，过滤，滤液以1ml/min流速通过树脂容积量为300ml的D101型大孔树脂柱，反复吸附3次。依次用8BV蒸馏水、8BV10%乙醇溶液洗脱除去杂质；再用10BV35%乙醇水溶液洗脱。收集35%乙醇的洗脱液，浓缩至干，得本发明的沙蓬总黄酮提取物7.9g。沙蓬总黄酮提取物中总黄酮的含量为72.01%，异鼠李素-3-O-芸香糖苷含量为5.98%。

实施例九沙蓬总黄酮提取物对链脲佐菌素（STZ）致糖尿病大鼠血糖的影响

1.实验目的

观察沙蓬总黄酮提取物对链脲佐菌素（STZ）致糖尿病大鼠血糖的影响，为制备有效的降血糖药物提供依据。

2.实验用试剂及仪器

链脲佐菌素（STZ）：SIGMA公司提供，批号：11K1240；

总黄酮提取物一、二、三：分别采用实施例一、二、三的制备方法得到的提取物（沈阳药科大学生药教研室提供）；

血糖仪：三诺安稳血糖测试仪/血糖试纸，型号：BGMS-1。

3.实验动物

SD大鼠：180～200g雄性，SPF级，沈阳药科大学实验动物中心提供，合格证号：0007882。

4.实验方法

取大鼠140只，随机取10只作为正常实验组，其余大鼠禁食24小时（自由饮水）后，尾静脉注射小剂量（30mg/kg）链脲佐菌素（STZ）。2～3周测定葡萄糖耐量，挑选糖耐量异常大鼠喂以高热量饲料，再分为11组，此时，共计12组，即正常实验组、高血糖模型组、二甲双胍阳性对照组、总黄酮提取物一、二、三的高（800mg/kg）、中（400mg/kg）、低（200mg/kg）剂量组。阳性药和实验用药分别用蒸馏水溶解，灌胃给药。模型组和正常实验组分别给予等量蒸馏水。

连续给药8周，每日一次，于第57天测定血糖、胰岛素水平。测量前禁食12小时，经大鼠眼眶取血，测量大鼠给药后血糖值、胰岛素水平。实验数据结果用SPSS16.0软件进行统计学分析。

5.实验结果

实验结果见表1和表2。

表1沙蓬总黄酮提取物对链脲佐菌素（STZ）致糖尿病大鼠血糖的影响(

^##P<0.01与二甲双胍组比；^*P<0.05,^**P<0.01与模型组比较。

表1结果表明，给予沙蓬总黄酮提取物和二甲双胍8周后，沙蓬总黄酮提取物一、二、三样品的800mg/kg、400mg/kg剂量组能显著降低STZ所致糖尿病大鼠的血糖，与模型组相比有显著性差异（P<0.01）。二甲双胍300mg/kg组能显著降低STZ所致糖尿病大鼠的血糖，与模型组相比有显著性差异（P<0.05）。沙蓬总黄酮提取物的降糖效果优于二甲双胍（P<0.05）。

表2沙蓬总黄酮提取物对链脲佐菌素（STZ）致糖尿病大鼠胰岛素的影响(

^##P<0.01与二甲双胍组比；^**P<0.01与模型组比较。

表2结果表明，模型组大鼠血清胰岛素水平明显高于空白对照组（P<0.01）。说明动物出现高胰岛素血症。沙蓬总黄酮提取物一、二、三样品的800mg/kg、400mg/kg组和二甲双胍300mg/kg组能够明显降低STZ所致糖尿病大鼠血清胰岛素水平，增加胰岛素的敏感性，与模型组相比有显著性差异（P<0.01）。沙蓬总黄酮提取物的降低血清胰岛素水平效果优于二甲双胍（P<0.01）。

6.实验结论

沙蓬总黄酮提取物一、二、三可显著降低链脲佐菌素（STZ）致糖尿病大鼠血糖和胰岛素水平，增加胰岛素的敏感性。沙蓬总黄酮提取物一、二、三的降血糖、降低血清胰岛素水平效果优于二甲双胍。

