CN101890038B - 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物及其制备药物用途 - Google Patents

女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物及其制备药物用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，其是通过按女贞苷80％～40％、野漆树苷5％～45％、金丝桃苷1％～40％的重量配比制成的组合物，该组合物可作神经氨酸酶抑制剂用在预防和治疗流感，制成药学上可以接受的剂型。

Description

女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物及其制备药物用途
技术领域
本发明涉及一种女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物及其制备药物用途。
背景技术
目前流行性感冒病毒日益严重，并且流行性感冒病毒与呼吸道疾病及引起的全身性疾病密切相关，我国是流感高发国家之一，不但人口众多，而且生活习惯也有利于流感病毒的转播，每年人平均发病次数达到0.3～0.7次不等，重点人群达到2～4次。流感对人类存在严重威胁，尤其是新发品种流感病毒，其不但引起继发性其它微生物感染，而且会直接导致器官破坏和变态反应致人死亡。但目前并没有有效的治疗流行性感冒病毒及其疾病(流感)的方法和治疗手段，如针对临床症状进行炎症反应治疗，治标不治本。目前最常见的预防和治疗流行性感冒病毒的方法是使用流感病毒疫苗接种，非特异性抗病毒中药或西药磷酸奥司他韦(达菲)-神经氨酸酶抑制剂。然而流感病毒疫苗预防接种弊端在于接种人群有选择性，不是人人可以接种。此外，流感病毒疫苗保护率不高，保护时间也较短(3～6个月)。目前大多数非特异性抗病毒中药虽然宣称有抗病毒作用，但是并非针对流感病毒，且抗病毒作用机理不清楚。在我们以往研究的许多种治疗外感风寒，西医所认为的感冒的中药组方并没有直接抗流感病毒的作用。简单的说，不是所有的治疗感冒的中药组方都有明确的抑制流感病毒的作用。西药“磷酸奥司他韦(达菲，(3R，4R，5S)-4-乙酰胺-5-氨基-3(1-丙氧乙酯)-1-环己烯-1羧酸乙酯磷酸盐)”是神经氨酸酶抑制剂，对流感病毒进入细胞有特异性抑制作用，但是不仅价格昂贵，而且有一些患者服用后出现呕吐、恶心、失眠、头痛、腹痛、腹泻、头晕、疲劳、鼻塞、咽痛和咳嗽等副反应。达菲是在体内被位于肝脏和肠道的酯酶转化为活性代谢产物而起着抑制神经氨酸酶作用，如果患者肝脏和肠道器官功能不正常也将影响其药效。此外，肾功能不全患者也要慎用。
传统的中医学认山香圆叶具有清热解毒，利咽消肿，活血止痛。用于乳蛾喉痹，咽喉肿痛，疮疡肿毒，跌扑伤痛。女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷是山香圆叶的主要成分之一。女贞子功能为滋补肝肾，明目乌发。主要用于眩晕耳鸣，腰膝 酸软，须发早白，目暗不明，近年来多用于治疗慢性气管炎、肝炎、高血脂症、糖尿病、更年期综合征、不孕症、动脉粥样硬化等，女贞苷是女贞子的主要成分之一。化橘红具有散寒，燥湿，利气，消痰。用于风寒咳嗽，喉痒痰多，食积伤酒，呕恶痞闷；野漆树苷是化橘红的主要成分之一。贯叶金丝桃具有舒肝解郁，清热利湿，消肿止痛。用于情志不畅，气滞郁闷，关节肿痛，小便不利。金丝桃苷是贯叶金丝桃的主要成分之一，金丝桃苷对心肌缺血再灌注，脑缺血再灌注，脑梗塞都显示良好的保护作用，还具有镇痛，抗氧化，保护心肌、肝脏作用。但并未发现山香圆叶及其所含的女贞苷、野漆树苷和金丝桃苷、女贞子及其所含的女贞苷、化橘红及其所含的野漆树苷、贯叶金丝桃及其所含的金丝桃苷具有抑制流感病毒感染、复制的作用，也未发现其具有抑制神经氨酸酶的作用。
发明内容
本发明的目的是提供女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，其可以抑制流感病毒神经氨酸酶水解细胞表面唾液酸，导致流感病毒不能与细胞表面受体结合而进入细胞内，以及减少流感病毒在细胞内的产生，从而有效地针对性地抑制流感病毒复制，更重要地是本发明提供一种女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物可以克服现有药物的副反应弊端。
本发明提供的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，所述女贞苷的分子式：C33H40O18，分子量：724.2，所述女贞苷的结构式如下：
Figure GSB00000537580400021
所述野漆树苷的分子式：C27H30O14，分子量：578.52，所述野漆树苷的结构式如下：
Figure GSB00000537580400031
所述金丝桃苷的分子式：C21H20O12，分子量：464.38，所述金丝桃苷的结构式如下：
其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷80％～40％、野漆树苷5％～45％、金丝桃苷1％～40％。
优选的，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷75％～45％、野漆树苷10％～40％、金丝桃苷5％～35％。
优选的，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷70％～50％、野漆树苷15％～35％、金丝桃苷10％～30％。
优选的，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷65％～55％、野漆树苷20％～30％、金丝桃苷15％～25％。
优选的，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷58％、野漆树苷25％、金丝桃苷17％。
另一方面，本发明还提供了女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物的提取方法，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷是从山香圆叶中提取获得的，所述提取 方法如下：取山香圆叶，加5～15倍量的30％～90％乙醇回流提取1～3次，每次回流提取1～3小时，滤过；合并滤液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱洗脱，收集洗脱部分，减压浓缩，干燥，得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷的混合总苷，经分离，分别合并女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷纯品。
