CN104840477B

CN104840477B - 落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷的药物应用及其药物组合物

Info

Publication number: CN104840477B
Application number: CN201510187645.5A
Authority: CN
Inventors: 杨子峰; 姜志宏; 李菁; 周倍贤; 王玉涛; 李征途; 陈荣昌; 钟南山
Original assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Health; STATE KEY LABORATORY OF RESPIRATORY DISEASE; First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Health; STATE KEY LABORATORY OF RESPIRATORY DISEASE; First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2015-04-20
Filing date: 2015-04-20
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2035-04-20
Also published as: CN104840477A

Abstract

本发明涉及落叶松脂素‑4‑O‑β‑D‑葡萄糖苷在制备用于治疗或预防流感、及由流感病毒引起的相关炎症疾病的药物中的应用。落叶松脂素‑4‑O‑β‑D‑葡萄糖苷应用于临床流感病毒性疾病的治疗，具有安全有效、毒副作用小的特点。本发明还提供一种药物组合物，其活性成分包括落叶松脂素‑4‑O‑β‑D‑葡萄糖苷。本发明采用细胞病变抑制法在治疗模式下验证落叶松脂素‑4‑O‑β‑D‑葡萄糖苷对流感病毒复制的抑制作用，结果证实落叶松脂素‑4‑O‑β‑D‑葡萄糖苷在治疗模式下对流感病毒有明显抑制作用，其选择指数SI大于4，为低毒高效。

Description

落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷的药物应用及其药物组合物

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷在用于治疗或预防流感、及由流感病毒引起的炎症疾病中的应用。本发明还涉及含有该成分的用于抗流感病毒及治疗流感病毒引起的炎症疾病的药物组合物。

背景技术

流行性感冒(简称流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染，可经空气传播。虽然季节性流感具有自限性，但由于流感病毒可导致继发性的细菌感染，感染者会出现肺炎及严重的肺损伤，造成了较高的致病率和死亡率,据统计每年流感季节全球有25-50万人死于流感。现有抗流感药物M2离子通道抑制剂(金刚烷胺类药物)和神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦、扎那米韦等)都是靶向病毒粒子表面膜蛋白，靶点单一，由于流感病毒高变异性以及药物压力，这两类抗病毒药物极易出现耐药。虽然宿主感染流感病毒后激活免疫及炎症细胞，进而启动机体免疫反应以及炎症反应保护宿主，但失控的、过强的炎症反应则会攻击自身组织细胞，引起组织损伤疾病。如果抗原不能被及时清除，免疫应答时间延长，而激活效应细胞如多核白细胞、巨噬细胞等，引起大量细胞因子或炎症介质失控性释放，造成宿主自身组织结构和生理功能的广泛损害，进而引发全身炎症反应综合征(sIRs)、多器官功能障碍综合征(MODs)，甚至死亡。因此，调控由流感病毒介导的与免疫反应相关的信号通路及炎症因子的释放可抑制病毒复制及有过度免疫造成的组织损伤，这也是治疗流感的一个新选择。

传统中药板蓝根(Isatis indigotica Fort)药理研究显示板蓝根的各种成分具有抗菌、抗内毒素、抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节作用，在我国长期应用于流感的临床治疗，疗效显著。板蓝根含有多种化学成份，具有多靶点协同抗流感的治疗特点，因此可以从板蓝根中挖掘能够抑制流感病毒复制及诱导的炎症反应的抗流感药物。落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷(Lariciresinol-4-O-β-D-glucopyranoside)是从板蓝根中分离得到的天然产物，已有文献(何立巍，董伟，杨婧妍等.板蓝根抗病毒有效部位的化学成分及其活性研究.中草药，2013,44(21):2960-2964.)公开了该化合物结构，其结构式为：

但对于落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷在治疗流感方面的应用则还未有相关文献报道。

发明内容

本发明提供落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷在制备用于预防或治疗流感、及由流感病毒引起的炎症疾病的药物中的新应用。

落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷应用于临床流感病毒性疾病的治疗，具有安全有效、毒副作用小的特点。

