CN101862357A - 山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，该提取物通过将山香圆叶用乙醇回流提取得到，其中提取方法是：取山香圆叶，加5～15倍体积的30％～90％乙醇回流提取1～3次，每次回流提取1～3小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用25～90％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，总黄酮含量50％以上，黄酮类主要化学成分为女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素及其苷或苷元中的一种或多种，该提取物可作神经氨酸酶抑制剂用在预防和治疗流感，制成药学上可以接受的剂型。

Description

山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物及其制备方法和用途。

背景技术

目前流行性感冒病毒日益严重，并且流行性感冒病毒与呼吸道疾病及引起的全身性疾病密切相关，我国是流感高发国家之一，不但人口众多，而且生活习惯也有利于流感病毒的转播，每年人平均发病次数达到0.3～0.7次不等，重点人群达到2～4次。流感对人类存在严重威胁，尤其是新发品种流感病毒，其不但引起继发性其它微生物感染，而且会直接导致器官破坏和变态反应致人死亡。但目前并没有有效的治疗流行性感冒病毒及其疾病(流感)的方法和治疗手段，如针对临床症状进行炎症反应治疗，治标不治本。目前最常见的预防和治疗流行性感冒病毒的方法是使用流感病毒疫苗接种，非特异性抗病毒中药或西药磷酸奥司他韦(达菲)～神经氨酸酶抑制剂。然而流感病毒疫苗预防接种弊端在于接种人群有选择性，不是人人可以接种。此外，流感病毒疫苗保护率不高，保护时间也较短(3～6个月)。目前大多数非特异性抗病毒中药虽然宣称有抗病毒作用，但是并非针对流感病毒，且抗病毒作用机理不清楚。在我们以往研究的许多种治疗外感风寒，西医所认为的感冒的中药组方并没有直接抗流感病毒的作用。简单的说，不是所有的治疗感冒的中药组方都有明确的抑制流感病毒的作用。西药“磷酸奥司他韦(达菲，(3R，4R，5S)-4-乙酰胺-5-氨基-3(1-丙氧乙酯)-1-环己烯-1羧酸乙酯磷酸盐)”是神经氨酸酶抑制剂，对流感病毒进入细胞有特异性抑制作用，但是不仅价格昂贵，而且有一些患者服用后出现呕吐、恶心、失眠、头痛、腹痛、腹泻、头晕、疲劳、鼻塞、咽痛和咳嗽等副反应。达菲是在体内被位于肝脏和肠道的酯酶转化为活性代谢产物而起着抑制神经氨酸酶作用，如果患者肝脏和肠道器官功能不正常也将影响其药效。此外，肾功能不全患者也要慎用。

因此，针对性抑制流感病毒复制、抑制流感病毒神经氨酸酶水解细胞表面唾液酸，从而导致流感病毒不能与细胞表面受体结合而进入细胞内，以及减少流感病毒在细胞内的产生将是治疗流感病毒性感冒的病因。

发明内容

本发明的目的是提供一种山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，抑制流感病毒神经氨酸酶水解细胞表面唾液酸，导致流感病毒不能与细胞表面受体结合而进入细胞内，从而能有效的抑制流感病毒复制，更重要地是克服药物的副反应弊端。

本发明的另一目的是提供了一种山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物的制备方法。

本发明的另一目的是提供了山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物制备预防和治疗流感及其并发症疾病的药物的用途；

本发明的另一目的是提供了含有山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物的药物组合物。

本发明的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，通过将山香圆叶用乙醇回流提取得到，其中提取方法是：取山香圆叶，加5～15倍体积的30％～90％乙醇回流提取1～3次，每次回流提取1～3小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用25～90％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

优选的，具体的提取方法如下：取山香圆叶，加5～13倍体积的40％～85％乙醇回流提取2～3次，每次回流提取1～2.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用30～85％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

更优选的，具体的提取方法如下：具体的提取方法如下：取山香圆叶，加5～11倍体积的50％～80％乙醇回流提取2～3次，每次回流提取1～2小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用35～80％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