优选的，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷采用如下的提取方法获得：取山香圆叶，加12倍量70％乙醇回流提取1.5小时，滤过，滤渣再加10倍量70％乙醇回流提取1.5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱洗脱，收集洗脱部分，减压浓缩，干燥。
优选的，其中水溶液通过已处理好的D101大孔树脂柱，分别用水、5％～10％乙醇、30％～55％乙醇、1％氢氧化钠溶液洗脱，收集30％～55％乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。
优选的，其中混合总苷经硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析分离，分别合并女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷、野漆树苷和金丝桃苷的纯品。
本发明还提供了女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物用于制备预防和治疗流感及其并发症疾病的药物的用途。
优选的，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物用于抑制流感病毒。
优选的，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物用于抑制流感病毒FM1。
优选的，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物用于抑制神经氨酸酶。
优选的，其并发症是指肾功能衰竭。
优选的，其并发症是指脾损伤或/和肺损伤。
本发明所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷可以是从含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷的各种药材中如山香圆叶、女贞子、化橘红、贯叶金丝桃叶中提取获得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷粗品或女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷单体化合物。
最后，本发明还提供了一种女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物制剂，该制剂以本发明上述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物为主要活性成分。
实验数据证明，本发明的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是有效的抑制神经氨酸酶成分，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物随着使用剂量大小变化， 其抑制神经氨酸酶活性的能力，即神经氨酸酶抑制率的高低也相应发生变化，并且成正相关，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物能够通过抑制流感病毒表面神经氨酸酶，进而抑制流感病毒进入细胞里面、抑制已经进入细胞里面的流感病毒复制、增殖，从而减少了流感病毒对细胞的感染、生长，以及预防和治疗流感及其并发症，还可以抑制流感病毒神经氨酸酶水解细胞表面唾液酸，导致流感病毒不能与细胞表面受体结合而进入细胞内，以及减少流感病毒在细胞内的产生，更重要地是本发明提供一种女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物可以克服现有药物的副反应弊端。
而医学和药学研究人员无法预先在不做抑制流感病毒感染、复制，或抑制神经氨酸酶的实验的前提下，预先得知女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物具有预防和治疗流感病毒性感冒的良好效果。
综上所述，本发明提供的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物及其用途带来显著的技术效果。
具体实施方式
实施例1
本发明提供的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，所述女贞苷的分子式：C33H40O18，分子量：724.2，所述女贞苷的结构式如下：
Figure GSB00000537580400051
所述野漆树苷的分子式：C27H30O14，分子量：578.52，所述野漆树苷的结构式如下：
Figure GSB00000537580400061
所述金丝桃苷的分子式：C21H20O12，分子量：464.38，所述金丝桃苷的结构式如下：
Figure GSB00000537580400062
取山香园叶1000g，加12倍量70％乙醇回流提取1.5小时，滤过，滤渣再加10倍量70％乙醇回流提取1.5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的D101大孔树脂柱，分别用水、10％乙醇、45％乙醇、1％氢氧化钠溶液洗脱，收集45％乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，得30％以上女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷的混合总苷，经硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析分离，分别合并女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷(3.5g，纯度：98.5％)、野漆树苷(1.5g，纯度：98.7％)、金丝桃苷(1g，纯度：98.2％)纯品，经分别与女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷标准品的UV、IR、ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR比较，确定了上述三个化合物的结构。
另外，本发明提供的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷也可以分别提取获得，如以下举的实施例。
