CN107213176A - 一种八仙花叶提取物及其药物组合物、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药、天然药物制药领域，涉及一种八仙花叶提取物及其药物组合物、制备方法和应用。本发明目的是提供八仙花叶的总酚酸提取物在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用。本发明八仙花叶提取物的制备方法如下：(1)取八仙花叶，粉碎，加溶剂浸泡提取；(2)过滤，滤液浓缩备用；(3)将浓缩液萃取处理得到浸膏，浸膏加水过滤得滤液；(4)将滤液大孔树脂柱吸附，依次用蒸馏水、10‑20％的乙醇水溶液，20‑30％的乙醇洗脱，30‑40％的乙醇洗脱，收集30‑40％的乙醇洗脱液，浓缩干燥，粉碎，过筛，得八仙花叶提取物。八仙花叶总酚酸提取物中总酚酸含量高达40％，质量稳定可控。该提取物通过体内外抗甲状腺癌药理试验明确了其对于甲状腺癌有明确的治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于中药、天然药物制药领域，具体涉及一种八仙花叶提取物及其药物组合物、制备方法和应用。
背景技术
八仙花(Hydrangea macrophylla)又名绣球花、紫阳花、粉团花，为虎耳草科八仙花属多年生草本植物。原产中国大陆长江中下游以南和日本本州等地，在我国的栽培历史悠久，分布于我国南北各地。《中药大词典》记载：“苦微辛，寒，有小毒。”其复方治疟疾和治肾囊风。近年来，日本学者对其多有研究，其有效成分具有抗溃疡、抗过敏等生物活性。甲状腺癌的背景介绍甲状腺癌是临床上较为常见的恶性肿瘤，近10年来发病率呈迅速上升趋势(1)。最新数据显示，甲状腺癌发病率每年增加5％左右(2)。尽管有学者认为近年来的发病率增加是由于甲状腺球蛋白和抗甲状腺球蛋白抗体等生物标志物的发现、临床诊断技术的进步提高了甲状腺癌确诊率，而非真性发病率的升高，但甲状腺癌的死亡率每年增长了0.9％。甲状腺癌主要有4种病理分型：甲状腺乳头状癌(Papillary Thyroid Carcinoma，PTC)、甲状腺滤泡状癌(Follicular Thyroid Carcinoma，FTC)、髓样癌(Medulla ThyroidCarcinoma，MTC)和未分化癌(Anaplastic Thyroid Carcinoma，ATC)。PTC与FTC为分化型甲状腺癌(Differentiated Thyroid Carcinoma，DTC)，占甲状腺癌的90-95％。大部分患者通过传统方法治疗都能获得良好的疗效。因此，DTC患者的20年生存率达到90％。但仍有少部分的DTC患者出现远处转移并对放射性碘不吸收，这些患者因缺少有效的治疗方法10年生存率只有15-20％(3)。
随着近年来甲状腺癌分子生物学研究的快速发展，许多有效的药物分子作用靶标相继被发现，并且基于这些靶点研发出许多有效的靶向治疗药物，其中靶向药物索拉非尼(sorafenib)和乐伐替尼(lenvatinib)已成功上市。靶向治疗为难治性甲状腺癌提供了新的治疗手段，显著改善了晚期甲状腺癌患者的预后生存期，呈现良好的发展和应用前景。虽然分子靶向药物已取得了巨大的成就，但由于有些药物毒副作用较大且较严重，有些患者不得不减少使用剂量，甚至停止用药，从而不能达到其应有的治疗效果。因此，开发出高效、低毒的全新治疗药物仍是甲状腺癌治疗的重点。
