CN101249118A - 一种中药提取物及其医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明属中药领域，涉及一种山香园叶提取物，含黄酮类化学成分及其医学上可接受的盐，总黄酮含量15％以上，含芹菜素苷元及以芹菜素为苷元的黄酮苷类成分以芹菜素计，不低于1.5％，黄酮类化学成分含芹菜素、芹菜素－7－O－β－新橙皮糖苷、芹菜素－7－O－2′－β－鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素－7－O－β－葡萄糖苷、木犀草素－7－O－β－葡萄糖苷中的一种或多种；及其提取物的制备方法，提取物的质量控制方法，提取物在制备抗菌、抗病毒、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、肝脏保护、抗乙肝病毒、抗血栓、抗动脉硬化等药物中的应用。

Description

一种中药提取物及其医药用途

技术领域

本发明涉及一种中药提取物，具体涉及一种含芹菜素和/或以芹菜素为苷元的黄酮苷类化学成分及其医学上可接受的盐的山香圆叶提取物及该提取物的制备方法，提取物的质量控制方法，以及该提取物在制备抗菌、抗病毒、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗血栓、抗动脉硬化、肝脏保护、抗乙肝病毒、抗抑郁、神经元保护及免疫调节等药物中的应用，比如在制备治疗咽喉炎、口腔溃疡、妇科炎症、肝炎、病毒性感冒、肿瘤及心脑血管等疾病药物中的应用。

背景技术

山香圆叶为省沽油科植物山香圆Turpinia arguta Seem.的新鲜或干燥叶，具有清热泄火，利咽消肿的功效，到目前为止，研究文献确切报道的其化学成分主要有2α-羟基熊果酸、2α、19α-二羟基熊果酸、19α-羟基熊果酸、2α-过氧羟基熊果酸、熊果酸、α-香树脂醇、肉豆蔻酸、胡萝卜苷等(方乍浦，等，山香圆叶化学成分的研究.中草药，1987.18(7)：6)，多为小极性部分；发明专利”一种治疗慢性咽炎、慢性扁桃体炎的中药有效部位山香园总黄酮的制备方法(申请号：200510038205.X)”公开了一种山香圆总黄酮的制备方法和治疗慢性咽炎、慢性扁桃体炎的应用，但其制备所得的提取物成分不明确，用山香圆苷A为指标成分对山香圆总黄酮进行测定不可行，山香圆苷A为三叶山香圆(Turpiniaternate)叶中分离得到的大柱烷类化合物(Qian Yu，Hideaki OTSUKA，Ei jiHIRATA，Takakazu SHUNZATO，Yoshio TAKEDA.Turpinionsides A-E：MegastigmaneGlucisides from Leaves of Turpinia ternateNAKIA.Chem.Pharm.Bull.50(5)640-644(2002))，不是黄酮类化合物。目前已上市的山香圆叶制剂有山香圆颗粒、山香圆片、山香圆含片等，为喉痹类药品，临床用于肺胃热盛，咽炎、急性扁桃体炎，咽喉肿痛的治疗，有良好的疗效，迄今未见有山香圆叶及其制剂不良反应的报道。

本发明提供了一种山香圆叶提取物及该提取物的制备方法，质量控制方法，尤其是提取物指纹图谱质量控制方法，以及该提取物在制备抗菌、抗病毒、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗血栓、抗动脉硬化、肝脏保护、抗乙肝病毒、抗抑郁、神经元保护及免疫调节等药物中的应用，比如在制备治疗咽喉炎、口腔溃疡、妇科炎症、肝炎、病毒性感冒、肿瘤及心脑血管等疾病药物中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有效的山香圆叶的提取物，并涉及提取物的制备方法、质量控制方法和医药用途。

本发明的山香圆叶提取物，其特征在于提取物中含黄酮类化学成分，黄酮类化学成分含芹菜素和/或以芹菜素为苷元的黄酮苷类成分，及该黄酮类化学成分或组合物的医学上可接受的盐，如钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钙盐等，医学上可接受的盐的制备如可以由提取物与适量对应的稀碱溶液反应而得到，碱可以为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、氨水、氧化镁、氢氧化钙等，如提取物5％溶液与2％碳酸氢钠溶液混合，使反应，调节pH值至5～8，溶液减压浓缩，喷雾干燥，即得。

本发明的提取物也可以为提取物黄酮的金属配合物，如在无水的条件下，将金属盐加入到提取物的无水乙醇溶液中，搅拌，加热回流，使反应，用乙醇或水洗涤沉淀，得配合物粉末，金属配合物离子如铜(II)、锌(II)、镉(II)、铝(III)、钴(II)、镍(II)等。

本发明区别于目前现有技术的显著特征之一为总黄酮含量及其主要组分含量，发明专利”一种治疗慢性咽炎、慢性扁桃体炎的中药有效部位山香园总黄酮的制备方法(申请号：200510038205.X)”公开的制备方法所得的山香圆总黄酮用非黄酮类成分大柱烷类化合物山香圆苷A为指标成分对山香圆总黄酮进行测定而不可行，目前已有技术山香圆制剂为山香圆叶的水提醇沉法提取(片、颗粒；中药成方制剂WS₃-B-2085-96、WS₃-B-3139-98)，经重复试验表明其提取物中总黄酮含量均很低(低于9％)，与已有文献报道(罗宪堂，余世平，熊友香，山香圆口服液中黄酮类成分含量测定研究，海峡药学，2002，14(4)：19-20；罗宪堂，熊友香，余世平，UV法测定山香圆叶中黄酮类成分含量，中医药研究，2002，18(5)：48-49)所揭示的结果一致；山香圆含片中为70％乙醇提取得到的粗提取物(罗宪堂，陈丽华，李昶，山香圆含片的制备工艺研究，中成药，2005，25(4)：276-8)，重复试验结果表明其提取物还含大量的叶绿素，难以干燥，且以脂溶性成分和杂质为主，较难溶于水，这与工艺侧重脂溶性成分熊果酸有关(罗宪堂，陈丽华，李昶，山香圆含片的制备工艺研究，中成药，2005，25(4)：276-8；魏福有，刘晓敏，吴小瑾，薄层比色法测定山香圆含片中熊果酸的含量，江西中医学院学报，1997，9(1)：34-35；罗宪堂，万文玲，郑佳嘉，山香圆含片鉴别与含量测定的研究，中医药学刊，2003，21(5)：828-9)，而本发明的提取物主要是较高含量的黄酮类化学组分和/或酚酸类组分，并且除芹菜素苷元外多水溶性较好，几乎不含叶绿素。