实施例2
取女贞子1000g，加10倍量65％乙醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加8 倍量65％乙醇回流提取1.5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的D101大孔树脂柱，分别用水、8％乙醇、40％乙醇、1％氢氧化钠溶液洗脱，收集40％乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，得30％以上女贞苷的混合总苷，经硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析分离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷(19.2g，纯度：98.6％)纯品，经分别与女贞苷标准品的UV、IR、ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR比较，确定了女贞苷的结构。
实施例3
取化橘红1000g，加10倍量65％乙醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加8倍量65％乙醇回流提取1.5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的D101大孔树脂柱，分别用水、10％乙醇、45％乙醇、1％氢氧化钠溶液洗脱，收集45％乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，得30％以上野漆树苷的混合总苷，经硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析分离，合并野漆树苷流份，结晶，得到野漆树苷(4.6g，纯度：98.5％)纯品，经分别与野漆树苷标准品的UV、IR、ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR比较，确定了野漆树苷的结构。
实施例4
取贯叶金丝桃1000g，加12倍量70％乙醇回流提取1.5小时，滤过，滤渣再加10倍量70％乙醇回流提取1.5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的D101大孔树脂柱，分别用水、10％乙醇、45％乙醇、1％氢氧化钠溶液洗脱，收集45％乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，得30％以上金丝桃苷的混合总苷，经硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析分离，合并金丝桃苷流份，结晶，得到金丝桃苷(8.5g，纯度：98.6％)纯品，经分别与金丝桃苷标准品的UV、IR、ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR比较，确定了金丝桃苷的结构。
实施例5
将女贞苷(14g)、野漆树苷(6g)与金丝桃苷(3.6g)以7∶3∶1.8的比例混合，搅拌、研磨、混合均匀后得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物(23.6g)。
实施例6
将女贞苷(12g)、野漆树苷(8g)与金丝桃苷(4g)以3∶2∶1的比例混合，搅拌、研磨、混合均匀后得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物(24g)。
实施例7
将女贞苷(10g)、野漆树苷(10g)与金丝桃苷(6g)以5∶5∶3的比例混合，搅拌、研磨、混合均匀后得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物(26g)。
实施例8
将女贞苷(8g)、野漆树苷(12g)与金丝桃苷(8g)以2∶3∶2的比例混合，搅拌、研磨、混合均匀后得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物(28g)。
实施例9
将女贞苷(6g)、野漆树苷(14g)与金丝桃苷(10g)以3∶7∶5的比例混合，搅拌、研磨、混合均匀后得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物(30g)。
下面结合表1给出本发明女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷质量百分比的一些优选实施例，但本发明三者的组成成份的含量不局限于该表中所列数值，对于本领域的技术人员来说，完全可以在表中所列数值范围的基础上进行合理概括和推理。
表1：女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷占组合物的重量百分比(％)
Figure GSB00000537580400081
实验数据1：女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对神经氨酸酶活性的抑制作用
取实施例5制备方法所获得的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，加适量水使溶解，应用神经氨酸酶抑制剂鉴定试剂盒测定女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物抑制神经氨酸酶(N1)的效价见表2。
(1).标准曲线准备：a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70μl神经氨酸酶检测缓冲液；b.每孔再分别加入0、1、2、5、7.5、10μl H5N1神经氨酸酶；c.每孔再加入0～20μl Milli-Q水。
(2).样品检测的准备：a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70μl神经氨酸酶检测缓冲液；b.每孔再加入10μl H5N1神经氨酸酶；c.每孔再加入0～10μl女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物样品；d.每孔再加入0～10μl Milli-Q水。
(3).检测步骤：
a.振动混匀约1min；
b.37℃孵育2min使抑制剂和H5N1神经氨酸酶充分相互作用，做标准曲线的样品也一起孵育；
c.每孔加入10μl神经氨酸酶荧光底物；
d.再振动混匀约1min；