更优选的，具体的提取方法如下：取山香圆叶，加5～10倍体积的55％～75％乙醇回流提取2～3次，每次回流提取1～1.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用40～75％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

更优选的，具体的提取方法如下：取山香圆叶，每次用6～9倍体积的60～75％乙醇作为提取溶剂，回流提取2次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用45～70％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

优选的，具体的提取方法如下：取山香圆叶，每次用7倍体积的65％乙醇作为提取溶剂，回流提取2次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用50～65％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

更优选的，具体的提取方法如下：取山香圆叶，每次用8倍体积的70％乙醇作为提取溶剂，回流提取2次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用55％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

更优选的，具体的提取方法如下：取山香圆叶，每次用8倍体积的70％乙醇作为提取溶剂，回流提取2次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用15％的乙醇洗脱除去杂质，再用55％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

优选的，所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其中总黄酮含量50％以上。

优选的，所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其中还包含黄酮类化学成分及其医学上可以接受的酚酸类成分，黄酮类化学成分含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素及其苷或苷元中的一种或多种。

优选的，所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其中含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷分别达4.5％、1.2％、2.5％以上。

优选的，所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其中含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷总量达23％以上。

本发明还提供了山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物用于制备预防和治疗流感及其并发症疾病的药物的用途，用于抑制流感病毒、流感病毒FM1、抑制神经氨酸酶，并发症是指肾功能衰竭，其并发症是指脾损伤或/和肺损伤。

本发明还提供了一种山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物制剂，该制剂以所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物为主要活性成分。

本发明的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物能够提取出有效的抑制神经氨酸酶成分，山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物随着使用剂量大小变化，其抑制神经氨酸酶活性的能力，即神经氨酸酶抑制率的高低也相应发生变化，并且成正相关，山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物能够通过抑制流感病毒表面神经氨酸酶，进而抑制流感病毒进入细胞里面、抑制已经进入细胞里面的流感病毒复制、增殖，从而减少了流感病毒对细胞的感染、生长，以及预防和治疗流感及其并发症。

具体实施方式

本发明的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其是通过将山香圆叶加乙醇提取得到的，具体的提取方法如下：取山香圆叶，加5～15倍体积的30％～90％乙醇回流提取1～3次，每次回流提取1～3小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用25～90％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

优选的，所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其中总黄酮含量50％以上。

优选的，所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其中还包含黄酮类化学成分及其医学上可以接受的酚酸类成分，黄酮类化学成分含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素及其苷或苷元中的一种或多种。

优选的，所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其中含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷分别达4.5％、1.2％、2.5％以上。

优选的，所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其中含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷总量达23％以上。

实施例1

制备方法：取山香圆叶，用5倍体积的90％乙醇作为提取溶剂，回流提取1次，3小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用10％的乙醇洗脱除去杂质，再用7倍量柱体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其中总黄酮含量51.6％，含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷分别达15％、5％、4％。

实施例2

制备方法：取山香圆叶，每次用14倍体积的45％乙醇作为提取溶剂，回流提取1次，2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用15％的乙醇洗脱除去杂质，再用6倍量柱体积的50％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其中总黄酮含量55.1％，含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷分别达8％、12％、5％。

实施例3

制备方法：取山香圆叶，每次用12倍体积的50％乙醇作为提取溶剂，回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用18％的乙醇洗脱除去杂质，再用5倍量柱体积的55％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，总黄酮含量59.6％，含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷分别达11％、7％、9％。

实施例4

制备方法：取山香圆叶，每次用11倍体积的60％乙醇作为提取溶剂，回流提取2次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％的乙醇洗脱除去杂质，再用5.5倍量柱体积的60％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，总黄酮含量63.5％，含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷分别达10％、8％、5％。

实施例5

制备方法：取山香圆叶，每次用10倍体积的65％乙醇作为提取溶剂，回流提取2次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％的乙醇洗脱除去杂质，再用6倍量柱体积的60％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，总黄酮含量66.8％，含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷分别达7％、10％、7％。