从本发明的提取物的多种混合物(如实施例1、实施例3)中可分离得到A、B、C、D、E、F、G、H、I、J等单体化学成分，经鉴定，具体为，A为芹菜素(Apenin)，B为芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷(Apenin-7-O-β-glucoside)，C为芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷(Apenin-7-O-β-neohesperidoside)，D为芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷(Apenin-7-O-β-(2″，6″-di-α-rhamnopyranosyl)-glucopyranoside)，E、F、G、H均为浅黄色粉末，对E、F、G、H成分进一步进行酸水解(E、F、G、H的乙醇溶液，加等体积2mol/L盐酸溶液，在充N₂环境中水浴加热水解3小时)，挥去乙醇，并用醋酸乙酯萃取水解液，分别得到醋酸乙酯萃取物，用甲醇溶解，以芹菜素为对照，照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录VI B)试验，薄层板：硅胶G板，展开剂：甲苯三氯甲烷-丙酮(4∶2.5∶3.5)，显色剂：1％三氯化铝乙醇溶液，紫外365nm下检视，结果表明在芹菜素对照品色谱相应的位置上，醋酸乙酯萃取物均显一个相同颜色的荧光斑点；并照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VI D)测定，岛津LC-10Atvp高效液相色谱仪，色谱柱：Hypersil ODS柱(4.6×250mm，5μm)，流动相：乙腈-0.1％醋酸水溶液(30∶70)，检测波长：335nm，进样量：10μl，结果表明，醋酸乙酯萃取物色谱中，均显一个色谱峰，并与芹菜素对照品相同保留时间色谱一致，确定化合物E、F、G、H为以芹菜素为苷元的黄酮苷类成分，则提取物主要由芹菜素及含芹菜素的苷组成，另含非以芹菜素为苷元的化学成分，如I为木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷(Luteolin-7-O-β-glucoside)，J为没食子酸(Gallic acid)成分等，结构式如图1示，I为芹菜素，II为芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷，III为芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷，IV为芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷，V为木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷，VI为没食子酸。

本发明的提取物以总黄酮计，总黄酮成分含量不低于15％，含芹菜素苷元及以芹菜素为苷元的黄酮苷类成分以芹菜素计，不低于1.5％，黄酮类化学成分含芹菜素、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7- O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷中的一种或多种。总黄酮含量优选不低于50％，芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量之和不低于6.0％或芹菜素含量不低于3.0％；进一步优选含总黄酮不低于80％，芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量之和不低于10.0％或芹菜素含量不低于5.0％，所述的芹菜素含量并非仅指植物中的所有原始游离芹菜素成分含量，而是芹菜素和以芹菜素为苷元的苷类折算成芹菜素计算，也含用完全水解或部分水解工艺制备所得的水解物。提取物可以为含芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷量之和不低于50.0％。总黄酮成分除含芹菜素、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷等黄酮类等成分外，还含如上述以芹菜素为苷元的E、F、G、H黄酮苷成分，以及木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷等，其它如没食子酸等成分。

根据提取工艺及药材来源(含采收季节)不同，提取物中主要成分及其含量可有所不同，如实施例1中，65％乙醇洗脱物主要成分为芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷，其中芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量可分别达到1.0％以上，甚至3％以上，进一步硅胶柱层析(提取物：硅胶(200-300目)＝1∶20，以三氯甲烷-甲醇9∶1、8∶2、7∶3梯度洗脱，每梯度洗脱2-3BV，以每0.5BV收集流份并分别挥去溶剂)可分别得芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和化合物E、F、G、H、木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷等单体成分；实施例1中，以15％乙醇洗脱除杂，再分别以40％、60％乙醇洗脱2BV(约1BV/hr)，然后以80％乙醇洗脱，60％、80％乙醇洗脱部分可得高含量的主含芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷的提取物，60％乙醇洗脱部分芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量高于芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷含量，80％乙醇洗脱部分芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷含量高于芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量，两者的根据提取工艺及药材来源(含采收季节)不同，提取物中主要成分及其含量可有所不同，如实施例1中，65％乙醇洗脱物主要成分为芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷，其中芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量可分别达到1.0％以上，甚至3％以上，进一步硅胶柱层析(提取物：硅胶(200-300目)＝1∶20，以三氯甲烷-甲醇9∶1、8∶2、7∶3梯度洗脱，每梯度洗脱2-3BV，以每0.5BV收集流份并分别挥去溶剂)可分别得芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和化合物E、F、G、H、木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷等单体成分；实施例1中，以15％乙醇洗脱除杂，再分别以40％、60％乙醇洗脱2BV(约1BV/hr)，然后以80％乙醇洗脱，60％、80％乙醇洗脱部分可得高含量的主含芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷的提取物，60％乙醇洗脱部分芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量高于芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷含量，80％乙醇洗脱部分芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷含量高于芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量，两者的含量和均不低于50％；实施例1中的水提取醇沉浓缩液，加水稀释，缓缓通过(约1BV/hr)2倍药材量(W/W)的已处理好的AB-8大孔吸附树脂柱，水洗脱3BV(约2BV/hr)，20％乙醇洗脱4BV(约1BV/hr)，75％乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液，回收乙醇，减压浓缩，喷雾干燥，可得总黄酮含量不低于80％的提取物，芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量含量和均不低于10％，提取物经适当水解，如实施例11水解方法，得到含芹菜素不低于5％的提取物。

黄酮苷类化合物经口服后，在体内经肠道微生物区系(Walle T，et al.Quercetinglucosides are completely hydrolyzed in ileostomy patients before absorption.JNutr，2000，130：2658)或相应的肝脏生物转化酶等酶系(Doostdar H，etal.Bioflavonoids：selective substrates and inhibitors for cytochrome P450 CYP1Aand CYP1B1.Toxicology，2000，144：31；Lambert N，Kroon PA，Faulds CB，PlumbGW，McLauchlan WR，Day AJ，Williamson G.Purification of cytosolic beta-glucosidasefrom pig liver and its reactivity towards flavonoid glycosides.Biochim BiophysActa.1999 Nov 16；1435(1-2)：110-6)分别转化为相应的苷元，如芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷去糖基化后转化为苷元(Day AJ，DuPont MS，Ridley S，Rhodes M，Rhodes MJ，MorganMR，Williamson G.Deglycosylation of flavonoid and isoflavonoid glycosides byhuman small intestine and liver beta-glucosidase activity.FEBS Lett.1998 Sep25；436(1)：71-5)，所述的提取物也可以直接是黄酮的水解物，如总取物或药材粗提取物水解方法得到的水解物，水解物经精制后，可得到含芹菜素量为35％以上的提取物，水解方法可以为酸水解或酶水解，如提取物的乙醇溶液，加等体积2mol/L盐酸溶液，在N₂环境中加热水解可得芹菜素苷元；或提取物的pH5.0乙酸盐缓冲液，加入β-葡萄糖苷酶或苦杏仁酶，37℃放置，水解得到芹菜素苷元；精制方法可以为酸水解液醋酸乙酯萃取，取醋酸乙酯层，回收溶剂，即得；或水解液调节pH值1～3，过滤，取沉淀，即得，或乙醇反复精制，得芹菜素。

提取物中可含有除黄酮类以外的酚酸类化合物，主要成分为没食子酸，还可含对羟基肉桂酸、香草酸、邻苯三酚等，提取物以总酚酸含量计，含总酚酸不低于20％，没食子酸含量一般不低于2.0％。不同工艺酚酸类化合物组成成分和含量有所不同，如实施例1总酚酸主要是指黄酮类化合物，几乎不含没食子酸；如实施例3提取物中总酚酸含量达35％以上，其中没食子酸含量一般在0.8～4.2％，甚至更高，其中芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量均大于1％，优选的为含没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量分别不低于2.5％、3.0％、3.0％，进一步优选为没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量均不低于10％，三者含量之和不低于50％，如实施例3的提取物经阴离子交换树脂柱精制所得的提取物。相同工艺根据药材来源不同而含量有差异。

