WO2012022223A1

WO2012022223A1 - 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物及其制备药物用途

Info

Publication number: WO2012022223A1
Application number: PCT/CN2011/078016
Authority: WO
Inventors: 唐春山; 谢宁; 杨小玲; 吕武清; 李志勇; 叶劲英; 刘地发; 程帆
Original assignee: 江西山香药业有限公司; 江西青峰药物研究有限公司
Priority date: 2010-08-16
Filing date: 2011-08-04
Publication date: 2012-02-23
Also published as: US9084807B2; CN101890038B; CN101890038A; EP2606898B1; US20130131000A1; EP2606898A4; EP2606898A1

Description

说明书

女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物及其制备药物用途技术领域

本发明涉及一种女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物及其制备药物用途。背景技术

目前流行性感冒病毒日益严重，并且流行性感冒病毒与呼吸道疾病及引起的全身性疾病密切相关，我国是流感高发国家之一，不但人口众多，而且生活习惯也有利于流感病毒的转播，每年人平均发病次数达到 0.3~0.7次不等，重点人群达到 2~4次。流感对人类存在严重威胁，尤其是新发品种流感病毒，其不但引起继发性其它微生物感染，而且会直接导致器官破坏和变态反应致人死亡。但目前并没有有效的治疗流行性感冒病毒及其疾病（流感）的方法和治疗手段，如针对临床症状进行炎症反应治疗，治标不治本。目前最常见的预防和治疗流行性感冒病毒的方法是使用流感病毒疫苗接种，非特异性抗病毒中药或西药磷酸奥司他韦 (达菲) -神经氨酸酶抑制剂。然而流感病毒疫苗预防接种弊端在于接种人群有选择性，不是人人可以接种。此外，流感病毒疫苗保护率不高，保护时间也较短（3~6 个月）。目前大多数非特异性抗病毒中药虽然宣称有抗病毒作用，但是并非针对流感病毒，且抗病毒作用机理不清楚。在我们以往研究的许多种治疗外感风寒，西医所认为的感冒的中药组方并没有直接抗流感病毒的作用。简单的说，不是所有的治疗感冒的中药组方都有明确的抑制流感病毒的作用。西药"磷酸奥司他韦 (达菲，（3R， 4R， 5S ) - 4 - 乙酰胺—5 - 氨基 - 3 ( 1-丙氧乙酯） - 1 - 环己烯 - 1 羧酸乙酯磷酸盐)"是神经氨酸酶抑制剂，对流感病毒进入细胞有特异性抑制作用，但是不仅价格昂贵，而且有一些患者服用后出现呕吐、恶心、失眠、头痛、腹痛、腹泻、头晕、疲劳、鼻塞、咽痛和咳嗽等副反应。达菲是在体内被位于肝脏和肠道的酯酶转化为活性代谢产物而起着抑制神经氨酸酶作用，如果患者肝脏和肠道器官功能不正常也将影响其药效。此外，肾功能不全患者也要慎用。

传统的中医学认山香圆叶具有清热解毒，利咽消肿，活血止痛。用于乳蛾喉痹，咽喉肿痛，疮疡肿毒，跌扑伤痛。女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷是山香圆叶的主要成分之一。女贞子功能为滋补肝肾，明目乌发。主要用于眩晕耳鸣，腰膝酸软，须发早白，目暗不明，近年来多用于治疗慢性气管炎、肝炎、高血脂症、糖尿病、更年期综合征、不孕症、动脉粥样硬化等，女贞苷是女贞子的主要成分之一。化橘红具有散寒，燥湿，利气，消痰。用于风寒咳嗽，喉痒痰多，食积伤酒，呕恶痞闷；野漆树苷是化橘红的主要成分之一。贯叶金丝桃具有舒肝解郁，清热利湿，消肿止痛。用于情志不畅，气滞郁闷，关节肿痛，小便不利。金丝桃苷是贯叶金丝桃的主要成分之一，金丝桃苷对心肌缺血再灌注，脑缺血再灌注，脑梗塞都显示良好的保护作用，还具有镇痛，抗氧化，保护心肌、肝脏作用。但并未发现山香圆叶及其所含的女贞苷、野漆树苷和金丝桃苷、女贞子及其所含的女贞苷、化橘红及其所含的野漆树苷、贯叶金丝桃及其所含的金丝桃苷具有抑制流感病毒感染、复制的作用，也未发现其具有抑制神经氨酸酶的作用。发明内容