e.37℃孵育20～30min后进行荧光测定。激发波长为360nm，发射波长为440nm。
(4).根据标准曲线计算出样品对于H5N1神经氨酸酶的抑制百分比，以及做浓度曲线后计算出女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对于H5N1神经氨酸酶的IC50。女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物达到对神经氨酸酶的抑制率IC50为0.13g/L。见表2。
表2.女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物抑制神经氨酸酶的活性
Figure GSB00000537580400101
根据上述实验结果可以清楚地看到：
(1).女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物能够提取出有效的抑制神经氨酸酶成分；
(2).女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物随着使用剂量大小变化，其抑制神经氨酸酶活性的能力，即神经氨酸酶抑制率的高低也相应发生变化，并且成正相关；
(3).由上述实验可见，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物能够通过抑制流感病毒表面神经氨酸酶，进而抑制流感病毒进入细胞里面、抑制已经进入细胞里面的流感病毒复制、增殖，从而减少了流感病毒对细胞的感染、生长，以及预防和治疗流感及其并发症。
医学和药学研究人员无法预先在不做抑制流感病毒感染、复制，或抑制神经氨酸酶的实验的前提下，预先得知女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物具有预防和治疗流感病毒性感冒的良好效果。
实验数据2：女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对流感病毒感染鸡胚的抑制作用
取实施例5制备方法所获得的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)(H1N1)鉴定女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物抑制FM1流感病毒在鸡胚中复制和抑制的能力。(1).将FM1流感病毒液接种于10d龄无特定病原体鸡胚尿囊腔内，每胚0.2ml，37℃孵育72h，观察并计算半数鸡胚感染量(EID50)。(2).女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对鸡胚的毒性作用采用，无菌生理盐水对女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物作系列稀释后接种于10d龄无特定病原体鸡胚尿囊腔内，每胚0.2ml，每个浓度接种6胚，37℃孵育，观察鸡胚生长发育情况，以鸡胚可存活96h的最大浓度作为药物的TD。(3).女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物在鸡胚中对流感病毒的抑制作用采用，0.1ml的流感病毒液和不同稀释度的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物混合， 37℃作用2h，接种于10d龄无特定病原体鸡胚尿囊腔，每组接种6胚，37℃孵育72h。病毒攻击量为50EID50，同时设病毒对照、无菌生理盐水正常对照，计算女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对病毒抑制作用的半数有效剂量(ED50)。
(1).FM1流感病毒对鸡胚的毒力经Reed-Muench法计算，其EID50为10-5.07。
(2).女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物接种于鸡胚后，其生长发育与正常对照组基本一致。96h鸡胚均存活。鸡胚给予女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物原液未见鸡胚死亡，所以可认为TD0为2.0g/L。(3).女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物在鸡胚中对流感病毒的抑制作用见表3。
表3.女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对流感病毒感染鸡胚的抑制作用
Figure GSB00000537580400111
与病毒对照组比较：*P＜0.05
由表3可知，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物在0.125～1.0g/L对流感病毒有显著的抑制作用(P＜0.05)，ED50为0.16g±0.007g/L，TI为43.75±3.28。
实验数据3：女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对FM1流感病毒影响
取实施例5制备方法所获得的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)(H1N1)鉴定女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物抑制FM1流感病毒毒力的能力。(1).FM1对狗肾传代细胞(MDCK)的毒力测定采用细胞半数感染量(TCID50)微量法。(2).女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对MDCK细胞的毒性测定采用无血清的DMEM对女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物作系列稀释后接种于已形成单层的MDCK细胞孔中，每孔100μl， 每个稀释度重复4个孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃、5％CO2培养箱内培养，每日观察细胞病变(CPE)，连续观察3d，以“+～++++”记录结果，按Reed-Muench法计算药物半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)。(3).女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物抑制FM1流感病毒作用测定：MDCK细胞5×105/ml，每孔100μl，分别于96孔板中，37℃、5％CO2培养箱内培养，次日吸去孔中培养液，加入100TCID50流感病毒液，每孔100μl，37℃吸附1h后吸去上清液。