本发明的山香圆叶提取物的制备方法，是取新鲜或干燥的山香圆叶，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法、柱层析法等工艺中的一种或多种而制得。提取溶剂可以为水、酸水、碱水、醇水溶液、甲醇、乙醇、己烷(如环己烷、正己烷)、石油醚、三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮、乙醚、甲酸乙酯、醋酸乙酯等的一种或多种的混合或结合；萃取溶剂可以为己烷、石油醚、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醚、醋酸乙酯、丁醇(如正丁醇)、戊醇、己醇等的一种或多种的混合或组合；吸附树脂可以为苯乙烯类、丙烯酸酯类、氧化氮类吸附树脂中的一种或多种；柱层析填料可以为硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、吸附树脂、葡聚糖凝胶等。

本发明的山香圆叶提取物的制备方法，简单而言含提取精制工序，溶剂提取法为提取工序，溶剂萃取法、树脂吸附法、柱层析法为精制工序。溶剂提取如取新鲜或干燥的山香圆叶，采用水、甲醇、乙醇、丙酮等极性溶剂及其水溶液提取的方法，本发明的提取物为黄酮和/或酚酸类成分，提取溶剂可以为稀酸水或稀碱水溶液，如盐酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氨水溶液等，提取方法可以为微波、超声、回流、静置浸泡(含温浸)、渗漉等，为进一步精制工艺，提取工艺可含初步精制除杂工艺，如水提醇沉、醇提水沉、溶剂脱脂、澄清剂及明胶沉淀等工艺(参见范碧亭主编，中药药剂学，上海科学技术出版社：1997；肖崇厚主编，中药化学，上海科学技术出版社：1997)，水提取液醇沉如取山香圆叶，加水16倍煎煮提取2～3次，每次1.5小时，减压浓缩(约生药∶水＝1∶0.8～2)，浓缩液放冷，加乙醇使含醇量40％～85％，搅拌，静置，滤过，取滤液；醇提取水沉如取山香圆叶，加75％乙醇16倍煎煮提取2次，每次1.5小时，回收乙醇，减压浓缩(约生药∶水＝1∶0.8～2)，加水适量(约0.5～1倍)，搅拌，过滤，取滤液；澄清剂可以为明胶，也可以为壳聚糖，如ZTC澄清剂系列(天津正天成澄清技术有限公司)，如取山香圆叶，加水煎煮，提取液减压浓缩(约生药∶水＝1∶5)，于80℃加入药液体积2％的ZTC-II型澄清剂B组分(配制成1％浓度)，搅拌，保温30分钟，于60℃加入药液体积2％的A组分(配制成0.5％浓度)，保温30分钟，静置过夜，取上清液；由于山香圆叶含叶绿素等脂溶性杂质，而目标提取物为芹菜素和/或芹菜素为苷元的黄酮苷类成分，以及其他酚酸类成分，如没食子酸，极性相对比较大，溶剂提取可以含非极性有机溶剂提取或萃取除去杂质的工艺方法，如采用石油醚等非极性溶剂(如己烷、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醚)提取(浸渍、回流)提取药材或萃取提取液除去叶绿素等杂质，较安全、经济可行的方法如：1)取山香圆叶，用石油醚15倍量加热回流2次，取石油醚层，回收石油醚，除去叶绿素等杂质，叶挥去石油醚，继用75％乙醇(或60％丙酮)回流提取2次，合并提取液，回收溶剂，即得粗提取液；2)取山香圆叶，加水煎煮，合并水提取液，减压浓缩(约生药∶水＝1∶0.5～2)，用石油醚萃取2～4次，合并、回收石油醚，除去叶绿素等杂质，取水层。精制工序也可以其他合适的方法，如溶剂提取法得到的提取溶液(或经一定精制的粗提液)，加0.1％氢氧化钠溶液调节溶液pH至碱性，如7.5～8.5，超滤，滤液浓缩，喷雾干燥；或滤液1mol/L盐酸溶液调节pH至酸性或中性，如4.0～7.0，浓缩，喷雾干燥，或溶剂提取法的粗提取物，经适宜溶剂进一步精制除杂的工艺，如水提取醇沉工艺得到的粗提取物浸膏，以高浓度二次醇沉精制的工艺；或醇提取物，用水溶解稀释过滤除去杂质，水滤液浓缩，用高浓度二次醇沉精制的工艺等。

溶剂萃取法为精制工序一种，可以为上述溶剂提取工序的提取液或粗提取物溶液用醋酸乙酯、正丁醇萃取而得到提取物的方法，萃取的水溶液一般在酸性或偏酸性条件下能达到更好的效果，如用盐酸调节溶液pH值2～6.5，如调节pH到4.2，醋酸乙酯、正丁醇萃取液继续回收溶剂，浓缩，干燥即得(或萃取物进一步用乙醇溶解，过滤，回收乙醇，浓缩，干燥即得)；或萃取得的浓缩液，与硅藻土拌匀，加乙醇或丙酮回流提取，合并提取液，回收溶剂，浓缩，干燥即得；或萃取得的浓缩液，与活性炭粉末混匀，加乙醇，搅拌，过滤，浓缩，回收乙醇，干燥即得。

树脂吸附法为一种安全和经济的精制方法，树脂可以为离子交换树脂和非离子树脂，如上述溶剂提取法得到的粗提取物溶液或溶剂萃取法所得的提取物溶液，通过大L吸附树脂(或药液浓缩液和少量树脂吸附，混匀，加入到树脂柱中)，水洗脱除杂，低浓度的乙醇溶液(0～20％)洗脱除杂，较高浓度乙醇洗脱，分别收集洗脱液，浓缩，干燥，即得；较高浓度洗脱乙醇浓度可以为20％以上，较合适洗脱乙醇溶液浓度如40％～95％，除杂及洗脱乙醇浓度可根据不同的吸附剂有所差异，吸附树脂可以为苯乙烯类、聚丙烯酸酯类、丙烯酰胺共聚物、丙烯腈类、氧化氮类共聚物等中的一种或多种结合；如型号AB-8(南开大学化工厂)、D101(天津农药股份有限公司)、HPD100(河北沧州宝恩化工有限公司)、HPD400、HPD500、HPD600、ADS-21(天津南开和成科技有限公司)、ADS-7、ADS-F8等，吸附树脂也可以换为聚酰胺颗粒。

树脂柱精制一般分为吸附除杂洗脱等工艺步骤，上样吸附可以用粗提取浓缩液直接与少量(如占树脂总量的5％～15％)经过处理的吸附树脂混匀，低温挥去溶剂，加入已装好的树脂柱顶端即可；或溶液慢速通过树脂柱上样吸附，一般低流速为宜，如1-4BV/hr，优选1-2BV/hr，上样结束后可静置一些时间，如3小时，为达到较好的吸附效果，药液视情况还可以含盐溶液，如含3％氯化钠的药液，与药液直接上样比较，酸性药液能达到更好的吸附及富集效果，上样药液pH值一般控制2～6.5，优选pH值3～5，上样药液浓度可以为药材∶水(1∶1～12)，树脂量可以药材：树脂(1∶0.5～5)，以上样流出液刚检测到黄酮类成分为满载，一般以满载的70％-80％为宜，黄酮成分检测方法如实施例1的检测方法(检测方法曾尝试更简便的盐酸镁粉反应，但显色反应不明显)或薄层色谱法(照《中国药典》2005版一部附录VI B试验，取续流出液约25ml水浴蒸干，残渣加甲醇1～2ml使溶解，取5μl，点于用0.5％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(6∶3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视，以显明显荧光斑点为阳性)，柱径高一般为1∶3～10。除杂工艺可用纯水洗脱，也可以用低浓度的醇溶液洗脱除杂，低浓度的醇如0-20％的乙醇，对不同的树脂由于吸附性质不同而有所不同，如实施例1中用15％乙醇洗脱除杂，除杂洗脱量一般为2-4BV。洗脱精制可以为15％-95％的乙醇，也可以为甲醇、丙酮的水溶液，如60％丙酮溶液，以及碱性溶液(pH值8～13)，碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氨水等，如0.05％氢氧化钠的水溶液或稀乙醇溶液，洗脱速度如0.6-2BV/hr，洗脱量3-6BV，洗脱终点判断可对续洗脱液进行黄酮类成分如上述方法检测，以没有黄酮类成分为宜。上述工艺的吸附树脂可换为聚酰胺颗粒，或聚酰胺和硅藻土的混合颗粒。