实施例6

制备方法：取山香圆叶，每次用9倍体积的70％乙醇作为提取溶剂，回流提取2次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％的乙醇洗脱除去杂质，再用6倍量柱体积的60％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，总黄酮含量74.9％，含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷分别达17％、3％、4％。

实施例7

制备方法：取山香圆叶，每次用8倍体积的70％乙醇作为提取溶剂，回流提取3次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用18％的乙醇洗脱除去杂质，再用7倍量柱体积的45％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，总黄酮含量80.3％，含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷分别达12％、2％、3％。

实施例8

制备方法：取山香圆叶，每次用7倍体积的75％乙醇作为提取溶剂，回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用19％的乙醇洗脱除去杂质，再用5倍量柱体积的60％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，总黄酮含量66.6％，含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷分别达6％、5％、10％。

实施例9

制备方法：取山香圆叶，每次用6倍体积的80％乙醇作为提取溶剂，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用17％的乙醇洗脱除去杂质，再用6倍量柱体积的65％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，总黄酮含量58.1％，含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷分别达10％、7％、11％。

实施例10

制备方法：取山香圆叶，每次用5倍体积的85％乙醇作为提取溶剂，回流提取3次，每次2.5小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用15％的乙醇洗脱除去杂质，再用4倍量柱体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，总黄酮含量53.0％，含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷分别达13％、8％、15％。

实验数据1、提取工艺优化研究

山香圆叶主要含黄酮类、有机酸等化合物，黄酮类化合物以乙醇提取效果较佳，因此，我们以乙醇浓度(A)、加乙醇量(B)、提取次数(C)、提取时间(D)四项作为考察因素，每一因素设三个水平，按L9(3⁴)正交表进行正交实验设计(表1、表2)对提取工艺进行优化研究，考察指标为总黄酮提取率。

表1因素水平表

取山香圆叶药材27份，每组平均三份，共九组，按表1L9(3⁴)正交试验表设计试验。

结果见表2。

表2L9(3⁴)正交试验表

方差分析

将正交试验结果进行方差分析，结果见表3。

表3以总黄酮提取率为指标的方差分析

^＊F_{1-0.05(2，2)}＝19.0    ^＊＊F_1-0.01(2，2)＝99.0

结论：直观分析可知，提取次数(C)及加乙醇量(B)对提取效果影响较大，乙醇浓度(A)及提取时间(D)对提取效果影响较小。表3方差分析结果进一步验证了直观分析结论，即因素C、B依次对提取效果有较大影响。根据生产实际情况，结合K值分析，确定提取条件为：取山香圆叶，加10倍量70％乙醇提3次，每次提取2小时，即得。

实验数据2、山香圆叶总黄酮的的纯化研究

山香圆叶药材用乙醇提取后提出大量非黄酮类化合物，必须对醇提液进行进一步纯化处理，以提高黄酮类有效成分的含量，提取液中杂质多为无机盐、糖类、果胶及蛋白质类、酯类、色素类等，而山香圆叶中的活性成分为黄酮类化合物，因此，我们采大孔吸附树脂进行纯化研究。

1)上样量考察

取山香圆叶药材适量提取，提取液上D-101大孔树脂(500ml)，前500ml收集一瓶，后面每150ml收集一瓶，进行黄酮定性鉴别，至2000ml始有黄酮阳性反应。上样量为2000ml时(相当于生药的质量为50g)，尚未检出黄酮，故初步确定每1000ml大孔树脂上样100g药材的提取液，即树脂体积∶生药质量为10∶1。

2)洗脱浓度的考察

取山香圆叶药材提取液100ml(相当于生药材100g)，上样于1000ml D101树脂。依次用水、15％、25％、35％、45％、55％乙醇洗脱，对15％、25％、35％、45％、55％乙醇洗脱液进行含量测定，部分洗脱液蒸干计算得膏率，结果见表4。

表4洗脱浓度的考察

注：-表示HPLC未检出黄酮类成分。

从表4可以看出黄酮苷用乙醇洗脱的最佳浓度在30％～50％，且有效成分不会漏洗。此外15％乙醇和45％乙醇洗脱部分总黄酮量都较低，而15％乙醇除去的杂质较多，因此，15％乙醇就可以用作杂质的洗脱溶剂，而30％～50％乙醇则可以作为黄酮的解吸附剂，这样可以提高总黄酮苷在有效部位中的含量，达到分离纯化的目的。