落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷在应用于制备预防或治疗流感、及由流感病毒引起的炎症疾病的药物时，可作为单一有效成分制成抗流感病毒药物，或可将落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷作为有效成分之一制成抗流感病毒复方药物。所述流感病毒引起的炎症疾病包括由流感病毒诱导的炎症。

进一步的，上述药物可制成药学上允许的任意剂型，例如但不限于胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖浆、口服液、吸入剂、喷雾剂、乳膏、霜剂或凝胶剂等。

进一步的，所述药物按照重量百分比计，其中含有的落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷可以为1％～99％。其余可为药学上可接受的载体，以便制成所需的剂型。

上述的药学上可接受的载体包括但不限于填充剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂等。其中，填充剂具体可选择如淀粉、糊精、糖粉、预胶化淀粉、乳糖、葡萄糖、微精纤维素、碳酸钙、硫酸钙、碳酸氢钙等中的一种或多种。黏合剂具体可选择如羟丙甲纤维素、聚维酮、淀粉浆、糊精浆、胶浆、糖浆、聚乙二醇、海藻酸钠、阿拉伯胶、桃胶等中的一种或多种。崩解剂具体可选择如交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羟丙基淀粉、羧甲淀粉钠、酒石酸、柠檬酸、碳酸氢钠、碳酸钠、酸酐。润滑剂：包括滑石粉、硬脂酸镁、液体石蜡、微粉硅胶、聚乙二醇等中的一种或多种。

本发明所涉及的落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷，可以是从天然产物中提取获得的，或者也可以是通过化学合成获得的，所述天然产物例如为板蓝根等天然植物。

本发明还提供一种用于治疗或预防流感、及由流感病毒引起的炎症疾病的药物组合物，该药物组合物其活性成分包括落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷。

进一步的，在一些具体实施方式中，该药物组合物中，按重量百分比计含有1％～99％的落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷。

进一步的，该药物组合物可制成药学上允许的剂型，例如但不限于胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖浆、口服液、吸入剂、喷雾剂、乳膏、霜剂或凝胶剂等。为了制得所需剂型，本药物组合物中还可含有制成所需剂型所需的药学上可接受的载体，所述载体的用量可以是1％～99％，具体根据剂型需要而定。

在一些具体实施方式中，文中所述的药学上可接受的载体例如可为填充剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂等。其中，填充剂具体可选择如淀粉、糊精、糖粉、预胶化淀粉、乳糖、葡萄糖、微精纤维素、碳酸钙、硫酸钙、碳酸氢钙等中的一种或多种。黏合剂具体可选择如羟丙甲纤维素、聚维酮、淀粉浆、糊精浆、胶浆、糖浆、聚乙二醇、海藻酸钠、阿拉伯胶、桃胶等中的一种或多种。崩解剂具体可选择如交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羟丙基淀粉、羧甲淀粉钠、酒石酸、柠檬酸、碳酸氢钠、碳酸钠、酸酐。润滑剂：包括滑石粉、硬脂酸镁、液体石蜡、微粉硅胶、聚乙二醇等中的一种或多种。

所述药物组合物其中还可进一步含有其他药用许可药物，落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷和其他药用许可药物制成抗流感病毒复方药物。

所述流感病毒包括但不限于甲、乙型流感病毒和禽流感病毒；所述甲、乙型流感病毒和禽流感病毒包括但不限于人流感病毒H1N1亚型、H3N2亚型、禽流感病毒H6N2、H7N3、H9N2亚型以及INF B型，所述的人流感病毒H1N1亚型包括新甲型H1N1流感病毒。

本发明采用细胞病变抑制法在治疗模式下验证落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷对流感病毒复制的抑制作用，以利巴韦林为阳性对照药，观察落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷对MDCK细胞的毒性以及对流感病毒复制的抑制作用。利用MTT法测得落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷的半数有毒浓度(TC₅₀)为1mg/mL，落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷抗甲型流感病毒的半数有效浓度IC₅₀为0.05mg/mL，对照组为0.005mg/mL，证实落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷在治疗模式下对流感病毒有明显抑制作用，其选择指数SI大于4，为低毒高效。