柱层析法可得到更高含量的总黄酮和/或总酚酸提取物，柱层析填料可以为硅胶、活性炭、氧化铝、葡聚糖凝胶等。如实施例3正丁醇萃取物，通过硅胶柱层析(提取物：硅胶＝1∶15)，分别以三氯甲烷-甲醇以95∶5、9∶1、8∶2、7∶3、1∶1洗脱，分段收集洗脱液，回收各流份溶剂，分别硅胶G板薄层色谱(三氯甲烷-甲醇以95∶5、9∶1、8∶2展开，10％硫酸乙醇溶液显色)，合并相同流份柱层析法可得到更高含量的总黄酮和/或总酚酸提取物，柱层析填料可以为硅胶、活性炭、氧化铝、葡聚糖凝胶等。如实施例3正丁醇萃取物，通过硅胶柱层析(提取物：硅胶＝1∶15)，分别以三氯甲烷-甲醇以95∶5、9∶1、8∶2、7∶3、1∶1洗脱，分段收集洗脱液，回收各流份溶剂，分别硅胶G板薄层色谱(三氯甲烷-甲醇以95∶5、9∶1、8∶2展开，10％硫酸乙醇溶液显色)，合并相同流份，9∶1和8∶2洗脱的合并流份可得含没食子酸达50％以上提取物；7∶3洗脱的合并流份可得含芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷分别达5～15％以上，含总黄酮80％以上，甚至95％以上，分别继续过硅胶柱层析及sephadex LH20柱，三氯甲烷-甲醇及甲醇洗脱，可分别得到没食子酸、芹菜素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷和化合物E、F、G、H、木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷、对羟基肉桂酸、香草酸、邻苯三酚等单体成分。

精制工艺可以为上述方法的多项组合，如溶剂提取-溶剂萃取-树脂柱程序、溶剂提取树脂柱-硅胶柱层析程序、溶剂提取-树脂柱-溶剂萃取程序、溶剂提取-树脂柱-溶剂萃取-硅胶柱层析程序等，还可根据提取物性质结合溶剂、吸附剂精制的工艺，如粗提取物用乙醇或丙酮溶解、活性炭脱色及重结晶方法；调节pH法，如粗提取物用0.05％氢氧化钠溶液(或其稀醇溶液)溶解，滤过，1mol/L稀盐酸调节pH至5，滤过，浓缩，干燥，得精制提取物。具体的提取精制方法根据具体提取物药物用途的作用形式而不同，如对于一般口服固体制剂，提取物总黄酮含量一般大于50％，对于注射剂制剂，总黄酮含量要求90％以上，如结合上述溶剂提取、溶剂萃取、树脂吸附、柱层析法可得到总黄酮含量93％以上的提取物，单个流份可得到没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素等单体成分。

本发明的山香圆叶提取物以鲜叶提取物药理效果更好，除来源于锐尖山香圆Turpiniaarguta(Lindl.)Seem.叶外，可以为其茎、根及根茎部位，还可来源于山香圆属的其他种，包括锐尖山香圆(原变种)Turpinia arguta(Lindl.)Seem.var.arguta、长柄亮叶山香圆Turpinia simplicifolia Merr.var.longipes C.Y.Wu、粗壮山香圆Turpiniarobusta Craib、大果山香圆Turpinia pomifera(Roxb.)DC.、大果山香圆(原变种)Turpinia pomifera(Roxb.)DC.var.pomifera、大籽山香圆Turpinia macrosperma C.C.Huang、光山香圆Turpinia montana(Bl.)Kurz var.glaberrima(Merr.)T.Z.Hsu、亮叶山香圆Turpinia simplicifolia Merr.、亮叶山香圆(原变种)Turpiniasimplicifolia Merr.var.simplicifolia、卵叶山香圆Turpinia ovalifolia Elmer、绒毛锐尖山香圆Turpinia arguta(Lindl.)Seem.var.pubescens T.Z.Hsu、三叶山香圆Turpinia ternata Nakai、山麻风树Turpinia pomifera(Roxb.)DC.var.minorC.C.Huang、山香圆Turpinia montana(Bl.)Kurz、山香圆(原变种)Turpiniamontana(Bl.)Kurz var.montana、疏脉山香圆Turpinia indochinensis Merr.、台湾山香圆Turpinia formosana Nakai、狭叶山香圆Turpinia montana(Bl.)Kurz var.stenophylla(Merr.et Perry)T.Z.Hsu、心叶山香圆Turpinia subsessilifolia C.Y.Wu、硬毛山香圆Turpinia affinis Merr.et Perry、越南山香圆Turpiniacochinchinensis(Lour.)Merr.等(肖培根.药用植物形态、化学成分与疗效之间的相关性，药学学报.1978，13：1-5；陈四保，彭勇，陈世林，肖培根.中药资源可持续利用-药用植物亲缘学，世界科学技术-中医药现代化，2005(6)：97-103)。本发明的提取物制备方法也可以为超临界流体萃取法。

取本发明实施例1、实施例3、实施例19、实施例20的提取物，分别进行体外抑菌试验，二甲苯诱导的小鼠耳肿胀抑制试验，小鼠醋酸扭体抑制试验和角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀抑制试验，结果表明本发明的提取物具有显著的抗炎、镇痛作用，且鲜叶提取物药理作用更优。

体外抑菌试验：取上述实施例提取物，采用试管法和平板法测定，表明其对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单孢菌、唾液链球菌、化脓性链球菌、溶血葡萄球菌等均有明显抑制作用，MIC范围折算成生药为0.062g～0.250g生药/ml，抑菌作用效果为：实施例20＞实施例3＞实施例19＞实施例1。

对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀抑制试验：取上述实施例提取物试验，昆明种小鼠130只，随机分组，每组10只。灌胃给药，连续3天，每天1次，提取物分4g·kg^-1、8g·kg^-1、16g·kg^-1(均折算成生药计)三个即低、中、高剂量组，灌胃生理盐水为空白对照组，于末次给药1小时在小鼠右耳廓涂二甲苯0.05ml，2小时后将小鼠脱颈处死，沿耳基线剪下左右两耳，用直径9mm打孔器在左右耳廓相同部位打孔取材，称重，以左右耳重量差值作为肿胀度，结果表明实施例1、实施例19、实施例21、实施例22提取物的中、低剂量和实施例3、实施例20提取物的低剂量均能显著抑制二甲苯致小鼠耳肿胀(p＜0.05)，实施例1、实施例19、实施例21、实施例22提取物的高剂量和实施例3、实施例20提取物的中、高剂量均能非常显著抑制二甲苯致小鼠耳肿胀(p＜0.01)，药理作用效果为：实施例20＞实施例3＞实施例19＞实施例1＞。