本发明的目的是提供女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，其可以抑制流感病毒神经氨酸酶水解细胞表面唾液酸，导致流感病毒不能与细胞表面受体结合而进入细胞内，以及减少流感病毒在细胞内的产生，从而有效地针对性地抑制流感病毒复制，更重要地是本发明提供一种女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物可以克服现有药物的副反应弊端。

本发明提供的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，所述女贞苷的分子式: C₃₃H_4Q0₁₈，分子量 : 724.2，：

所述野漆树苷的分子式： C₂₇H₃o0_{14 >}分子量: 578.52,所述野漆树苷的结构式如下:

所述金丝桃苷的分子式: C₂₁H₂₀O₁₂.分子量: 464.38,所述金丝桃苷的结构式如下:

其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷 80%~40%、野漆树苷 5%~45%、金丝桃苷 1%~40%。

优选的，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷 75%~45%、野漆树苷 10%~40%、金丝桃苷 5%~35%。

优选的，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷 70%~50%、野漆树苷 15%~35%、金丝桃苷 10%~30%。

优选的，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷 65%~55%、野漆树苷 20%~30%、金丝桃苷 15%~25%。

优选的，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷 58%、野漆树苷 25%、金丝桃苷 17%。

另一方面，本发明还提供了女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物的提取方法，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷是从山香圆叶中提取获得的，所述提取方法如下：取山香圆叶，加 5~15倍量的 30%~90%乙醇回流提取 1~3次，每次回流提取 1~3小时，滤过；合并滤液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱洗脱，收集洗脱部分，减压浓縮，干燥，得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷的混合总苷，经分离，分别合并女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷纯品。

优选的，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷采用如下的提取方法获得: 取山香圆叶，加 12倍量 70%乙醇回流提取 1.5小时，滤过，滤渣再加 10倍量 70% 乙醇回流提取 1.5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱洗脱，收集洗脱部分，减压浓縮，干燥。

优选的，其中水溶液通过已处理好的 D101大孔树脂柱，分别用水、 5 ~10 乙醇、 30%~55%乙醇、 1%氢氧化钠溶液洗脱，收集 30%~55%乙醇洗脱部分，减压浓縮，干燥。

优选的，其中混合总苷经硅胶柱层析、 Sephadex LH-20柱层析分离，分别合并女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷、野漆树苷和金丝桃苷的纯品。

本发明还提供了女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物用于制备预防和治疗流感及其并发症疾病的药物的用途。

优选的，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物用于抑制流感病毒。

优选的，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物用于抑制流感病毒 FM1。优选的，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物用于抑制神经氨酸酶。

优选的，其并发症是指肾功能衰竭。

优选的，其并发症是指脾损伤或 /和肺损伤。

本发明所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷可以是从含女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷的各种药材中如山香圆叶、女贞子、化橘红、贯叶金丝桃叶中提取获得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷粗品或女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷单体化合物。

最后，本发明还提供了一种女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物制剂，该制剂以本发明上述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物为主要活性成分。