为研究落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷对甲型流感病毒的体外抗病毒作用机制，应用稳定转染的NF-κB启动荧光素酶表达的报告质粒的HEK293细胞系进行研究，分别用20ng/ml的TNF-α和流感病毒H1N1刺激，同时给予不同剂量药物(0.4mg/ml、0.8mg/ml落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷)干预，均发现药物可抑制NF-κB介导的荧光素酶的表达，并呈剂量依赖关系。提示药物具有抑制NF-κB信号通路活化的药理活性。由于NF-κB信号通路激活与促炎因子的高表达密切相关，因此发明人使用qRT-PCR方法测定落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷对于流感病毒感染后介导的促炎因子表达的影响。流感病毒H1N1、H9N2分别感染A549细胞，同时给予不同剂量药物(0.4mg/ml、0.8mg/ml落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷)干预，结果显示甲型H1N1病毒感染的8h和16h后，药物均能够降低细胞因子IL-6、TNF-α、IL-8、IP-10、MCP-1和IFN-α的异常表达，并呈剂量依赖关系；甲型Η9Ν2病毒感染的16h后，药物能够降低IP-10和TNF-α的表达，并呈剂量依赖关系。说明落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷能够抑制流感病毒介导的炎症因子的表达。通过研究发现，落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷通过抑制NF-κB信号通路活化下调了促炎因子的表达发挥抗病毒作用。

附图说明

图1是落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷核磁图：1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)；

图2是落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷是核磁图：13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)；

图3A、图3B分别是落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷对TNF-α和流感病毒H1N1介导的NF-κB信号通路活化的影响；

图4A～图4F各图分别是落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷对流感病毒H1N1感染介导的炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1以及IFN-α表达的影响；

图5A、图5B分别是落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷对流感病毒H9N2感染介导的炎症因子TNF-α和IP-10表达的影响。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合具体实施实例以及附图对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实例。

实施例1落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷的分离纯化及结构鉴定

按照本领域现有提取分离方法从板蓝根甲醇浸膏中提取分离获得落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷，具体是将500g板蓝根甲醇浸膏用水混悬，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，正丁醇部分70g经大孔树脂HPD100进一步脱糖，收集95％乙醇洗脱部分回收溶剂得浸膏约45g。浸膏经硅胶柱层析(200-300目，5×30cm),以氯仿-甲醇梯度洗脱(100:0-98:2-95:5-9:1-2:1-0:1,v/v)得到13个组分Fr.1-Fr.13。Fr.11经制备型MPLC纯化,以甲醇-水梯度洗脱(0：100-100：0，v/v)得到7个组分A-G，Fr.C进一步经硅胶柱层析纯化得到单体化合物，呈白色结晶样粉末(100mg)。

该结晶经NMR波谱解析，结果如下：

UVλmax(MeOH):229,279nm.¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ:7.01(1H,d,J＝8.4Hz,H-5),6.88(1H,s,H-2)，6.77(1H,d,J＝8.4Hz,H-6),6.74(1H,s,H-2’),6.66(1H,d,J＝8.4Hz,H-5’),6.56(1H,d,J＝8.4Hz,H-6’),4.86(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”),4.71(1H,d,J＝6.0Hz,H-7),3.88(1H,m,H-a-9’),3.74(1H,3H,s,3-OMe),3.73(3H,s,3’-OMe),3.69(1H.m,Ha-9),3.67(1H,m,Hb-9’),3.56(1H,m,Hb-9),2.82(1H,dd,J＝4.8,13.6Hz,Ha-7’),2.56(1H,m,H-8’),2.43(1H,m,Hb-7’),2.18(1H,m,H-8)；¹³C-NMR(DMSO-d₆,100MHz)δ:149.2(C-3),147.9(C-3’),146.0(C-4),145.0(C-4’),138.1(C-1),132.1(C-1’),121.0(C-6’),118.3(C-6),115.8(C-5’),115.5(C-5),113.2(C-2’),110.5(C-2),100.6(C-1”),82.0(C-7),77.5(C-5”),77.3(C-3”),73.7(C-2”),72.4(C-9’),70.1(C-4”),61.1(C-6”),59.1(C-9),56.1(C-3-OMe),56.0(C-3’-OMe),53.0(C-8),42.4(C-8’),32.6(C-7’)，结构确定为落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷。