目前未见八仙花(Hydrangea macrophylla)叶或其总酚酸提取物具有抗甲状腺癌的报道，而八仙花总酚酸提取物的生产工艺在国内外的文献报道也属空白。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种八仙花叶提取物及其制备方法和应用。尤其是八仙花叶的总酚酸提取物在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用。
本发明八仙花叶提取物是采用以下方法制备，步骤如下：
(1)取八仙花叶的干燥药材，粉碎，加乙醇水溶液浸泡，加热提取；
(2)过滤，得滤液，浓缩，浓缩液备用；
(3)将步骤(2)所得的浓缩液，用石油醚或正己烷萃取，然后再用正丁醇萃取，取正丁醇层萃取液减压浓缩得浸膏，加水溶解浸膏，抽滤，滤液备用；
(4)将步骤(3)所得滤液，大孔树脂柱吸附，依次用蒸馏水、10％v/v-20％v/v的乙醇水溶液，20％v/v-30％v/v的乙醇洗脱，30％v/v-40％v/v的乙醇洗脱，收集30％v/v-40％v/v的乙醇洗脱液，浓缩干燥，粉碎，过筛，得八仙花叶提取物。
本发明八仙花叶提取物以槲皮素为定量指标，其中总酚酸含量超过40％，即本发明八仙花叶提取物为八仙花叶的总酚酸提取物。
上述技术方案中，步骤(1)中所述的乙醇水溶液的浓度为60-90％，料液比按重量比计为1:5-20，浸泡时间为12-24小时，加热回流提取2-3次，每次2-3小时。
上述技术方案中，步骤(2)浓缩至相对密度为1.00-1.20。
上述技术方案中，步骤(3)中浓缩液用石油醚或正己烷、正丁醇各萃取2-3次，每次萃取采用的有机溶剂用量按浓缩液:有机溶剂的重量比为0.5-1:1的比例萃取，正丁醇萃取物浸膏加水溶解，按浸膏:蒸馏水的重量比为1:10-35的比例加入蒸馏水溶解浸膏。
优选的，步骤(3)中浓缩液用石油醚、正丁醇各萃取2-3次，每次萃取采用的有机溶剂用量按浓缩液:有机溶剂的重量比为0.5:1的比例萃取，正丁醇萃取物浸膏加水溶解，按浸膏:蒸馏水的重量比为1:10-35的比例加入蒸馏水溶解浸膏。
上述技术方案中，步骤(4)所述的大孔树脂柱为AB-8、HPD300、HPD400或D101型的大孔吸附树脂。
上述技术方案中，步骤(4)中蒸馏水洗脱3-6个柱体积，10％v/v-20％v/v的乙醇水溶液洗脱3-6个柱体积，30％v/v-40％v/v的乙醇洗脱3-10个柱体积。
上述技术方案中，步骤(4)中上样量，按药材:树脂的重量比为1:1-2上大孔树脂柱。
上述技术方案中，步骤(4)所述洗脱的洗脱速度均为0.1-0.5L/h。
通过以上技术方案制备所得的八仙花叶总酚酸提取物的成分分析：经过TLC和HPLC分析，结合ESI-MS、1HNMR和13CNMR波谱数据解析验证，确定其中含有槲皮素，且HPLC分析结果表明，提取物中的化合物多为槲皮素类似物(具有类似的紫外吸收)。故以槲皮素为对照品，采用紫外分光度法测定总酚酸的含量。结果显示，八仙花叶总酚酸提取物中总酚酸的含量超过40％。
进一步的，对本发明提取物进行了体内外抗甲状腺癌药理作用的实验，实验结果表明，本发明的八仙花叶总酚酸提取物，在人甲状腺髓样癌细胞株皮下瘤移植模型中，对甲状腺髓样癌肿瘤具有用量依赖性的抗肿瘤效果。细胞水平实验表明，八仙花叶总酚酸提取物能够抑制人甲状腺髓样癌细胞株的增殖，并且抑制作用存在剂量和时间依赖性，具有治疗甲状腺癌的作用。故本发明提供的八仙花叶总酚酸提取物的用途为八仙花叶总酚酸提取物在制备治疗甲状腺癌药物中的应用。