实验数据证明，本发明的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是有效的抑制神经氨酸酶成分，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物随着使用剂量大小变化，其抑制神经氨酸酶活性的能力，即神经氨酸酶抑制率的高低也相应发生变化，并且成正相关，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物能够通过抑制流感病毒表面神经氨酸酶，进而抑制流感病毒进入细胞里面、抑制已经进入细胞里面的流感病毒复制、增殖，从而减少了流感病毒对细胞的感染、生长，以及预防和治疗流感及其并发症，还可以抑制流感病毒神经氨酸酶水解细胞表面唾液酸，导致流感病毒不能与细胞表面受体结合而进入细胞内，以及减少流感病毒在细胞内的产生，更重要地是本发明提供一种女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物可以克服现有药物的副反应弊端。

而医学和药学研究人员无法预先在不做抑制流感病毒感染、复制，或抑制神经氨酸酶的实验的前提下，预先得知女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物具有预防和治疗流感病毒性感冒的良好效果。

综上所述，本发明提供的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物及其用途带来显著的技术效果。具体实fc^:

实施例 1

本发明提供的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，所述女贞苷的分子式:

C₃₃H_4Q0₁₈，分子量 : 724.2，所述女贞苷的结构式如下：

所述野漆树苷的分子式： C₂₇H_3Q0₁₄，分子量: 578.52,所述野漆树苷的结构式如下:

所述金丝桃苷的分子式: C₂₁H₂₀O₁₂,分子量: 464.38,所述金丝桃苷的结构式如下:

取山香园叶 1000g，加 12倍量 70%乙醇回流提取 1.5小时，滤过，滤渣再加 10倍量 70%乙醇回流提取 1.5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的 D101大孔树脂柱，分别用水、 10%乙醇、 45%乙醇、 1%氢氧化钠溶液洗脱，收集 45%乙醇洗脱部分，减压浓縮，干燥，得 30%以上女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷的混合总苷，经硅胶柱层析、 Sephadex LH-20柱层析分离，分别合并女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷（3.5g，纯度： 98.5% )、野漆树苷（1.5g，纯度： 98.7% )、金丝桃苷（lg，纯度： 98.2% ) 纯品，经分别与女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷标准品的 UV、 IR、 ESI-MS、 1H-NMR、 13C-NMR比较，确定了上述三个化合物的结构。

另外，本发明提供的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷也可以分别提取获得，如以下举的实施例。

实施例 2线取女贞子 1000g，力 B 10倍量 65%乙醇回流提取 2小时，滤过，滤渣再加 8 倍量 65%乙醇回流提取 1.5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的 D101 大孔树脂柱，分别用水、 8%乙醇、 40%乙醇、 1%氢氧化钠溶液洗脱，收集 40%乙醇洗脱部分，减压浓縮，干燥，得 30%以上女贞苷的混合总苷，经硅胶柱层析、 Sephadex LH-20柱层析分离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷（19.2g，纯度： 98.6% ) 纯品，经分别与女贞苷标准品的 UV、 IR、 ESI-MS、 1H-NMR ¹³C-NMR比较，确定了女贞苷的结构。实施例 3线

取化橘红 1000g，加 10倍量 65%乙醇回流提取 2小时，滤过，滤渣再加 8 倍量 65%乙醇回流提取 1.5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的 D101大孔树脂柱，分别用水、 10%乙醇、 45%乙醇、 1%氢氧化钠溶液洗脱，收集 45%乙醇洗脱部分，减压浓縮，干燥，得 30%以上野漆树苷的混合总苷，经硅胶柱层析、 Sephadex LH-20柱层析分离，合并野漆树苷流份，结晶，得到野漆树苷（4.6g，纯度： 98.5% )纯品，经分别与野漆树苷标准品的 UV、 IR、 ESI-MS、 1H-NMR、 ¹³C-NMR比较，确定了野漆树苷的结构。实施例 4线