实施例2落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷片剂制备

按如下配方称取各组分：

按药学领域中片剂常规制备方法制备片剂，共制成1000片，每片含落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷5mg。该片剂的用法为：每次2-4片，每天3次，七天为一疗程。

实施例3落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷胶囊剂制备

按如下配方称取各组分：

按药学领域胶囊常规方法制备，共制成1000粒，每粒胶囊含落叶松脂素-4-O-β-D–葡萄糖苷5mg。该胶囊的用法：每次2-4粒，每天3次，七天为一疗程。

实施例4落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷的体外抗病毒作用

1.1.材料

1.1.1药物

阳性对照药物：利巴韦林，购自广东肇庆星湖生物科技有限公司，批号L20120325；受试样品：落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷。

1.1.2细胞狗肾细胞(MDCK)引自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；

1.1.3流感病毒株病毒株普通甲型H1N1流感病毒(A/PR/8/34，H1N1)购自ATCC，以Reed-Muench法测定其半数感染量(TCID₅₀/100μL)作为病毒滴度。

1.1.4试剂

DMSO(美国SIGMA公司)；MEM(美国GIBCO公司)，批号8114414；胎牛血清(美国GIBCO公司)，批号10099；PBS(美国GIBCO公司)，批号20150122；1mg/ml TPCK批号20140220，购自广州捷倍斯生物科技有限公司。MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2)购自Genebase。

1.2.实验方法

1.2.1药物溶解：落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷以DMSO溶解配制成工作母液(浓度500mg/mL)，置4℃保存；阳性药物利巴韦林用DMEM培养液溶解，过滤后置4℃保存。

1.2.2.药物毒性实验(MTT法)

按每孔约2.5×10⁴MDCK细胞接种到96孔板，24h后待细胞长成单层后，弃去培养液，加入不同稀释度的药物100μL/孔，空白对照和正常细胞对照孔加入100μL/孔MEM，37℃，5％CO₂继续培养36-48小时，每孔加MTT溶液(5mg/mL)20μL，置37℃，5％CO₂温箱中继续孵育4小时。吸弃培养上清液，每孔加100μL二甲基亚砜(DMSO)，低速振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。按照下列公式计算抑制率，并用Reed-Muench法计算50％毒性浓度为药物半数有毒浓度(TC₅₀)。抑制率＝[(正常组平均OD值－空白组平均OD值)－(给药组平均OD值－空白组平均OD值)]/(正常组平均OD值－空白组平均OD值)×100％。

1.2.3.药物体外抗甲型流感病毒活性试验

以细胞病变抑制法(Cytopathic Effect Reduction Method)研究落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷对甲型流感病毒的抑制作用。长满单层的96孔细胞培养板内的MDCK细胞吸附病毒2小时，同时设定阳性药物和细胞对照，然后加入含不同浓度药物的培养液，置34℃、5％CO₂环境下培养48小时。

细胞出现病变程度按以下6级标准记录：-为细胞生长正常，无病变出现；±为细胞病变少于整个单层细胞的10％；+为细胞病变约占整个单层细胞的25％；++为细胞病变约占整个单层细胞的50％；+++为细胞病变约占整个单层细胞的75％：++++为细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。用Reed-Muench法计算半数抑制浓度(IC₅₀)，并以选择指数SI表示(SI＝TC₅₀/IC₅₀),SI>2表示低毒高效；SI：1～2表示高毒低效；SI<1表示无效。

1.3.实验结果

1.3.1细胞毒性

利用MTT法测得受试药物的有毒浓度为1mg/mL，经处理后的落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷的有效浓度(400μg/ml、800μg/ml)均低于有毒浓度，属安全无毒。