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，以药物的TD0为第1孔，再用无血清的DMEM液对女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物作系列稀释，分别加入上述已感染病毒的细胞中，同时设病毒对照和正常对照组，37℃、5％CO2温箱内培养，每日观察流感病毒产生的MDCK细胞病变特征，即单层细胞变性变圆等，连续3d，计算出药物的50％抑制病变浓度(IC50)及治疗指数(TI)。TI的计算：TI＝TD50/IC50，TI值越大，表明药物的安全范围越大。以Kruskal-Walis和Mann-Whitney检验法比较试验组与病毒对照组细胞病变的差异，对药物剂量和对病毒感染细胞避免发生细胞病变(CPE)的抑制率进行相关性分析，判断是否存在量效反应关系。
(1).FM1流感病毒对MDCK细胞的毒力经Reed-Muench法计算，其TCID50为10-4.81。(2).女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物MDCK细胞的TD0分别为0.89g±0.037g/L。(3).将女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物作系列稀释后，对100TCID50流感病毒进行抑制试验，计算药物的半数有效量IC50及TI值大小，结果见表4。
表4.女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对FM1流感病毒的IC50(g/L)及TI(x±s)
Figure GSB00000537580400121
由表4可知，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物的IC50低，TI高。女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物抑制FM1流感病毒致细胞病变的作用均随着药物剂量的增加而增强。对药物剂量和药物对CPE的抑制率进行的相关性分析表明，女贞 苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物的剂量与药物对CPE抑制率之间呈明显的正相关。
实验数据4：女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的脾指数和肺指数的影响
取实施例5制备方法所获得的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)(H1N1)鉴定女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的死亡保护作用。(1).流感病毒FM1株病毒做10倍倍比稀释后分别接种每组10只BALB/C小鼠，雌雄各半。乙醚轻度麻醉后，每组分别给与不同稀释度的病毒，每只小鼠滴鼻接种20μl。观察10d的小鼠死亡情况，按Reed-Muench法计算LD50为10-1.36。故确定实验所用的造模浓度为10LD50。(2).女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的死亡保护作用：正常对照组、流感病毒FM1株病毒对照组、女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物0.125g/L、0.25g/L、0.5g/L、1.0g/L剂量组等分别灌胃，灌胃容量均为0.4ml/只。3d后，除正常对照组外各组在乙醚轻度麻醉下用10LD50流感病毒FM1株滴鼻感染小鼠20μl/只。同时正常对照组给予同体积的生理盐水。给药的4组继续给药，正常对照组和流感病毒FM1株病毒对照组给生理盐水8天，剂量同上。逐日观察动物发病和记录死亡数，共观察14天，计算死亡率(死亡率＝每组死亡数/每组小鼠总数×100％)，结果见表5。(3).女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒FM1株肺指数的影响：正常对照组、流感病毒FM1株病毒对照组、女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物0.125g/L、0.25g/L、0.5g/L、1.0g/L剂量组等分别灌胃，灌胃容量均为0.4ml/只。3天后，除正常对照组外各组在乙醚轻度麻醉下用1.0LD50流感病毒FM1株滴鼻感染小鼠20μl/只。同时正常对照组给予同体积的生理盐水。给药的4组继续给药，正常对照组和流感病毒FM1株病毒对照组给生理盐水8天，剂量同上。于病毒感染后第8天处死小鼠，称体重，取肺称肺重，计算肺指数(肺指数＝肺质量/体质量×100％)；此外，取脾称脾重，计算脾指数(脾指数＝脾质量/体质量×100％)，结果见表6。
表5.女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的死亡保护结果
Figure GSB00000537580400141
注：※※P＜0.01VS流感病毒模型组   ※P＜0.05VS流感病毒模型组
表6.女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒FM1株的脾指数和肺指数的影响
注：#P＜0.05VS正常对照组     注：※※p＜0.001  VS流感病毒模型组  ※p＜0.05VS流感病毒模型组
(1).由表5可知，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物在0.25～1.0g/L对流感病毒感染小鼠有显著的保护作用(p＜0.01)。
(2).由表6可知，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物在0.5～1.0g/L对流感病毒感染小鼠的肺指数抑制率有显著的作用(p＜0.01)。
实验数据5：女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对肾功能损伤的影响
1)SD大鼠，200～240g，上海西普尔-必凯实验动物责任有限公司，动物合格证号：SCXK(沪)2003-0002
2)试剂及药物腺嘌呤，腺嘌呤，(含量＞98％，为进口分装，中国上海，批号20010520)，实施例3制备方法所获得的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物；