实施例十沙蓬总黄酮提取物对四氧嘧啶致实验性高血糖模型小鼠血糖的影响

1.实验目的

观察沙蓬总黄酮提取物对四氧嘧啶致实验性高血糖模型小鼠血糖的影响，为制备有效的降血糖药物提供依据。

2.药品及仪器

四氧嘧啶(SIGMA公司，批号：A-7413,Lot:2K1460)

沙蓬总黄酮提取物：实施例一制备的总黄酮提取物。（沈阳药科大学生药教研室提供）

沙蓬70%乙醇粗提取物：取沙蓬干燥药材，加10倍量70%乙醇水溶液，加热回流提取3次，提取时间分别为3h、2h、2h，过滤，合并3次提取液，减压回收溶剂，干燥，粉碎，既得70%乙醇提取物，作为粗提取物对照实验样品使用。（沈阳药科大学生药教研室提供）

血糖仪(三诺安稳血糖测试仪/血糖试纸，型号：BGMS-1)

3.实验动物

昆明种小鼠：18～22g，雄性，SPF级，沈阳药科大学实验动物中心提供，合格证号：0007880。

4.实验方法

取体重18～22g的昆明种小鼠60只，雄性，适应性饲养3天。随机取8只为正常对照组，其余小鼠禁食不禁水12小时，按200mg/kg给药量腹腔注射四氧嘧啶(pH4.4柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液溶解)，6h后腹腔注射20%葡萄糖溶液0.2ml/只。之后自由饮食，每天更换垫料。于注射四氧嘧啶72小时后，尾静脉取血测定小鼠空腹血糖值，选取血糖值≥11.0mmol/L的小鼠，按血糖水平均衡随机分为模型组、二甲双胍阳性对照组、沙蓬70%乙醇粗提取物组(700mg/kg)、沙蓬总黄酮提取物高剂量组(800mg/kg)、低剂量组(600mg/kg)，每组8只。阳性药和实验用药分别用蒸馏水溶解，按20ml/kg给药剂量灌胃给药。模型组和正常实验组分别给予等量蒸馏水。每日一次，连续两周。

将给药两周后各组小鼠禁食4～6小时，尾静脉取血测定小鼠空腹血糖值。之后灌胃给予2.0g/kg葡萄糖溶液，测定灌胃后0.5h、2h的空腹血糖值。观察模型组与各给药组灌胃葡萄糖后各时间点血糖曲线下面积的变化。血糖曲线下面积=0.25×(0h血糖值+4×0.5h血糖值+3×2h血糖值)。以上实验数据结果用SPSS16.0软件进行统计学分析，比较给药前后及组间差异。

5实验结果

沙蓬总黄酮提取物在高剂量(800mg/kg)下，与模型组比较，可显著降低实验性高血糖模型小鼠的血糖值，改善高血糖模型小鼠的糖耐量。与给药前相比，亦可降低实验性高血糖模型小鼠血糖值，改善其糖耐量，可能对糖尿病模型小鼠的胰岛细胞功能恢复有促进作用。沙蓬70%乙醇粗提取物(700mg/kg)亦能降低四氧嘧啶致高血糖模型小鼠的血糖值，但药效不及沙蓬总黄酮提取物的高剂量组。实验结果见表3。

表3沙蓬总黄酮提取物对四氧嘧啶致高血糖模型小鼠的血糖和糖耐量的影响(

^**P<0.01与空白组比较；^#P<0.05与模型组比较。

6实验结论

沙蓬总黄酮提取物的高剂量组，可显著降低四氧嘧啶致高血糖模型小鼠的血糖值，但是，对糖耐量的影响不显著。70%乙醇粗提取物组亦能降低四氧嘧啶致高血糖模型小鼠的血糖值，但药效不及沙蓬总黄酮提取物的高剂量组。

实施例十一沙蓬总黄酮提取物对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗及细胞增殖的影响

1.实验目的

测定沙蓬总黄酮提取物对胰岛素抵抗HepG2细胞模型的影响，为筛选降血糖有效药物提供依据。

2.实验用试剂及仪器

DMEM培养基(GIBCO，Lot：No1459071)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：050908)；胰蛋白酶(Amresco,，Lot：BE2189)；PBS(北京中杉金桥生物科技有限公司)；葡萄糖试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司，批号：050508)；牛胰岛素(Sigma-I-5500)；MTT(Amresco，Lot：Amresco-0793)。