为了利用上述应用，本发明还提供了以八仙花叶总酚酸提取物为主要活性成分，加入药学上常规辅料制成的药剂。如可以制成口服制剂或注射制剂。具体的，口服制剂可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等；注射制剂可以为静脉注射制剂。
本发明的有益效果如下：
1)首次提供了制备提取八仙花叶总酚酸提取物的制备方法。
2)本发明八仙花叶总酚酸提取物中总酚酸含量高达40％，质量稳定可控。
3)本发明八仙花叶总酚酸提取物通过体内外抗甲状腺癌药理试验明确了其对于甲状腺癌有明确的治疗效果。
4)本发明的制备方法工艺经济、简便、适用于工业化大生产。
附图说明
图1为八仙花叶总酚酸提取物对甲状腺髓样癌细胞TT细胞增殖的抑制作用。
图2表示八仙花叶总酚酸提取物对甲状腺髓样癌肿瘤的生长的抑制作用。
图3表示八仙花叶总酚酸提取物对小鼠体重的影响。
图4表示八仙花叶总酚酸提取物对小鼠肿瘤瘤重生长的影响。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，说明但不限制本发明。以及以下实施例制备所得八仙花叶总酚酸提取物的总酚酸含量采用紫外光谱法测定。
实施例一 八仙花叶总酚酸提取物的制备(一)
将2kg粉碎后的八仙花叶的干燥药材，按照药材:乙醇溶液重量比1:5的比例，加入60％乙醇浸泡12小时，然后加热回流提取3次，每次提取时间分别为2h、2h、2h。合并三次提取液，过滤，回收溶剂，浓缩至相对密度为1.00-1.20。浓缩液分别用石油醚、正丁醇各萃取三次，按浓缩液:溶剂重量比1:1的比例萃取。合并三次正丁醇萃取液，浓缩，得正丁醇萃取物浸膏67.8g。正丁醇萃取物加蒸馏水1.5L溶解，过滤，将滤液吸附于2kg的AB-8型大孔树脂柱，反复吸附三次。首先用3倍柱体积的蒸馏水、3倍柱体积的10％乙醇溶液洗脱出去杂质；再用5倍柱体积的30％的乙醇溶液洗脱。收集30％乙醇的洗脱液，浓缩，得本发明的八仙花叶总酚酸提取物2.2g。八仙花叶总酚酸提取物总酚酸含量为45％。
实施例二 八仙花叶总酚酸提取物的制备(二)
将2kg粉碎后的八仙花叶的干燥药材，按照药材:乙醇溶液重量比为1:10的比例，加入70％乙醇浸泡12小时，然后加热回流提取3次，每次提取时间分别为2h、2h、2h。合并三次提取液，过滤，回收溶剂，浓缩至相对密度为1.00-1.20。浓缩液分别用石油醚、正丁醇各萃取三次，按浓缩液:溶剂重量比为1:1的比例萃取。合并三次正丁醇萃取液，浓缩，得正丁醇萃取物浸膏85.3g。正丁醇萃取物加蒸馏水2.8L溶解，过滤，将滤液吸附于4kg的HPD300型大孔树脂柱，反复吸附三次。首次用4倍柱体积的蒸馏水、5倍柱体积的20％乙醇溶液洗脱出去杂质；再用10倍柱体积的40％的乙醇溶液洗脱。收集40％乙醇的洗脱液，浓缩，得本发明的八仙花叶总酚酸提取物5.5g。八仙花叶总酚酸提取物总酚酸含量为42％。
实施例三 八仙花叶总酚酸提取物的制备(三)
将2kg粉碎后的八仙花叶的干燥药材，按照药材:乙醇溶液重量比为1:20的比例，加入90％乙醇浸泡24小时，然后加热回流提取3次，每次提取时间分别为3h、3h、3h。合并三次提取液，过滤，回收溶剂，浓缩至相对密度为1.00-1.20。浓缩液分别用石油醚、正丁醇各萃取三次，按浓缩液:溶剂重量比为1:1的比例萃取。合并三次正丁醇萃取液，浓缩，得正丁醇萃取物浸膏167g。正丁醇萃取物加蒸馏水2.0L溶解，过滤，将滤液吸附于3kg的D101型大孔树脂柱，反复吸附三次。首次用6倍柱体积的蒸馏水、6倍柱体积的20％乙醇溶液洗脱出去杂质；再用10倍柱体积的40％的乙醇溶液洗脱。收集40％乙醇的洗脱液，浓缩，得本发明的八仙花叶总酚酸提取物10.6g。八仙花叶总酚酸提取物总酚酸含量为55％。