取贯叶金丝桃 1000g，加 12倍量 70%乙醇回流提取 1.5小时，滤过，滤渣再加 10倍量 70%乙醇回流提取 1.5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的 D101大孔树脂柱，分别用水、 10%乙醇、 45%乙醇、 1%氢氧化钠溶液洗脱，收集 45%乙醇洗脱部分，减压浓縮，干燥，得 30%以上金丝桃苷的混合总苷，经硅胶柱层析、 Sephadex LH-20柱层析分离，合并金丝桃苷流份，结晶，得到金丝桃苷（8.5g，纯度： 98.6% ) 纯品，经分别与金丝桃苷标准品的 UV、 IR、 ESI-MS、 1H-NMR、 ¹³C-NMR比较，确定了金丝桃苷的结构。实施例 5线

将女贞苷（14g) 、野漆树苷（6g) 与金丝桃苷（3.6g) 以 7： 3 :1.8的比例混合，搅拌、研磨、混合均匀后得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物（23.6g) 。实施例 6通

将女贞苷（12g)、野漆树苷（8g)与金丝桃苷（4g) 以 3： 2： 1的比例混合，搅拌、研磨、混合均匀后得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物（24g) 。实施例 7通

将女贞苷（10g) 、野漆树苷（10g) 与金丝桃苷（6g) 以 5 ： 5 ： 3的比例混合，搅拌、研磨、混合均匀后得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物（26g) 。实施例 8通

将女贞苷（8g) 、野漆树苷（12g) 与金丝桃苷（8g) 以 2 ： 3 ： 2的比例混合，搅拌、研磨、混合均匀后得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物（28g) 。实施例 9通

将女贞苷（6g) 、野漆树苷（14g) 与金丝桃苷（10g) 以 3 ： 7 ： 5的比例混合，搅拌、研磨、混合均匀后得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物（30g) 。

下面结合表 1给出本发明女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷质量百分比的一些优选实施例，但本发明三者的组成成份的含量不局限于该表中所列数值，对于本领域的技术人员来说，完全可以在表中所列数值范围的基础上进行合理概括和推理。

表 1 : 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷占组合物的重量百分比（％) 女贞苷占组合物的重野漆树苷占组合物的金丝桃苷占组合物的

百分比重量百分比重量百分比

80 15 5 75 10 15 70 20 10 65 34 1 58 25 17 55 5 40

50 35 15 45 45 10 40 40 20 实验数据 1 : 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对神经氨酸酶活性的抑制作用取实施例 5制备方法所获得的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，加适量水使溶解，应用神经氨酸酶抑制剂鉴定试剂盒测定女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物抑制神经氨酸酶（N1 ) 的效价见表 2。

(1) . 标准曲线准备： a.在 96孔荧光酶标板内每孔加入 70μ1神经氨酸酶检测缓冲液； b.每孔再分别加入 0、 1、 2、 5、 7.5、 10μ1 Η5Ν1神经氨酸酶； c.每孔再加入 0~20μ1 Mim 。

(2) .样品检测的准备： a.在 96孔荧光酶标板内每孔加入 70μ1神经氨酸酶检测缓冲液； b.每孔再加入 10μ1 Η5Ν1神经氨酸酶； c.每孔再加入 0~10μ1女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物样品； d.每孔再加入 0~l(^l Milli-Q水。

(³) .检测步骤：

a. 振动混匀约 lmin;

b. 37°C孵育 2min使抑制剂和 H5N1神经氨酸酶充分相互作用，做标准曲线的样品也一起孵育；

c 每孔加入 ΙΟμΙ神经氨酸酶荧光底物；

d. 再振动混匀约 lmin;

e. 37°C孵育 20~30min后进行荧光测定。激发波长为 360nm，发射波长为 440nm。

(4) .根据标准曲线计算出样品对于 H5N1神经氨酸酶的抑制百分比，以及做浓度曲线后计算出女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对于 H5N1神经氨酸酶的 IC50。女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物达到对神经氨酸酶的抑制率 IC50 为 0.13g/L。见表 2。表 2. 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物抑制神经氨酸酶的活性化合物检测靶酶靶酶底物化合物浓度酶抑制率（效价)