小鼠醋酸扭体抑制试验：取上述实施例提取物试验，昆明种小鼠130只，随机分组，每组10只。灌胃给药，连续3天，每天1次，提取物分4g·kg^-1、8g·kg^-1、16g·kg^-1(均折算成生药计)三个即低、中、高剂量组，灌胃生理盐水为空白对照组，于末次给药30分钟后，各腹腔注射0.5％醋酸溶液0.2ml，并观察记录注射0.5％醋酸溶液后30分钟小鼠扭体反应次数，计算，结果表明表明实施例1、实施例19提取物的中、低剂量和实施例3、实施例20提取物的低剂量均能显著减少醋酸所致小鼠扭体次数(p＜0.05)，实施例1、实施例19提取物的高剂量和实施例3、实施例20提取物的中、高剂量均能非常显著减少醋酸所致小鼠扭体次数(p＜0.01)，药理作用效果为：实施例20＞实施例3＞实施例19＞实施例1。

对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀抑制试验：取上述实施例提取物试验，SD大鼠130只，随机分组，每组10只。灌胃给药，提取物分4g·kg^-1、8g·kg^-1、16g·kg^-1(均折算成生药计)三个即低、中、高剂量组，灌胃生理盐水为空白对照组。每鼠右后足踝关节上方划一线作为标志，用毛细管放大法测量该足爪体积(排水毫升数)，每鼠右后肢足跖部皮下注射1％角叉菜胶0.1ml致炎，致炎后0.5小时与4小时分别按上述给药剂量灌胃给药(或生理盐水)，同法测量给药后1，2，3，4，6，8h该足爪体积，以其体积的改变(给药前后排水量之差)表示炎症肿胀程度，结果表明实施例1、实施例19提取物的中、低剂量和实施例3、实施例20提取物的低剂量均能能显著抑制角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀(p＜0.05)，实施例1、实施例19提取物的高剂量和实施例3、实施例20提取物的中、高剂量均能非常显著抑制角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀(p＜0.01)，药理作用效果为：实施例20＞实施例3＞实施例19＞实施例1。

昆明种小鼠90只，体重20～22g，随机分为9组，每组10只。分别灌胃给予以实施例1、实施例3提取物的低、中、高剂量组(8、16、32g·kg^-1，均以生药量干品计)，阳性对照组给予联苯双酯滴丸150mg·kg^-1，给药容积每10g重量为0.2ml，空白组与阳性对照组给予等量的溶媒(质量分数为0.5％的CMC-Na溶液)。每日一次，连续给药5d，末次给药1.5h后，腹腔给予体积分数为0.1％CCl₄的花生油溶液(给药容积为每10g体质量0.2mL)，空白组腹腔注射给与等量的花生油，禁食16h后，眼眶取血，常规离心分离后取血清，测定血清AST、ALT。结果见表1。

表1提取物对四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤的保护作用(n＝10，x±s)

组别	剂量(g·kg-1)	ALT(μ·L-1)	AST(μ·L-1)
				空白组		57.3±24.2	93.8±27.1
CCl4组		775.3±268.4★★★	908.5±274.6★★★
				联苯双酯组	0.15	219.6±65.5***	396.9±191.6***
实施例3低剂量组	8	493.2±168.5*	572.4±230.1*
				实施例3中剂量组	16	388.3±151.2**	418.4±139.7**
实施例3高剂量组	32	185.6±73.6***	291.8±100.4***
				实施例1低剂量组	8	517.4±191.5*	594.1±203.0*
实施例1中剂量组	16	436.5±169.7**	460.6±152.3**
				实施例3高剂量组	32	249.9±78.7***	371.2±185.6***

^★★★P＜0.001，与空白组对照；^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001，与CCl₄组比较

可见阳性对照组血清中ALT、AST远远高于空白组，与空白组比较有非常显著地意义(P＜0.001)，实施例1、实施例3提取物各剂量组均能显著对抗CCl4致小鼠急性肝损伤导致的血清中ALT、AST活性升高(与阳性对照组比较P＜0.05或0.01或0.001)。

本发明的提取物主要成分为芹菜素和/或以芹菜素为苷元的黄酮苷类成分及酚酸类成分，黄酮苷类化合物在动物体内经肠道微生物区系或相应的肝脏生物转化酶等酶系分别转化为相应的苷元，芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O- 2′-β-鼠李糖基芸香糖苷及其他如上述的E、F、G、H等成分具有相同的芹菜素苷元，药理作用与芹菜素类似，但理化性质与芹菜素比较在某些方面有更有益效果，如具有更好的水溶性，有益于制剂中药物的溶出，有益于注射剂制备，芹菜素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抑制肿瘤、抗血栓抗动脉硬化、抗抑郁、神经元保护、免疫调节等多方面作用(孙斌，等.芹菜素的药理作用研究进展.中药材，2004，27(7)：531；刘婵，等.芹菜素对中枢神经作用的研究进展.国外医学神经病学神经外科学分册.2005，32(3)：264；历强，等.芹菜素抑制肿瘤作用的研究进展.陕西医学杂志，2003，32(5)：439；Patel D，Shukla S，GuptaS.Apigenin and cancer chemoprevention：progress，potential and promise(review).Int J Oncol.2007 Jan；30(1)：233-45.)；如抗艾滋病病毒作用(CritchfieldJW，Butera ST，Folks TM.Inhibition of HIV activation in latently infected cellsby flavonoid compounds.AIDS Res Hum Retroviruses.1996 Jan 1；12(1)：39-46.)；芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷具有保肝作用(Zheng QS，Sun XL，Xu B，Li G，SongM.Mechanisms of apigenin-7-glucoside as a hepatoprotective agent.Biomed EnvironSci.2005 Feb；18(1)：65-70.)；没食子酸具有抗炎、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗病毒、肝脏保护和抗乙肝病毒等的药理活性(李肖玲，等.没食子酸生物学作用的研究进展.中国药师，2004，7(10)：767)，木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷具有缓解心肌痉挛、抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化、降血脂等作用(专利公开号CN 1419912A)，木犀草素具有止咳、祛痰、消炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、降血脂和胆固醇等作用(张伟敏，张盛林钟耕，木犀草素的研究概况，2005，2：11-16；张芳芳，沈汉明，朱心强，木犀草素抗肿瘤作用的研究进展，浙江大学学报：医学版，2006，35(5)：573-8)，本发明的提取物及其医学上可接受的盐可应用于制备抗菌、抗病毒、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、肝脏保护、抗乙肝病毒、抗血栓、抗动脉硬化等药物，比如在制备治疗咽喉炎、口腔溃疡、妇科炎症、肝炎、肿瘤、病毒性感冒及心脑血管等疾病药物中的应用。