3)洗脱体积的考察

取山香圆叶药材100g提取，提取液回收乙醇后上样于1000ml树脂，水洗4000ml，15％乙醇洗6000ml，50％乙醇洗6000ml。结果见表5。

表5洗脱体积的考察

“-”表示未检出黄酮类成分；“+”表示检出黄酮类成分。

从定性检查结果可以看出用，15％乙醇洗脱去除了大量非黄酮类成分，会有少量有效成分流失，同时在洗脱3500ml以后，洗脱液颜色较淡(即杂质的洗脱能力下降)，故15％乙醇部分洗脱体积确定为3500ml(即每1ml树脂用3.5ml 15％乙醇洗脱)。50％乙醇洗脱时在第5000ml时，有效成分已洗脱完全，所以用50％乙醇4000ml洗脱(即1ml树脂用4.5ml 45％乙醇洗脱)。

实验数据3：山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物对神经氨酸酶活性的抑制作用

取实施例5制备方法所获得的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，加适量水使溶解，应用神经氨酸酶抑制剂鉴定试剂盒测定山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物抑制神经氨酸酶(N1)的效价见表6。

(1).标准曲线准备：a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70μl神经氨酸酶检测缓冲液；b.每孔再分别加入0、1、2、5、7.5、10μl H5N1神经氨酸酶；c.每孔再加入0～20μl Milli-Q水。

(2).样品检测的准备：a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70μl神经氨酸酶检测缓冲液；b.每孔再加入10μl H5N1神经氨酸酶；c.每孔再加入0～10μl山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物样品；d.每孔再加入0～10μl Milli-Q水。

(3).检测步骤：

a.振动混匀约1min；

b.37℃孵育2min使抑制剂和H5N1神经氨酸酶充分相互作用，做标准曲线的样品也一起孵育；

c.每孔加入10μl神经氨酸酶荧光底物；

d.再振动混匀约1min；

e.37℃孵育20～30min后进行荧光测定。激发波长为360nm，发射波长为440nm。

(4).根据标准曲线计算出样品对于H5N1神经氨酸酶的抑制百分比，以及做浓度曲线后计算出山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物对于H5N1神经氨酸酶的IC50。山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物达到对神经氨酸酶的抑制率IC50为2.92mg/ml，见表6。

表6.山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物抑制神经氨酸酶的活性

根据上述实验结果可以清楚地看到：

(1).山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物能够提取出有效的抑制神经氨酸酶成分；

(2).山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物随着使用剂量大小变化，其抑制神经氨酸酶活性的能力，即神经氨酸酶抑制率的高低也相应发生变化，并且成正相关；

(3).由上述实验可见，山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物能够通过抑制流感病毒表面神经氨酸酶，进而抑制流感病毒进入细胞里面、抑制已经进入细胞里面的流感病毒复制、增殖，从而减少了流感病毒对细胞的感染、生长，以及预防和治疗流感及其并发症。

医学和药学研究人员无法预先在不做抑制流感病毒感染、复制，或抑制神经氨酸酶的实验的前提下，预先得知山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物具有预防和治疗流感病毒性感冒的良好效果。