神经氨酸 ¹³g^/L 80.9%

苷女野

si 、神经氨酸 _{η ι} ，_τ

酶荧光底 ⁱ³g^/L 50.0%

酶 (N1 )

物 0.013g/L 32.4% 根据上述实验结果可以清楚地看到：

(1) .通女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物能够提取出有效的抑制神经氨酸酶成分;

(2) .通女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物随着使用剂量大小变化，其抑制神经氨酸酶活性的能力，即神经氨酸酶抑制率的高低也相应发生变化，并且成正相关；

(3) .通上述实验可见，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物能够通过抑制流感病毒表面神经氨酸酶，进而抑制流感病毒进入细胞里面、抑制已经进入细胞里面的流感病毒复制、增殖，从而减少了流感病毒对细胞的感染、生长，以及预防和治疗流感及其并发症。

医学和药学研究人员无法预先在不做抑制流感病毒感染、复制，或抑制神经氨酸酶的实验的前提下，预先得知女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物具有预防和治疗流感病毒性感冒的良好效果。实验数据 2: 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对流感病毒感染鸡胚的抑制作用

取实施例 5制备方法所获得的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株（ FM1) (H1N1)鉴定女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物抑制 FM1流感病毒在鸡胚中复制和抑制的能力。（1).将 FM1流感病毒液接种于 10d龄无特定病原体鸡胚尿囊腔内，每胚 0.2ml， 37°C孵育 72h，观察并计算半数鸡胚感染量 (EID50)。 (2). 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对鸡胚的毒性作用采用，无菌生理盐水对女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物作系列稀释后接种于 10d龄无特定病原体鸡胚尿囊腔内，每胚 0.2ml，每个浓度接种 6胚， 37°C 孵育，观察鸡胚生长发育情况，以鸡胚可存活 96h的最大浓度作为药物的 TD。 (3). 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物在鸡胚中对流感病毒的抑制作用采用， 0.1ml的流感病毒液和不同稀释度的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物混合， 37°C作用 2h ，接种于 lOd龄无特定病原体鸡胚尿囊腔，每组接种 6胚， 37°C孵育 72h。病毒攻击量为 50EID50, 同时设病毒对照、无菌生理盐水正常对照，计算女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对病毒抑制作用的半数有效剂量 ( ED50) 。

(1). FM1流感病毒对鸡胚的毒力经 Reed - Muench法计算，其 EID50为 10—^{5 ()7}。 (2). 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物接种于鸡胚后，其生长发育与正常对照组基本一致。 96h鸡胚均存活。鸡胚给予女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物原液未见鸡胚死亡，所以可认为 TD0为 2.0g/L。（3). 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物在鸡胚中对流感病毒的抑制作用见表 3。

表 3. 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对流感病毒感染鸡胚的抑制作用

药物浓度

化合物有病毒感染 /例无病毒感染 /例感染率（％)

(g/L)

1.0 0 8 0.0* 女贞苷、野

0.5 0 8 0.0* 漆树苷、金

0.25 0 8 0.0* 丝桃苷组合

0.125 5 3 62.5* 物

0.0625 8 0 100.0 病毒对照组 0.0 8 0 100.0 正常对照组 0.0 0 8 0.0 与病毒对照组比较： * P < 0.05

由表 3可知，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物在 0.125~1.0g/L对流感病毒有显著的抑制作用（P < 0.05)， ED_5Q为 0.16g±0.007g/L， TI为 43.75±3.28。实验数据 3: 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对 FM1流感病毒影响