本发明的山香圆叶提取物及其医学上可接受的盐用于制备在抗菌、抗病毒、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、肝脏保护、抗乙肝病毒、抗血栓、抗动脉硬化等药物的方法，为与医学上可接受的赋形剂制成适合于临床应用的各种药物制剂，所述的与可接受的载体或赋形剂制成的各种药物制剂，以中国药典2005版一部或二部附录I制剂通则项下的剂型解释为准，如合剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、眼用制剂等，如根据芹菜素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷等的良好透皮吸收作用(Merfort I，Heilmann J，Hagedorn-Leweke U，Lippold BC.In vivo skin penetration studies ofcamomile flavones.Pharmazie.1994 Jul；49(7)：509-11；Li B，Birt DF.In vivo andin vitro percutaneous absorption of cancer preventive flavonoid apigenin indifferent vehicles in mouse skin.Pharm Res.1996 Nov；13(11)：1710-5.)而制备的透皮吸收制剂等。为提高本发明的山香圆叶提取物及其医学上可接受的盐的口服制剂的生物利用度等，除将提取物水解成苷元可增加吸收外，可以采用先进的制剂技术而本发明的山香圆叶提取物及其医学上可接受的盐用于制备在抗菌、抗病毒、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、肝脏保护、抗乙肝病毒、抗血栓、抗动脉硬化等药物的方法，为与医学上可接受的赋形剂制成适合于临床应用的各种药物制剂，所述的与可接受的载体或赋形剂制成的各种药物制剂，以中国药典2005版一部或二部附录I制剂通则项下的剂型解释为准，如合剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、眼用制剂等，如根据芹菜素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷等的良好透皮吸收作用(Merfort I，Heilmann J，Hagedorn-Leweke U，Lippold BC.In vivo skin penetration studies of camomileflavones.Pharmazie.1994 Jul；49(7)：509-11；Li B，Birt DF.In vivo and in vitropercutaneous absorption of cancer preventive flavonoid apigenin in differentvehicles in mouse skin.Pharm Res.1996 Nov；13(11)：1710-5.)而制备的透皮吸收制剂等。为提高本发明的山香圆叶提取物及其医学上可接受的盐的口服制剂的生物利用度等，除将提取物水解成苷元可增加吸收外，可以采用先进的制剂技术而可以采用先进的制剂技术而达到良好的医学效果，如包合技术、固体分散技术、微粉化、助溶剂、乳化技术等，如与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇等载体采用溶剂法或熔融法制备的固体分散体，如与聚乙二醇4000(PEG4000)以1∶0.6～6质量比熔融混合制得的固体分散物；或与磷脂形成的磷脂复合物；与β-环糊精、羟丙基-β-环糊精以质量比1∶1～16制备形成的包合物或部分包合物等，所述制剂技术方法为常规技术人员不经创造性劳动所能实现，以《药剂学》(毕殿洲，人民卫生出版社，2001年4月第四版)和《药物新剂型与新技术》(陆彬，人民卫生出版社，2005年7月第二版)具体术语和方法解释为准。

本发明的提取物及其医学上可接受的盐的质量控制方法，为总黄酮含量测定方法(参见实施例1)，总酚酸含量测定方法(参见实施例3)，以没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷及芹菜素等为指标成分的含量测定方法，本发明的提取物质量控制方法，不仅限于本发明所描述的具体控制方法，还包括所有能达到上述指定成分良好控制和测定的具体方法，如现有文献流动注射化学发光法(刘泽敏，等.流动注射化学发光法测定芹菜素，西南师范大学学报：自然科学版，2006(3)：89)、毛细管区带电泳法(王月伶，等.毛细管区带电泳法测定芹菜素木犀草素和异槲皮甙，理化检验：化学分册，2005(8)：544)、高效液相色谱法(谭兴起，等.反相高效液相色谱法测定络石藤中芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷的含量，中国中药杂志：2005，30(24)：1958；刘光田.固相萃取反相高效液相色谱法测定地钱中的芹菜素，化学与生物工程：2004(6)：51)等。

本发明提取物的指纹图谱质量控制方法，含以没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷及芹菜素、木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷等为指标成分的质量控制方法，具体如没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷及芹菜素等对照的高效液相色谱测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B；在0～70分钟，流动相A从10％～25％，流动相B从90％～75％；检测波长：269±1nm或335±1nm。或以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B；在0～30分钟，流动相A从5％～15％，流动相B从95％～85％，在30～70分钟，流动相A从15％～25％，流动相B从85％～75％；或在0～30分钟，流动相A从5％～15％，流动相B从95％～85％，在30～90分钟，流动相A从15％～25％，流动相B从85％～75％；检测波长：269±1nm或350±1nm。具体对照品制备、供试品制备和测定方法例参见实施例1、实施例3。

具体实施方式

以下实施例只是更具体地说明本发明，本发明并不仅限于以下实施例的内容。

实施例1：取山香圆叶，加水煎煮2次，第一次30倍量2小时，第二次25倍量1.5小时，合并煎煮液，减压浓缩至相对密度为1.08～1.18(80℃热测)的清膏，加乙醇至含醇量为75％，搅拌，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至1：0.8～1.6(W/V)，加水稀释至药材量的3倍(V/W)，稀盐酸调节pH值至4，缓缓通过(约1BV/hr)2倍药材量(W/W)的已处理好的AB-8大孔吸附树脂柱，水洗脱3BV(约2BV/hr)，15％乙醇洗脱3BV(约2BV/hr)，65％乙醇洗脱，收集65％乙醇洗脱液，回收乙醇，减压浓缩，喷雾干燥，得山香圆叶提取物，得率约为2.3％。

1、山香圆叶提取物总黄酮含量测定：

照紫外-可见分光光度法(中国药典2005版一部附录V A)测定。

对照品溶液的制备  精密称取105℃干燥至恒重的芦丁对照品，加70％乙醇制成每1ml含0.2mg的溶液，备用。

供试品溶液的制备精密称取山香圆叶提取物，加70％乙醇制成每1ml含0.3mg的溶液，备用。

标准曲线制备精密量取对照品溶液0、1、2、3、4、5、6ml分别置25ml量瓶中，各加水10ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加4％氢氧化钠溶液10ml，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂溶液为空白，在500nm波长处测定吸收度，以吸收度A为纵坐标，以对照品浓度为横坐标，求线性方程，结果表明在0～0.062mg/ml范围内线性关系良好。

照紫外可见分光光度法(中国药典2005版一部附录V A)测定。

对照品溶液的制备  精密称取105℃干燥至恒重的芦丁对照品，加70％乙醇制成每1ml含0.2mg的溶液，备用。

供试品溶液的制备精密称取山香圆叶提取物，加70％乙醇制成每1ml含0.3mg的溶液，备用。

标准曲线制备精密量取对照品溶液0、1、2、3、4、5、6ml分别置25ml量瓶中，各加水10ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加4％氢氧化钠溶液10ml，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂溶液为空白，在500nm波长处测定吸收度，以吸收度A为纵坐标，以对照品浓度为横坐标，求线性方程，结果表明在0～0.062mg/ml范围内线性关系良好。

样品测定精密量取供试品溶液2ml，至25ml量瓶中，照标准曲线制备项下方法，同法操作，测定吸收度，由线性回归方程计算得到总黄酮含量，本品总黄酮含量为63％。

总黄酮含量测定方法也可以用芹菜素、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷等为对照品测定，测定方法可以同上述原理的紫外-可见分光光度法，也可以不经过显色，如对照品溶液和供试品溶液在279nm或335nm直接测定吸收度，计算即得总黄酮含量。

2、HPLC测定：

照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B；按表2进行梯度洗脱，检测波长为270nm。理论板数按芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷峰计算应不低于2000，流速1ml/min，柱温：室温。

采用岛津LC-10Atvp高效液相色谱仪，紫外检测器，Hypersil ODS柱(4.0×250mm，5μm)。

表2流动相梯度洗脱分配表

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～90	10→25	90→75

对照品溶液的制备取芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷等对照品，分别加甲醇制成每1ml含25～100μg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备取山香圆叶提取物适量，同对照品溶液制备方法同法制备，得供试品溶液。

测定法精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

HPLC图谱见图2，72.532min为芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷色谱峰，64.665min为芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷色谱峰，芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量分别为5.42％、4.18％。该测定方法也可用于提取物的指纹图谱质量控制。