实验数据4：山香圆总黄酮回流提取物对FM1流感病毒的影响

取山香圆总黄酮回流提取物，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)(H1N1)鉴定山香圆总黄酮回流提取物抑制FM1流感病毒毒力的能力。(1).FM1对狗肾传代细胞(MDCK)的毒力测定采用细胞半数感染量(TCID50)微量法。(2).山香圆总黄酮回流提取物对MDCK细胞的毒性测定采用无血清的DMEM对山香圆总黄酮回流提取物作系列稀释后接种于已形成单层的MDCK细胞孔中，每孔100μl，每个稀释度重复4个孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃、5％CO₂培养箱内培养，每日观察细胞病变(CPE)，连续观察3天，以“+～++++”记录结果，按Reed-Muench法计算药物半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)。(3).山香圆总黄酮回流提取物抑制FM1流感病毒作用测定：MDCK细胞5×10⁵/ml，每孔100μl，分别于96孔板中，37℃、5％CO2培养箱内培养，次日吸去孔中培养液，加入100TCID50流感病毒液，每孔100μl，37℃吸附1h后吸去上清液。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，以药物的TD0为第1孔，再用无血清的DMEM液对山香圆总黄酮回流提取物作系列稀释，分别加入上述已感染病毒的细胞中，同时设病毒对照和正常对照组，37℃、5％CO₂温箱内培养，每日观察流感病毒产生的MDCK细胞病变特征，即单层细胞变性变圆等，连续3天，计算出药物的50％抑制病变浓度(IC50)及治疗指数(TI)。TI的计算：TI＝TD50/IC50，TI值越大，表明药物的安全范围越大。以Kruskal-Walis和Mann-Whitney检验法比较试验组与病毒对照组细胞病变的差异，对药物剂量和对病毒感染细胞避免发生细胞病变(CPE)的抑制率进行相关性分析，判断是否存在量效反应关系。

(1).FM1流感病毒对MDCK细胞的毒力经Reed-Muench法计算，其TCID50为10^-4.81。(2).山香圆总黄酮回流提取物MDCK细胞的TD0分别为841.1mg±25.08mg/100ml。(3).将山香圆总黄酮回流提取物作系列稀释后，对100TCID50流感病毒进行抑制试验，计算药物的半数有效量IC50及TI值大小，结果见表7。

表7.山香圆总黄酮回流提取物对FM1流感病毒的IC50(mg/100ml)及TI(x±s)

由表7可知，山香圆总黄酮回流提取物抑制FM1流感病毒致细胞病变的作用均随着药物剂量的增加而增强。对药物剂量和药物对CPE的抑制率进行的相关性分析表明，山香圆总黄酮回流提取物的剂量与药物对CPE抑制率之间呈明显的正相关。

实验数据5：山香圆总黄酮回流提取物对流感病毒感染鸡胚的抑制作用

取山香圆总黄酮回流提取物，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)(H1N1)鉴定山香圆总黄酮回流提取物抑制FM1流感病毒在鸡胚中复制和抑制的能力。(1).将FM1流感病毒液接种于10天龄无特定病原体鸡胚尿囊腔内，每胚0.2ml，37℃孵育72h，观察并计算半数鸡胚感染量(EID50)。(2).山香圆总黄酮回流提取物对鸡胚的毒性作用采用，用无菌生理盐水对山香圆总黄酮回流提取物作系列稀释后接种于10天龄无特定病原体鸡胚尿囊腔内，每胚0.2ml，每个浓度接种6胚，37℃孵育，观察鸡胚生长发育情况，以鸡胚可存活96h的最大浓度作为药物的TD。(3).山香圆总黄酮回流提取物在鸡胚中对流感病毒的抑制作用采用，0.1ml的流感病毒液和不同稀释度的山香圆总黄酮回流提取物混合，37℃作用2h，接种于10天龄无特定病原体鸡胚尿囊腔，每组接种6胚，37℃孵育72h。病毒攻击量为50EID50，同时设病毒对照、无菌生理盐水正常对照，计算山香圆总黄酮回流提取物对病毒抑制作用的半数有效剂量(ED50)。

(1).FM1流感病毒对鸡胚的毒力经Reed-Muench法计算，其EID50为10^-5.07。

(2).山香圆总黄酮回流提取物接种于鸡胚后，其生长发育与正常对照组基本一致。96h鸡胚均存活。鸡胚给予山香圆总黄酮回流提取物原液未见鸡胚死亡，所以可认为TD0为7.6g/100ml。(3).山香圆总黄酮回流提取物在鸡胚中对流感病毒的抑制作用见表8。

表8.山香圆总黄酮回流提取物对流感病毒感染鸡胚的抑制作用

与病毒对照组比较：*P＜0.05

由表8可知，山香圆总黄酮回流提取物在11.25～90.0mg/ml对流感病毒有显著的抑制作用(P＜0.05)，ED50为9.31mg±0.46mg/ml，TI为47.29±3.48。