取实施例 5制备方法所获得的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株（ FM1) (H1N1)鉴定女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物抑制 FM1流感病毒毒力的能力。（1). FM1对狗肾传代细胞（MDCK) 的毒力测定采用细胞半数感染量（TCID50)微量法。（2). 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对 MDCK细胞的毒性测定采用无血清的 DMEM对女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物作系列稀释后接种于已形成单层的 MDCK细胞孔中，每孔 100μ1，每个稀释度重复 4个孔，同时设正常细胞对照。将培养板置 37°C、 5%C0₂培养箱内培养，每日观察细胞病变 (CPE)，连续观察 3d，以" + 〜 + + + + "记录结果，按 Reed - Muench法计算药物半数中毒浓度（ TD50) 和最大无毒浓度（ TD0)。（3). 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物抑制 FM1流感病毒作用测定： MDCK细胞 5xl0⁵/ml, 每孔 ΙΟΟμΙ, 分别于 96孔板中， 37°C、 5% C02培养箱内培养，次日吸去孔中培养液，加入 100 TCID50流感病毒液，每孔 100μ1， 37°C吸附 lh后吸去上清液。用磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗 2次，以药物的 TD0为第 1孔，再用无血清的 DMEM液对女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物作系列稀释，分别加入上述已感染病毒的细胞中，同时设病毒对照和正常对照组， 37°C、 5%C0₂温箱内培养，每日观察流感病毒产生的 MDCK细胞病变特征，即单层细胞变性变圆等，连续 3d，计算出药物的 50%抑制病变浓度（IC50)及治疗指数（TI)。 ΤΙ的计算: ΤΙ = TD50 / IC50, ΤΙ值越大，表明药物的安全范围越大。以 Kmskal - Walis和 Mann - Whitney检验法比较试验组与病毒对照组细胞病变的差异，对药物剂量和对病毒感染细胞避免发生细胞病变 (CPE) 的抑制率进行相关性分析，判断是否存在量效反应关系。

(1). FM1流感病毒对 MDCK细胞的毒力经 Reed - Muench法计算，其 TCID50 为 10—^{4 81}。 (2). 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物 MDCK细胞的 TD0分别为 0.89g±0.037g/L。（3). 将女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物作系列稀释后，对 100 TCID50流感病毒进行抑制试验，计算药物的半数有效量 IC50及 TI值大小，结果见表 4。

表 4. 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对 FM1流感病毒的 IC_5Q(g/L)及 TI(x±s) 流感病毒 IC₅₀

化合物靶病毒病毒靶细胞流感病毒 TI g^L)

女贞苷、野漆树

苷、金丝桃苷组 FM 流感株 MDCK 0.31±0.009 23.36±3.42 合物

由表 4可知，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物的 IC50低， TI高。女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物抑制 FM1流感病毒致细胞病变的作用均随着药物剂量的增加而增强。对药物剂量和药物对 CPE的抑制率进行的相关性分析表明，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物的剂量与药物对 CPE抑制率之间呈明显的正相关。实验数据 4: 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒 FM1 株的脾指数和肺指数的影响