1.3.2抗甲型流感病毒作用药效

结果显示对甲型流感病毒有抑制作用，IC₅₀是50μg/ml，SI>4。

实施例5落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷的抗流感病毒药物作用机制研究

2.1.1药物受试样品：落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷

2.1.2细胞人肺腺癌549细胞株(A549细胞)和狗肾上皮细胞(MDCK细胞)购自中国科学院上海细胞库，人胚肾293细胞株(HEK293细胞)由广州呼研所李楚芳博士赠送。

2.1.3病毒株甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和A/Chicken/Guangdong/1996(H9N2)购自ATCC，以Reed-Muench法测定其感染复数(MOI)，以MOI＝0.1作为病毒滴度感染细胞。

2.1.4试剂DMEM培养基(批号：8114176)；DMEM/F12培养基(批号：1292607)；PBS(批号：20150122),胎牛血清(批号：10099)均购自GIBCO公司；TPCK(批号：20140220)购自广州捷倍斯公司。Reat-time PCR试剂购买自TaKarRa公司，Cat^#RR390A。

2.2实验方法

2.2.1.测定NF-κB荧光素酶报告基因的表达

能够持续表达NF-κB荧光素酶报告基因的HEK293细胞以每孔5×10⁴个/ml接种于96孔板，待细胞长成单层，弃去培养液，用PBS冲洗两遍。用不含血清的DMEM将甲型流感病毒H1N1(PR8)稀释至M.O.I＝0.1感染细胞，或用不含胎牛血清的DMEM(含10ng/ml的TNF-α)刺激细胞，同时用不同浓度的药物(落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷)干预细胞。24h后用荧光素酶检测试剂盒(Promege)检测荧光素酶表达水平。

2.2.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定

A549细胞以每孔5×10⁴个/ml接种于6孔板，待细胞长成单层，弃去培养液，用PBS冲洗两遍。用不含血清的DMEM将甲型流感病毒H1N1(PR8)或(H9N2)感染细胞，37℃贴壁2小时。用不含胎牛血清的DMED/F12将药物(落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷)稀释成不同浓度(400μg/ml、800μg/ml)加入细胞干预，8h和16h后分别收集细胞上清液，用TRIzol(Invitrogen)提取RNA，RNA稀释至合适的浓度后应用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，使用定量PCR(ABI7500Real-time PCR)分析cDNA。qPCR反应条件：变性95℃、30s；退火95℃、5s(40个循环)；延伸60℃、40s。

2.3实验结果

2.3.1 NF-κB荧光素酶报告基因的表达结果

400μg/ml、800μg/ml的落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷均能够明显抑制TNF-α及流感病毒诱导的NF-κB荧光素酶报告基因的表达，并呈剂量依赖关系(见图3A、3B)，说明落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷能够抑制NF-κB信号通路的活化。

2.3.2 qRT-PCR结果

400μg/ml、800μg/ml的落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷均能够能够明显抑制流感病毒(H1N1)诱导的促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1以及IFN-α的异常表达，并呈剂量依赖关系(见图4A～图4F)。400μg/ml、800μg/ml的落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷均能够明显抑制流感病毒(H9N2)诱导的炎症因子促炎因子TNF-α和IP-10的异常表达，呈剂量依赖关系(见图5A、图5B)。提示落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷可抑制流感病毒介导的炎症反应。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷作为唯一活性成分在制备用于治疗或预防甲型流感、及由甲型流感病毒引起的炎症的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物其中还含有药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体选自淀粉、糊精、糖粉、预胶化淀粉、乳糖、葡萄糖、微晶纤维素、碳酸钙、硫酸钙、碳酸氢钙、羟丙甲纤维素、聚维酮、糖浆、聚乙二醇、海藻酸钠、阿拉伯胶、桃胶、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羟丙基淀粉、羧甲淀粉钠、酒石酸、柠檬酸、碳酸氢钠、碳酸钠、酸酐、滑石粉、硬脂酸镁、液体石蜡、微粉硅胶中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物其剂型为药学上允许的剂型。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液、吸入剂、喷雾剂、乳膏、霜剂或凝胶剂。

6.落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷作为唯一活性成分在制备用于抑制甲型流感病毒介导的炎症反应的药物中的应用。