实施例四 八仙花叶总酚酸提取物的制备(四)
将2kg粉碎后的八仙花叶的干燥药材，按照药材:乙醇溶液重量比1:8的比例，加入70％乙醇浸泡12小时，然后加热回流提取2次，每次提取时间分别为3h、2h、2h。合并三次提取液，过滤，回收溶剂，浓缩至相对密度为1.00-1.20。浓缩液分别用石油醚、正丁醇各萃取三次，按浓缩液:溶剂重量比为1:1的比例萃取。合并三次正丁醇萃取液，浓缩，得正丁醇萃取物浸膏68.9g。正丁醇萃取物加蒸馏水3.5L溶解，过滤，将滤液吸附于4kg的HPD400型大孔树脂柱，反复吸附三次。首次用3倍柱体积的蒸馏水、4倍柱体积的10％乙醇溶液洗脱出去杂质；再用40倍柱体积的30％的乙醇溶液洗脱。收集30％乙醇的洗脱液，浓缩至干，得本发明的八仙花叶总酚酸提取物2.3g。八仙花叶总酚酸提取物总酚酸含量为40％。
实施例五 八仙花叶总酚酸提取物对人甲状腺髓样癌细胞的体外增殖的抑制作用
将1×104个人甲状腺髓样癌细胞接种于96孔板内，在孵箱中培养过夜，然后分别经过空白(0.1％DMSO)和不同浓度的八仙花总酚酸提取物处理24，48和72小时。在处理完成后，每个培养孔加入20μL 5mg/mL的MTT，并在37℃孵育4个小时。然后除去每孔的上清溶液，并加入150μL的DMSO溶解沉淀。用多功能检测器(Molecular Devices，USA)测定每孔的OD值(570nm)。我们将空白对照孔的细胞假设为100％的生长，而与空白对照相比较就可以计算出八仙花叶总酚酸提取物处理孔的细胞生长情况。八仙花总酚酸提取物对细胞增殖的抑制率用以下公式计算：
细胞增殖抑制率(％)＝(OD空白对照孔-OD八仙花总酚酸提取物处理孔)/OD空白对照孔×100％
结果见图1，由图可见：八仙花叶总酚酸提取物能够抑制人甲状腺髓样癌细胞株的增殖，并且抑制作用存在剂量和时间依赖性，48小时八仙花叶总酚酸提取物对甲状腺髓样癌细胞增殖抑制的IC50为4.14mg/mL。
实施例六 体内药效学实验研究八仙花叶总酚酸提取物对小鼠甲状腺髓样癌肿瘤生长的抑制情况
将100μL细胞接种于6周龄，雌性Balb/c裸鼠的右前边的腋下空白处。待肿瘤长至100mm3左右时，将30只裸鼠随机分为5个组，分别为空白对照组，阳性(多柔比星)对照组和八仙花叶总酚酸提取物高中低(2000，1000和500mg/kg)剂量组。八仙花叶总酚酸提取物处理组(500，200和100mg/kg)每天灌胃一次200μl含有用2.5％Tween-80和2.5％乙醇溶解的不同浓度的八仙花叶总酚酸提取物的生理盐水溶液，连续给药18天的治疗。空白对照组给予同等体积的生理盐水，而阳性对照组每四天尾静脉注射一次剂量为5mg/kg的多柔比星。肿瘤体积每两天测量一次，计算公式为：V(mm3)＝π/6×长×宽×宽。
图2-图4均为八仙花叶总酚酸提取物抑制甲状腺髓样癌肿瘤生长的影响，其中图2-图4分别表现了八仙花叶总酚酸提取物对甲状腺髓样癌肿瘤的生长的抑制作用、对小鼠体重的影响、以及对小鼠肿瘤瘤重生长的影响。结果表明：在人甲状腺髓样癌细胞株皮下瘤移植模型中，八仙花叶总酚酸提取物对甲状腺髓样癌肿瘤具有用量依赖性的抗肿瘤效果。100mg/kg，200mg/kg和500mg/kg的八仙花叶总酚酸提取物对甲状腺髓样癌肿瘤的抑瘤率分别为64.14％，72.47％和74.58％。