取实施例 5制备方法所获得的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株（ FM1) (H1N1)鉴定女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒 FM1株的死亡保护作用。（1). 流感病毒 FM1株病毒做 10倍倍比稀释后分别接种每组 10只 BALB/C小鼠，雌雄各半。乙醚轻度麻醉后，每组分别给与不同稀释度的病毒，每只小鼠滴鼻接种 20μ1。观察 10d的小鼠死亡情况，按 Reed-Muench法计算 LD50为 10—^{1 36}。故确定实验所用的造模浓度为 10 LD50。（2). 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒 FM1株的死亡保护作用：正常对照组、流感病毒 FM1株病毒对照组、女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物 0.125g/L、 0.25g/L、 0.5g/L、 1.0g/L剂量组等分别灌胃，灌胃容量均为 0.4ml/只。 3d后，除正常对照组外各组在乙醚轻度麻醉下用 10 LD50 流感病毒 FM1株滴鼻感染小鼠 20μ1/只。同时正常对照组给予同体积的生理盐水。给药的 4组继续给药，正常对照组和流感病毒 FM1株病毒对照组给生理盐水 8天，剂量同上。逐日观察动物发病和记录死亡数，共观察 14天，计算死亡率（死亡率 =每组死亡数 /每组小鼠总数 xl00%)，结果见表 5。 (3). 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒 FM1株肺指数的影响：正常对照组、流感病毒 FM1株病毒对照组、女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物 0.125g/L、 0.25g/L、 0.5g/L、 1.0g/L剂量组等分别灌胃，灌胃容量均为 0.4ml/只。 3天后，除正常对照组外各组在乙醚轻度麻醉下用 1.0 LD50 流感病毒 FM1株滴鼻感染小鼠 20μ1/只。同时正常对照组给予同体积的生理盐水。给药的 4组继续给药，正常对照组和流感病毒 FM1株病毒对照组给生理盐水 8天，剂量同上。于病毒感染后第 8天处死小鼠，称体重，取肺称肺重，计算肺指数 (肺指数=肺质量 /体质量 xl00%) ; 此外，取脾称脾重，计算脾指数 (脾指数=脾质量 /体质量 l00 ), 结果见表 6。表 5. 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒 FM1株的死亡保护结果动物数攻毒剂量观察天数死亡数量死亡率平均死亡组别

(只） (LD₅₀) (天） (只） ( % ) 天数（天）正常对照组 10 - 14 0 0

流感病毒模型组 10 10 14 9 90 4.9 女贞苷、野漆树

苷、金丝桃苷组

合物

1.0g/L组 10 10 14 0 0

0.5g/L组 10 10 14 2 7.4

0.25g/L组 10 10 14 7 ₇₀« 6.6

0.125g/L组 10 10 14 9 90 5.7 注： ※※？。.。 VS 流感病毒模型组 ※P<0.05 VS 流感病毒模型组表 6. 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒 FM1株的脾指数和肺指数的影响

动物数攻毒剂量观察天肺指数抑制组别脾指数肺指数

量（只）（LD_5Q) 数（天）率 ( % ) 正常对照组 0.35士 0.04 0.97士 0.105 17.8 流感病毒模型组 1 0.45士 0.13* 1.18±0.103 ^#

女贞苷、野漆树

苷、金丝桃苷组合

物

1.0g/L组 0.34士 0.08 0.97士 0.153

0.5g/L组 0.35士 0.06 1.07士0.064 9.3^¾ 0.25g/L组 0.36士 0.03 1.11士 0.091 5.9

0.125g/L组 0.36士 0.17 1.14±0.332^ 3.4 注： # P<0.05 VS 正常对照组 ※※ p<0.001 VS流感病毒模型组 ※ p<0.05 VS 流感病毒模型组

(1) .ft表 5可知，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物在 0.25~1.0g/L对流感病毒感染小鼠有显著的保护作用（p <0.01)。

(2) .¾E¾表 6可知，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物在 0.5~1.0g/L对流感病毒感染小鼠的肺指数抑制率有显著的作用（p <0.01)。实验数据 5: 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对肾功能损伤的影响

1 ) SD大鼠， 200~240g，上海西普尔-必凯实验动物责任有限公司，动物合格证号： SCXK (沪) 2003-0002 2 ) 试剂及药物腺嘌呤，腺嘌呤，（含量〉98%，为进口分装，中国上海，批号 20010520) ，实施例 3制备方法所获得的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物；

3) 试验方法：雄性 SD大鼠，体重 220g左右，先用普通伺料喂养 10 天正常生长后，按体重随机分为正常对照组、给药实验组和造模对照组，每组 13~15只。给药实验组和造模对照组用腺嘌呤灌胃制作慢性肾功能衰竭 (CRF)模型，以腺嘌呤 320mg/(kg_d)灌胃，用蒸馏水制成混悬液约 2ml/只，共 20天； 20天后给药，给药实验组以女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物 2.5g/(kg.d)灌胃，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物以蒸馏水制成混悬溶液（0.625g/ml ) ，每次约 2ml/只，分次灌胃，正常对照组和造模对照组以等体积水灌胃，给药 35天后将大鼠用乙醚麻醉，鼠尾动脉采血观察各项指标。