实验数据6：山香圆总黄酮回流提取物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的影响

取山香圆总黄酮回流提取物，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)(H1N1)鉴定山香圆总黄酮回流提取物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的死亡保护作用。(1).流感病毒FM1株病毒做10倍倍比稀释后分别接种每组10只BALB/C小鼠，雌雄各半。乙醚轻度麻醉后，每组分别给与不同稀释度的病毒，每只小鼠滴鼻接种20μl。观察10天的小鼠死亡情况，按Reed-Muench法计算LD50为10^-1.36。故确定实验所用的造模浓度为10LD50。(2).山香圆总黄酮回流提取物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的死亡保护作用：正常对照组、流感病毒FM1株病毒对照组、山香圆总黄酮回流提取物11.25mg/ml、22.5mg/ml、45.0mg/ml、90.0mg/ml剂量组等分别灌胃，灌胃容量均为0.4ml/只。3天后，除正常对照组外各组在乙醚轻度麻醉下用10LD50流感病毒FM1株滴鼻感染小鼠20μl/只。同时正常对照组给予同体积的生理盐水。给药的4组继续给药，正常对照组和流感病毒FM1株病毒对照组给生理盐水8天，剂量同上。逐日观察动物发病和记录死亡数，共观察14天，计算死亡率(死亡率＝每组死亡数/每组小鼠总数×100％)，结果见表9。(3).山香圆总黄酮回流提取物对小鼠体内感染流感病毒FM1株肺指数的影响：正常对照组、流感病毒FM1株病毒对照组、山香圆总黄酮回流提取物11.25mg/ml、22.5mg/ml、45.0mg/ml、90.0mg/ml剂量组等分别灌胃，灌胃容量均为0.4ml/只。3天后，除正常对照组外各组在乙醚轻度麻醉下用1.0LD50流感病毒FM1株滴鼻感染小鼠20μl/只。同时正常对照组给予同体积的生理盐水。给药的4组继续给药，正常对照组和流感病毒FM1株病毒对照组给生理盐水8天，剂量同上。于病毒感染后第8天处死小鼠，称体重，取肺称肺重，计算肺指数(肺指数＝肺质量/体质量×100％)；此外，取脾称脾重，计算脾指数(脾指数＝脾质量/体质量×100％)，结果见表9。

表9.山香圆总黄酮回流提取物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的死亡保护结果

注：※※P＜0.01VS流感病毒模型组        ※P＜0.05VS流感病毒模型组

表10.山香圆总黄酮回流提取物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的脾指数和肺指数的影响

注：#P＜0.05VS正常对照组    注：##P＜0.01VS正常对照组

※※p＜0.001VS流感病毒模型组    ※p＜0.05VS流感病毒模型组

(1).由表9可知，山香圆总黄酮回流提取物在22.5～90.0mg/ml对流感病毒感染小鼠有显著的保护作用(p＜0.01-p＜0.05)。

(2).由表10可知，山香圆总黄酮回流提取物在45.0mg/ml-90.0mg/ml对流感病毒感染小鼠的肺指数抑制率有显著的作用(p＜0.01-p＜0.05)。

实验数据7：山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物对慢性肾功能衰竭的影响

1)SD大鼠，200～240g，上海西普尔-必凯实验动物责任有限公司，动物合格证号：SCXK(沪)2003-0002

2)试剂及药物腺嘌呤，腺嘌呤(含量＞98％，为进口分装，中国上海，批号20010520)，实施例5制备方法所获得的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物；

3)试验方法：雄性SD大鼠，体重220g左右，先用普通饲料喂养10天正常生长后，按体重随机分为正常对照组、给药实验组和造模对照组，每组12只。给药实验组和造模对照组用腺嘌呤灌胃制作慢性肾功能衰竭(CRF)模型，以腺嘌呤320mg/(kg·d)灌胃，用蒸馏水制成混悬液约2ml/只，共20天；20天后给药，给药实验组以山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物0.36g/(kg·d)灌胃，山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物以蒸馏水制成混悬溶液(0.06g/ml)，每次约2ml/只，分次灌胃，正常对照组和造模对照组以等体积水灌胃，给药35天后将大鼠用乙醚麻醉.鼠尾动脉采血观察各项指标。