Claims (10)
1.八仙花叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)取八仙花叶的干燥药材，粉碎，加乙醇水溶液浸泡，加热提取；
(2)过滤，得滤液，浓缩，浓缩液备用；
(3)将步骤(2)所得的浓缩液，用石油醚或正己烷萃取，然后再用正丁醇萃取，取正丁醇层萃取液减压浓缩得浸膏，加水溶解浸膏，抽滤，滤液备用；
(4)将步骤(3)所得滤液，大孔树脂柱吸附，依次用蒸馏水、10％v/v-20％v/v的乙醇水溶液，20％v/v-30％v/v的乙醇洗脱，30％v/v-40％v/v的乙醇洗脱，收集30％v/v-40％v/v的乙醇洗脱液，浓缩干燥，粉碎，过筛，得八仙花叶提取物。
2.根据权利要求1所述的八仙花叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的乙醇水溶液的浓度为60-90％，料液比按重量比为1:5-20，浸泡时间为12-24小时，加热回流提取2-3次，每次2-3小时。
3.根据权利要求1所述的八仙花叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤(2)浓缩至相对密度为1.00-1.20。
4.根据权利要求1所述的八仙花叶提取物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中浓缩液用石油醚、正丁醇各萃取2-3次，每次萃取采用的有机溶剂用量按浓缩液:有机溶剂的重量比为0.5-1:1的比例萃取，正丁醇萃取物浸膏加水溶解，按浸膏:蒸馏水重量比为1:10-35的比例加入蒸馏水溶解浸膏；
优选的，步骤(3)中浓缩液用石油醚、正丁醇各萃取3次，每次萃取采用的有机溶剂用量按浓缩液:有机溶剂的重量比为1:1的比例萃取，正丁醇萃取物浸膏加水溶解，按浸膏:蒸馏水的重量比为1:10-35的比例加入蒸馏水溶解浸膏。
5.根据权利要求1所述的八仙花叶提取物的制备方法，其特征在于：至少满足以下任意一项：
步骤(4)所述的大孔树脂柱为AB-8、HPD300、HPD400或D101型的大孔吸附树脂；
步骤(4)中蒸馏水洗脱3-6个柱体积，10％v/v-20％v/v的乙醇水溶液洗脱3-6个柱体积，30％v/v-40％v/v的乙醇洗脱3-10个柱体积；
步骤(4)中上样量，按药材:树脂的重量比为1:1-2上大孔树脂柱；
步骤(4)所述洗脱的洗脱速度均为0.1-0.5L/h。
6.权利要求1-5任一项所述的方法制备所得的八仙花叶提取物。
7.根据权利要求6所述的八仙花叶提取物，其特征在于：所述提取物中总酚酸的含量超过40％。
8.权利要求6或7所述的八仙花叶提取物在制备治疗甲状腺癌药物中的应用。
9.药物组合物，其特征在于：以权利要求6或7所述的八仙花叶提取物为主要活性成分，加入药学上常规辅料制成的药剂。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于：所述药剂为口服制剂或注射制剂；
优选的，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液；所述注射制剂为静脉注射制剂。
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