4) 结果：

表 7. 女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对 CRF大鼠肾功能的影响

动物数 BUN SCr Hb Ret 组别

(只） (mmol/L) (μηιοΙ/L) (g/L) ( ) 正常对照组 15 7.45士 1.21 23.88士 3.60 112.47士 6.06 13.06±3.04 造模对照组 13 32.16士 3.43 84.16士 0.93* 99.58±8.09 20.58±6.19 给药实验组 14 8.90士 2.15** 25.73士 3.43** 110.88士 3.84** 13.91士 3.07** 注：经 T检验，给药女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物与造模对照组和正常对照组比较 "*" 表示 P<0.05， "**，，表示 P<0.01

本实验用腺瞟呤灌胃建立大鼠 CRF模型后，造模对照组大鼠精神萎靡，体重明显降低，血清 Bim、 Ser明显升高， Hb明显下降， Ret明显升高，表明大鼠肾功能受损，经给予女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物治疗后与正常对照组差异不显著，而与模型组比较差异十分显著，故女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对对肾脏无毒性作用。

Claims

权利要求书

女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，所述女贞苷的分子式: C₃₃H₄₀O

所述野漆树苷的分子式： C₂₇H3o0₁₄₅分子量: 578.52,所述野漆树苷的结构式如下:

2、根据权利要求 1所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷 75 ~45 野漆树苷 10%~40%、金丝桃苷 5%~35%。

3、根据权利要求 2所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷 70 ~50 野漆树苷 15%~35%、金丝桃苷 10%~30%。

4、根据权利要求 3所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷 65 ~55 野漆树苷 20%~30%、金丝桃苷 15%~25%。

5、根据权利要求 4所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷 58%、野漆树苷 25%、金丝桃苷 17%。

6、权利要求 1、 2、 3、 4或 5所述的组合物用于制备预防和治疗流感及其并发症疾病的药物的用途。

7、如权利要求 6的用途，其特征在于所述的组合物用于抑制流感病毒。

8、如权利要求 7的用途，其特征在于所述的组合物用于抑制流感病毒 FM1。

9、权利要求 6的用途，其特征在于所述的组合物用于抑制神经氨酸酶。

10、权利要求 6的用途，其并发症是指肾功能衰竭。

11、权利要求 6的用途，其并发症是指脾损伤或 /和肺损伤。

12、一种女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物制剂，其中该制剂以权利要求 1~5任一项所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物为主要活性成分。

13、权利要求 1、 2、 3、 4或 5所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物的提取方法，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷是从山香圆叶中提取获得的，所述提取方法如下：取山香圆叶，力 B 5-15倍量的 30%~90%乙醇回流提取 1~3次，每次回流提取 1~3小时，滤过；合并滤液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱洗脱，收集洗脱部分、减压浓縮，干燥，得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷的混合总苷，经分离，分别合并女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷纯品。

14、如权利要求 13所述的方法，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷采用如下的提取方法获得：取山香圆叶，加 12倍量 70%乙醇回流提取 1.5小时，滤过，滤渣再加 10倍量 70%乙醇回流提取 1.5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱洗脱，收集洗脱部分，减压浓縮，干燥。

15、如权利要求 13或 14所述的方法，其中水溶液通过已处理好的大孔树脂柱，分别用水、 5%~10%乙醇、 30%~55%乙醇、 1%氢氧化钠溶液洗脱，收集 30%~55%乙醇洗脱部分，减压浓縮，干燥。

16、如权利要求 13或 14所述的方法，其中混合总苷经硅胶柱层析、 Sephadex LH-20柱层析分离，分别合并女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷、野漆树苷和金丝桃苷的纯品。