3)试验方法：雄性SD大鼠，体重220g左右，先用普通饲料喂养10天正常生长后，按体重随机分为正常对照组、给药实验组和造模对照组，每组13～15只。给药实验组和造模对照组用腺嘌呤灌胃制作慢性肾功能衰竭(CRF)模型，以腺嘌呤320mg/(kg·d)灌胃，用蒸馏水制成混悬液约2ml/只，共20天；20天后给药，给药实验组以女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物2.5g/(kg·d)灌胃，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物以蒸馏水制成混悬溶液(0.625g/ml)，每次约2ml/只，分次灌胃，正常对照组和造模对照组以等体积水灌胃，给药35天后将大鼠用乙醚麻醉，鼠尾动脉采血观察各项指标。
4)结果：
表7.女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对CRF大鼠肾功能的影响
Figure GSB00000537580400151
注：经T检验，给药女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物与造模对照组和正常对照组比较“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01
本实验用腺瞟呤灌胃建立大鼠CRF模型后，造模对照组大鼠精神萎靡，体重明显降低，血清Bun、Ser明显升高，Hb明显下降，Ret明显升高，表明大鼠肾功能受损，经给予女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物治疗后与正常对照组差异不显著，而与模型组比较差异十分显著，故女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对对肾脏无毒性作用。

Claims (16)

1.女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，所述女贞苷的分子式：C33H40O18，分子量：724.2，所述女贞苷的结构式如下：
Figure FSB00000537580300011
所述野漆树苷的分子式：C27H30O14，分子量：578.52，所述野漆树苷的结构式如下：
Figure FSB00000537580300012
所述金丝桃苷的分子式：C21H20O12，分子量：464.38，所述金丝桃苷的结构式如下：
Figure FSB00000537580300013
其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷80％～40％、野漆树苷5％～45％、金丝桃苷1％～40％。
2.根据权利要求1所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷75％～45％、野漆树苷10％～40％、金丝桃苷5％～35％。
3.根据权利要求2所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷70％～50％、野漆树苷15％～35％、金丝桃苷10％～30％。
4.根据权利要求3所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷65％～55％、野漆树苷20％～30％、金丝桃苷15％～25％。
5.根据权利要求4所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷58％、野漆树苷25％、金丝桃苷17％。
6.权利要求1、2、3、4或5所述的组合物用于制备预防和治疗流感及其并发症疾病的药物的用途。
7.如权利要求6的用途，其特征在于所述的组合物用于抑制流感病毒。
8.如权利要求7的用途，其特征在于所述的组合物用于抑制流感病毒FM1。
9.权利要求6的用途，其特征在于所述的组合物用于抑制神经氨酸酶。
10.权利要求6的用途，其并发症是指肾功能衰竭。
11.权利要求6的用途，其并发症是指脾损伤或/和肺损伤。
12.一种女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物制剂，其中该制剂以权利要求1～5任一项所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物为主要活性成分。
13.权利要求1、2、3、4或5所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物的提取方法，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷是从山香圆叶中提取获得的，所述提取方法如下：取山香圆叶，加5～15倍量的30％～90％乙醇回流提取1～3次，每次回流提取1～3小时，滤过；合并滤液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱洗脱，收集洗脱部分，减压浓缩，干燥，得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷的混合总苷，经分离，分别合并女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷纯品。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷采用如下的提取方法获得：取山香圆叶，加12倍量70％乙醇回流提取1.5小时，滤过，滤渣再加10倍量70％乙醇回流提取1.5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱洗脱，收集洗脱部分，减压浓缩，干燥。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中水溶液通过已处理好的大孔树脂柱，分别用水、5％～10％乙醇、30％～55％乙醇、1％氢氧化钠溶液洗脱，收集30％～55％乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。
16.如权利要求13或14所述的方法，其中混合总苷经硅胶柱层析、SephadexLH-20柱层析分离，分别合并女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷、野漆树苷和金丝桃苷的纯品。
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