实施例2：同实施例1水煮醇沉工艺，得提取液，缓缓通过(约1BV/hr)2倍药材量(W/W)的已处理好的聚酰胺柱，水洗脱4BV(约2BV/hr)，95％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩，喷雾干燥，得山香圆叶提取物，得率约为3.4％。

实施例3：同实施例1水煮醇沉工艺，得提取液，稀盐酸调节pH值至4，水饱和的正丁醇萃取4次，合并萃取液，减压回收正丁醇，浓缩，喷雾干燥，即得；或正丁醇萃取浓缩液与适量硅藻土混匀，晾干，加乙醇提取2次，合并乙醇提取液，回收乙醇，减压浓缩，喷雾干燥，即得，收率约为2.6～3.6％。

1、总酚酸含量测定：

照紫外-可见分光光度法(中国药典2005版一部附录V A)测定。

对照品溶液的制备精密称取没食子酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含20μg的溶液，备用。

供试品溶液的制备取山香圆叶提取物细粉60mg，精密称定，置50ml量瓶中，加无水乙醇约40ml，超声处理15分钟，加无水乙醇至刻度，混匀，精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，备用。

标准曲线制备精密量取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，分别置25ml量瓶中，各无水乙醇至5ml，加0.3％十二烷基硫酸钠溶液2ml及0.6％三氯化铁-0.9％铁氰化钾(1∶9)混合溶液1ml，混匀，在暗处放置5分钟，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，在暗处放置20分钟，以相应试剂溶液为空白，在720nm波长处测定吸收度，以吸收度A为纵坐标，以对照品浓度为横坐标，求线性方程，结果表明在10.16～50.80μg/ml范围内线性关系良好。

样品测定精密量取供试品溶液1ml，至25ml量瓶中，照标准曲线制备项下方法，同法操作，测定吸收度，由线性回归方程计算得到总酚酸含量，本品总酚酸含量为27.8～53.08％。

2、总黄酮、没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷测定：照实施例1总黄酮测定方法，提取物总黄酮含量为43％～57％；低总黄酮提取物按实施例1 HPLC含量测定方法，以没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷为对照品，含没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷分别为2.18％、3.22％、2.37％。

HPLC图谱见图3，5.632min为没食子酸色谱峰，65.865min为芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷色谱峰，73.598min为芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷色谱峰。该测定方法也可用于提取物的指纹图谱质量控制。

实施例4：取山香圆叶，加水煎煮2次，第一次16倍量1.5小时，第二次14倍量1.5小时，合并煎煮液，减压浓缩至生药∶水＝1∶3(W/V)，于80℃加入药液体积2％的ZTC-II型澄清剂(天津正天成澄清技术有限公司)B组分(配制成1％浓度)，搅拌，保温30分钟，于60℃加入药液体积2％的A组分(配制成0.5％浓度)，保温30分钟，静置过夜，取上清液，稀盐酸调节pH值至4，缓缓通过(约2BV/hr)2倍药材量(W/W)的已处理好的HPD-600大孔吸附树脂，水洗脱3BV(约2BV/hr)，15％乙醇洗脱3BV(约2BV/hr)，75％乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液，回收乙醇，减压浓缩，喷雾干燥，得山香圆叶提取物；或澄清剂沉淀的上清液，减压浓缩，稀盐酸调节pH值至3～4，醋酸乙酯萃取4次，合并萃取液，减压回收醋酸乙酯，浓缩，喷雾干燥，即得。

实施例5：取山香圆叶，加75％乙醇回流提取2次，第一次16倍量1.5小时，第二次14倍量1.5小时，合并提取液，回收乙醇，减压浓缩，滤过，稀盐酸调节pH值至3～4，正丁醇萃取4次，合并萃取液，减压回收正丁醇，浓缩，喷雾干燥，即得；或乙醇提取液，减压浓缩至1∶1(W/V)，滤过，继续浓缩至稠膏，加少量乙醇溶解，滤过，加药材0.6倍量的ADS-21大孔吸附树脂混匀，挥去乙醇，加于已处理好的ADS-21大孔吸附树脂柱顶端，水洗脱3BV(约2BV/hr)，10％乙醇洗脱3BV(约2BV/hr)，75％乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液，回收乙醇，减压浓缩，喷雾干燥，得山香圆叶提取物。

实施例6：取山香圆叶，加石油醚回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，回收石油醚，挥去药材中石油醚，加丙酮(或乙醇)回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，减压回收溶剂，浓缩，干燥，即得；或取丙酮(或乙醇)提取物的水溶液，同实施例1或实施例5方法，同法制得山香圆叶提取物。

实施例7：取山香圆叶，粉碎，加30％乙醇或75％乙醇浸泡24hr，渗漉，收集渗漉液(约10～18倍药材量)，回收乙醇，减压浓缩至1∶1～3，滤过，滤液同实施例1或实施例5方法，同法制得山香圆叶提取物。

实施例8：取山香圆叶，粉碎，加0.04％氢氧化钠溶液浸泡24hr，渗漉，收集渗漉液，稀盐酸调节pH值至4～6，减压浓缩，加乙醇至含醇量为75％，静置24hr，取上清液，回收乙醇，浓缩，浓缩液同实施例1或实施例5方法，同法制得山香圆叶提取物。

实施例9：取山香圆叶，加水煎煮2次，第一次30倍量2小时，第二次25倍量1.5小时，合并煎煮液，减压浓缩至相对密度为1.04～1.12(80℃热测)的清膏，加乙醇至含醇量为40％，搅拌，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至1∶0.4～1.0(W/V)，加10倍量乙醇，搅拌，静置过夜，滤过，取滤液，减压回收乙醇，减压浓缩，喷雾干燥，得山香圆叶提取物。

按实施例1的总黄酮和HPLC含量测定方法，测定了不同来源批次药材所制备的5批提取物，总黄酮含量为12.5～22.6％，芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷、芹菜素含量折算以芹菜素计，为1.3～3.6％，没食子酸含量为1.8～5.8％。按实施例3总酚酸测定方法测定总酚酸含量，为18.6～32.8％。

实施例10：取山香圆叶，加稀乙醇回流提取2次，第一次25倍量1.5小时，第二次22倍量1.5小时，合并提取液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.04～1.10(80℃热测)的清膏，加水适量稀释，静置24小时，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.08～1.18(80℃热测)的清膏，加10倍量乙醇，搅拌，静置过夜，滤过，取滤液，减压回收乙醇，减压浓缩，喷雾干燥，得山香圆叶提取物。

按实施例1的总黄酮和HPLC含量测定方法，测定了不同来源批次药材所制备的5批提取物，总黄酮含量为14.4～26.7％，芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷、芹菜素含量折算以芹菜素计，为1.5～4.7％，没食子酸含量为1.5～6.6％。按实施例3总酚酸测定方法测定总酚酸含量，为16.2～28.3％。

实施例10：取山香圆叶，加稀乙醇回流提取2次，第一次25倍量1.5小时，第二次22倍量1.5小时，合并提取液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.04～1.10(80℃热测)的清膏，加水适量稀释，静置24小时，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.08～1.18(80℃热测)的清膏，加10倍量乙醇，搅拌，静置过夜，滤过，取滤液，减压回收乙醇，减压浓缩，喷雾干燥，得山香圆叶提取物。