BC-JI60SCO₂细胞培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；Multiskan Mk3型酶标仪(赛默飞世尔(上海)仪器有限公司XSF-1型)；37XB倒置显微镜(重庆光学仪器厂)；TDL80-2B台式离心机(上海安亭科化学仪器厂)。

3.实验细胞

人肝癌HepG2细胞株：沈阳药科大学药理实验室提供。

4.样品溶液的制备

（1）胰岛素(M=5733.52)储备液的制备：称取1.15mg胰岛素至5ml Ep管，加入1mlPBS，温水浴溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，得浓度为2×10^-4mol/L储备液，分装待用。

（2）二甲双胍(M=165.63)储备液的制备：称取662.52mg二甲双胍原料药至5ml Ep管，加入1ml PBS，温水溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，分装待用。

（3）沙蓬总黄酮提取物储备液的制备：取1mg沙蓬总黄酮提取物（实施例一得到的总黄酮提取物），加入100μl DMSO溶解，制成终浓度为10g/L的总黄酮提取物储备液，待用。

5.实验方法

（1）HepG2细胞培养

HepG2细胞复苏后，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液在37℃、5%CO₂条件下培养。细胞长满后，弃去培养液，用PBS溶液轻轻洗涤2次。加入胰蛋白酶及EDTA消化液消化，每3天按1:3比例传代1次，均取对数生长期的细胞用于实验。

（2）持续高糖导致HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立

将HepG2细胞复苏后，用高糖DMEM培养基培养。将处于对数生长期的细胞消化后，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液调整细胞密度为5×10⁴个/ml，接种于96孔培养板中，每孔200μl细胞悬液。实验设正常对照组及模型组，细胞培养24h后，正常对照组更换不含血清的高糖DMEM培养液，模型组更换新配制的含有胰岛素INS（M=5733.52）浓度分别为5×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L、2.5×10^-8mol/L、5×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L、2.5×10^-7mol/L、5×10^-7mol/L的高糖DMEM无血清培养基，每孔100μl。孵育24h后，留取培养基，1000转离心5分钟，取上清液进行剩余葡萄糖含量测定，同时采用MTT法检测细胞生长活性。把正常对照组与模型组细胞葡萄糖消耗量差值最大的胰岛素作用浓度作为胰岛素适宜浓度。

（3）沙蓬总黄酮提取物对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

将上述处于对数生长期的细胞消化后，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基调整细胞浓度为5×10⁴个/mL，接种于96孔培养板中，每孔200μl细胞悬液。每竖排为一组，分为空白对照组、模型组、二甲双胍阳性对照组（终浓度分别为2mmol/L、4mmol/L）、沙蓬总黄酮提取物不同剂量组。培养24h后，弃去培养基，用PBS洗涤两次，将胰岛素用无血清高糖DMEM培养基配制成浓度为1×10^-7mol/L药物稀释液。用该稀释液将各受试药物稀释至相应检测浓度，并控制各实验组中DMSO终浓度均为0.01%，每孔100μl，孵育24h。24h后留取培养基，1000转离心5分钟，取上清液进行剩余葡萄糖含量测定，以空白组为对照，计算各组细胞的葡萄糖消耗量。同时采用MTT法检测沙蓬总黄酮提取物对细胞生长活性的影响。

（4）MTT法检测沙蓬总黄酮提取物对细胞生长活性的影响

葡萄糖消耗实验结束后，移出待测培养液，每孔加入80μl DMEM细胞培养液和20μlMTT，37℃，5%的CO₂继续培养。4h后终止培养，小心弃去孔中液体，每孔加入100μl DMSO，室温下震荡1min使结晶充分溶解，用酶标仪在492nm波长下测定各孔的吸光度值，以检测对细胞生长活性的影响。

（5）统计学分析

数据处理使用SPSS15.0统计软件进行单因素的方差分析，结果均以

±SEM表示。P<0.05认为有统计学差异。

6.实验结果

实验结果见表4～表6。

表4总黄酮提取物对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响（一）n=4)

^*P<0.05；^**P<0.01

表5总黄酮提取物对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响（二）

n=4)

^*P<0.05；^**P<0.01

表6总黄酮提取物对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响（三）

n＝4)