4)结果：

表11.山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物对CRF大鼠肾功能的影响

注：经T检验，给药实验组与造模对照组比较“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01

本实验用腺瞟呤灌胃建立大鼠CRF模型后，造模对照组大鼠精神萎靡，体重明显降低，血清Bun、Ser明显升高，Hb明显下降，Ret明显升高，表明大鼠肾功能受损，经给予山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物治疗后.大鼠精神明显振作，体重逐渐恢复，提高肌酐清除率，促进代谢产物的排出，降低血清BUN、SCr浓度，肾功能和贫血明显改善，表明山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物对腺嘌呤所致大鼠肾损伤有防治作用。

根据上述实验结果可以清楚地看到：

(1).山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物能够提取出有效的防治慢性肾功能衰竭成分；

(2).山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物在具有抑制神经氨酸酶活性的作用同时，还具有防治慢性肾功能衰竭的作用，克服了达菲严对肌酐清能力差和肾功能衰竭人群的副作用，反之还有防治效果。

Claims (19)

1.一种山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，通过将山香圆叶用乙醇回流提取得到，其中提取方法是：取山香圆叶，加5～15倍体积的30％～90％乙醇回流提取1～3次，每次回流提取1～3小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用25～90％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

2.如权利要求1所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，具体的提取方法如下：取山香圆叶，加5～13倍体积的40％～85％乙醇回流提取2～3次，每次回流提取1～2.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用30～85％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

3.如权利要求2所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，具体的提取方法如下：取山香圆叶，加5～11倍体积的50％～80％乙醇回流提取2～3次，每次回流提取1～2小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用35～80％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

4.如权利要求3所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，具体的提取方法如下：取山香圆叶，加5～10倍体积的55％～75％乙醇回流提取2～3次，每次回流提取1～1.5小时，滤过；合并滤液，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用40～75％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

5.如权利要求4所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，具体的提取方法如下：取山香圆叶，每次用6～9倍体积的60～75％乙醇作为提取溶剂，回流提取2次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用45～70％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

6.如权利要求5所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，具体的提取方法如下：取山香圆叶，每次用7倍体积的65％乙醇作为提取溶剂，回流提取2次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用50～65％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

7.如权利要求5所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，具体的提取方法如下：取山香圆叶，每次用8倍体积的70％乙醇作为提取溶剂，回流提取2次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用20％以下的乙醇洗脱除去杂质，再用55％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

8.如权利要求7所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，具体的提取方法如下：取山香圆叶，每次用8倍体积的70％乙醇作为提取溶剂，回流提取2次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，水溶液用非极性大孔吸附树脂吸附，用15％的乙醇洗脱除去杂质，再用55％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物。

9.如权利要求1～8任一项所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其中总黄酮含量50％以上。

10.如权利要求1～8任一项所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其中还包含黄酮类化学成分及其医学上可以接受的酚酸类成分，黄酮类化学成分含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素及其苷或苷元中的一种或多种。

11.如权利要求1～8任一项所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其中含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷分别达4.5％、1.2％、2.5％以上。

12.权利要求9所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物，其中含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷总量达23％以上。

13.权利要求1～12任一项所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物用于制备预防和治疗流感及其并发症疾病的药物的用途。

14.权利要求13的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物的用途，其特征在于抑制流感病毒。

15.权利要求13的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物的用途，其特征在于抑制流感病毒FM1。

16.权利要求13的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物的用途，其特征在于抑制神经氨酸酶。

17.权利要求13的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物的用途，其并发症是指肾功能衰竭。

18.权利要求13的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物的用途，其并发症是指脾损伤或/和肺损伤。

19.一种山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物制剂，其特征在于，该制剂以权利要求1～12任一项所述的山香圆叶总黄酮乙醇回流提取物为主要活性成分。