按实施例1的总黄酮和HPLC含量测定方法，测定了不同来源批次药材所制备的5批提取物，总黄酮含量为14.4～26.7％，芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷、芹菜素含量折算以芹菜素计，为1.5～4.7％，没食子酸含量为1.5～6.6％。按实施例3总酚酸测定方法测定总酚酸含量，为16.2～28.3％。

实施例11：取实施例1～10的山香圆叶提取物，加乙醇使溶解，加等体积2mol/L盐酸溶液，在N₂环境中加热回流5小时，放冷，减压回收乙醇，过滤，取沉淀，用少量水洗涤，干燥，即得；或水解液回收乙醇，加醋酸乙酯(或正丁醇)萃取4次，合并萃取液，回收溶剂，即得，芹菜素含量可达6.04％～99.99％。

实施例12：取实施例1～10的山香圆叶提取物，加少量水溶解或混悬，加1％氢氧化钠(或氢氧化钾、氨水等)溶液，调节pH值5.0～7.5，浓缩，干燥，即得。

实施例13：取山香圆叶，加75％乙醇回流提取2次，第一次16倍量1.5小时，第二次14倍量1.5小时，合并提取液，回收乙醇，滤过，1％氢氧化钠溶液调节pH值至8，超滤，滤液用稀盐酸调节pH值至中性，减压浓缩，喷雾干燥，即得。

实施例14：取实施例3或实施例10山香圆叶提取物50g，加甲醇适量使溶解，与35g硅胶(200-300目)混合，挥去甲醇，研细，加于800g 200-300目硅胶柱上，三氯甲烷-甲醇梯度(9∶1、8∶2、7∶3、1∶1)洗脱，每梯度洗脱2BV，以0.5BV分段收集洗脱液，回收溶剂，分别薄层色谱法检视(硅胶G薄层板，以三氯甲烷-甲醇9∶1、8∶2、7∶3为展开剂，10％硫酸乙醇为显色剂)，合并相同组分，分别取适量于200g凝胶(sephadex LH20)柱反复柱层析，收集流份(10ml/流份)，得没食子酸、芹菜素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷和化合物E、F、G、H、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷等单体成分。

其中9∶1和8∶2洗脱合并段部分主含没食子酸(含量可达35％以上)；7∶3洗脱合并段部分主含芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷成分(含量和可达30～75％或更高)。

实施例15：取山香圆叶提取物150g，粉碎，加淀粉50g，乳糖50g，微粉硅胶1g，混匀，共制成1000粒胶囊，即得。

实施例16：取山香圆叶提取物150g，粉碎，备用；另取β-环糊精450g，加适量水，研磨，加入上述山香圆叶提取物，研磨，加入甘露醇100g、淀粉80g混匀，干燥，粉碎，制颗粒，加入阿司巴坦6g、硬脂酸镁2g，混匀，共压制成1000片，即得。

实施例17：取山香圆叶提取物100g，加注射用水约900ml使溶解，1％氢氧化钠溶液调节pH值至5～7.5，加入针用活性炭2g，加热，滤过，用少量注射用水洗涤活性炭，合并洗液，加注射用水至1000ml，灌装成200支，灭菌，即得。

实施例18：取山香圆叶提取物100g，甘露醇50g或右旋糖酐40 20g，加注射用水约900ml使溶解，调节pH值至5～7.5，加入针用活性炭2g，加热，滤过，用少量注射用水洗涤活性炭，合并洗液，加注射用水至1000ml，灌装成200支，冷冻干燥，即得。

实施例19：除原料山香圆叶为山香圆鲜叶外，其它制备方法(含精制工艺)、质量控制方法同实施例1，提取物的得率为2.7％(鲜叶折算成干品计)，提取物总黄酮含量为71.36％，芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量分别为6.71％和5.32％。

实施例20：除原料山香圆叶为山香圆鲜叶外，其它制备方法(含精制工艺)、质量控制方法同实施例3，提取物的得率为4.3％(鲜叶折算成干品计)，提取物总黄酮含量为60.22％，没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量分别为3.35％、3.92％和3.18％。

实施例21：取山香圆叶，同中药成方制剂WS3-B-2085-96方法，以水提醇沉法提取，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶提取物，得率为13.37％，按实施例3方法测定，提取物总黄酮含量为2.37％，总酚酸含量3.78％，没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量分别为0.45％、0.61％和0.57％。

实施例22：取山香圆叶，按文献方法(罗宪堂，陈丽华，李昶，山香圆含片的制备工艺研究，中成药，2005，25(4)：276-8)制备，用70％乙醇浸渍，渗漉，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶提取物，得率为5.76％，按实施例3方法测定，提取物总黄酮含量为5.86％，总酚酸含量7.65％，没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量分别为0.92％、1.31％和1.18％。

实施例21提取物水溶性较好，实施例22提取物难溶解于水，由于提取物含较多叶绿素等，提取物在未预混合糊精、糖粉、淀粉等稀释剂时，表现为在制备过程中难以干燥，难以粉碎。

实施例22：取山香圆叶，按文献方法(罗宪堂，陈丽华，李昶，山香圆含片的制备工艺研究，中成药，2005，25(4)：276-8)制备，用70％乙醇浸渍，渗漉，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶提取物，得率为5.76％，按实施例3方法测定，提取物总黄酮含量为5.86％，总酚酸含量7.65％，没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量分别为0.92％、1.31％和1.18％。

实施例21提取物水溶性较好，实施例22提取物难溶解于水，由于提取物含较多叶绿素等，提取物在未预混合糊精、糖粉、淀粉等稀释剂时，表现为在制备过程中难以干燥，难以粉碎。

附图说明：

图1为提取物各单体化学结构式；

图2为实施例1提取物的HPLC图谱；

图3为实施例3提取物的HPLC图谱。

Claims (10)

1. 一种山香圆叶提取物，其特征在于：含黄酮类化学成分及其医学上可接受的盐，总黄酮含量不低于15％，含芹菜素苷元及以芹菜素为苷元的黄酮苷类成分以芹菜素计，不低于1.5％，黄酮类化学成分含芹菜素、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的山香圆叶提取物，其特征在于：含总黄酮量不低于50％，芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量之和不低于6.0％或芹菜素含量不低于3.0％以上。

3. 根据权利要求1所述的山香圆叶提取物，其特征在于：含总黄酮量80％以上，芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量之和不低于10.0％或芹菜素含量不低于5.0％。

4. 根据权利要求1所述的山香圆叶提取物，其特征在于：含芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷量之和不低于50.0％。

5. 根据权利要求1所述的山香圆叶提取物，其特征在于：含除黄酮类成分外的酚酸类化合物及其医学上可接受的盐，所述的酚酸类化合物含没食子酸，总酚酸含量不低于20％，没食子酸含量不低于2.0％。

6. 根据权利要求5所述的山香圆叶提取物，其特征在于：含没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量分别不低于2.5％、3.0％、3.0％。

7. 根据权利要求5所述的山香圆叶提取物，其特征在于：没食子酸、芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷含量均不低于10％，三者含量之和不低于50％。

8. 根据权利要求1所述的山香圆叶提取物，使芹菜素-7-O-2′-β-鼠李糖基芸香糖苷。

9. 根据权利要求1所述的山香圆叶提取物，是芹菜素-7-O-β-新橙皮糖苷。

10. 根据权利要求1～9所述的山香圆叶提取物，在制备抗菌、抗病毒、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗血栓、抗动脉硬化、肝脏保护、抗乙肝病毒、抗抑郁、神经元保护及免疫调节等药物中的应用。

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