^*P<0.05；^**P<0.01

7.实验结论

与空白对照组比较，沙蓬总黄酮提取物在10^-4g/L～10^-8g/L浓度下有显著的降糖作用。在10^-2g/L～10^-10g/L浓度范围内均具有促进细胞生长作用，未见细胞毒性作用。

实施例十二沙蓬总黄酮提取物片剂的制备

取沙蓬总黄酮有效部位提取物50g，粉碎过100目筛，加入淀粉3g混合均匀，再加入10%淀粉浆适量制成软材，20目筛网制粒，50℃干燥，过30目筛整粒，加入羟丙基纤维素3g和硬脂酸镁1g充分混匀，压片，薄膜包衣，制得1000片。

实施例十三沙蓬总黄酮提取物胶囊剂的制备

取沙蓬总黄酮有效部位提取物50g，粉碎过100目筛，加入淀粉3g，微晶纤维适量，用稀乙醇制粒，20目筛网制粒，50℃干燥，整粒，加入硬脂酸镁适量，用30目筛混合均匀，采用胶囊板灌装即得，1000粒。

实施例十四沙蓬总黄酮有效部位提取物颗粒

取沙蓬总黄酮有效部位提取物50g，粉碎过100目筛，加入淀粉500g，加入10%淀粉浆适量制成颗粒，50℃干燥，分装。

实施例十五沙蓬总黄酮有效部位提取物口服液

取沙蓬总黄酮有效部位提取物50g，加蒸馏水溶解，用乙醇及蒸馏水调整总量至1000ml，醇含量达20%，用20%的Na₂CO₃调节pH值为6.0～7.0，搅匀，滤过，灌装，每只10ml，灭菌，即得。

Claims (10)

1.沙蓬总黄酮提取物，其特征在于, 制备方法如下:

（1）取沙蓬干燥药材，粉碎，加乙醇水溶液浸泡，加热回流提取；

（2）过滤，合并滤液，浓缩，浓缩液备用；

   （3）将步骤（2）所得的浓缩液，用石油醚萃取，然后再用正丁醇萃取，将正丁醇层萃取液减压回收溶剂，浓缩得浸膏，浸膏加蒸馏水溶解，抽滤，滤液备用；

   （4）将步骤（3）所得滤液，用大孔树脂柱吸附，依次用蒸馏水、8%~20%的乙醇水溶液洗脱，再用25%~35%的乙醇洗脱，收集25%~35%的乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，粉碎，过筛，得沙蓬总黄酮提取物。

2.如权利要求1所述的沙蓬总黄酮提取物，其特征在于,步骤（1）中所述的乙醇水溶液的浓度为50%～95%，为药材的5～15倍量，浸泡1～5小时，加热回流提取2～3次，每次2～3小时。

3.如权利要求1所述的沙蓬总黄酮提取物，其特征在于，所述的大孔树脂柱为AB-8型、HPD300、HPD400或D101型大孔树脂。

4.如权利要求1所述的沙蓬总黄酮提取物，其特征在于,步骤（3）中浓缩液用石油醚、正丁醇各萃取3次，每次萃取采用的有机溶剂用量按浓缩液：有机溶剂1:1的比例萃取，正丁醇萃取物浸膏加蒸馏水溶解，按浸膏：蒸馏水1：20～40的比例加入蒸馏水溶解浸膏。

5.如权利要求1所述的沙蓬总黄酮提取物，其特征在于,步骤（4）中蒸馏水洗脱4～8个柱体积，8%～20%的乙醇水溶液洗脱5～8个柱体积，25%～35%的乙醇洗脱8～15个柱体积。

6.一种药物组合物，包含权利要求1所述的沙蓬总黄酮提取物。

7.权利要求1所述的沙蓬总黄酮提取物或权利要求6所述的药物组合物与药学上可接受的载体制备成临床可接受的药物制剂。

8.如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述的药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液。

9.权利要求1-5任何一项所述的沙蓬总黄酮提取物或权利要求6所述的药物组合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。

10.如权利要求1-5任何一项所述的沙蓬总黄酮提取物，其特征在于，以鼠李素-3-O-芸香糖苷计，其中总黄酮含量大于50%，异鼠李素-3-O-芸香糖苷含量为5%～8%。