CN101601700A - 黑水缬草有效部位提取物及其质量控制方法和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黑水缬草有效部位提取物及其质量控制方法和医药用途。本发明提取物中总木脂素类物质的含量占提取物总重量的50％以上；其中，以(+)松脂素－4，4′－O－β－D－双葡萄吡喃糖苷和(+)松脂素－8－O－β－D－葡萄吡喃糖苷为有效部位提取物中的主要有效成分，二者的含量之和占提取物总重量的13％以上。本发明还公开该有效部位提取物的制备方法及其质量控制方法。本发明有效部位提取物含有1个总木脂素类成分的有效部位群，能够有效治疗老年痴呆症、抑郁症等中枢神经系统退行性疾病。本发明黑水缬草抗老年痴呆有效部位提取物的制备工艺能适应工业化生产，为应用黑水缬草治疗中枢神经系统退行性疾病提供了一种新方法。

Description

黑水缬草有效部位提取物及其质量控制方法和医药用途

技术领域

本发明涉及中草药有效部位提取物，尤其涉及黑水缬草(Valerianaamurensis Smir.ex Kom.)抗老年痴呆症有效部位提取物及其制备方法和质量控制方法，本发明还涉及该黑水缬草有效部位提取物在治疗中枢神经系统退行性疾病中的用途，属于缬草属有效部位提取物领域。

背景技术

黑水缬草为败酱科缬草属(Valeriana L.)植物黑水缬草(Valerianaamurensis Smir.ex Kom.)的干燥根及根茎。黑水缬草主要分布于中国东北地区，在大兴安岭地区资源丰富。其同属植物早已被用来治疗失眠等多种疾病，而且在神经系统、心脑血管及抗肿瘤等方面也有不同的药理作用，最新研究发现缬草属中化学成分对神经退行性疾病老年痴呆有治疗作用。但至今未见黑水缬草抗老年痴呆的有效部位制备方法及质量控制的相关报道。

发明内容

本发明目的之一是提供一种黑水缬草有效部位提取物；

本发明目的之二是提供一种制备上述黑水缬草有效部位提取物的方法；

本发明目的之三是提供一种黑水缬草有效部位提取物的质量控制方法，包括以超高效液相进行指纹图谱测定的质量控制方法等；

本发明目的之四是提供黑水缬草有效部位提取物的一种医药用途，即：将其用于治疗中枢神经系统退行性疾病；

本发明目的之五是提供一种治疗中枢神经系统退行性疾病的药物组合物，该药物组合物含有上述黑水缬草有效部位提取物；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

黑水缬草有效部位提取物，该有效部位提取物中总木脂素类物质的含量占提取物总重量的50％以上；其中，所述的总木脂素类物质包括以下化合物：(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)松脂素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素、(+)8，9′-二羟基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷、橄榄树脂素-4′-O-β-D-葡萄糖苷、落叶松脂醇-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷、橄榄树脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、8-羟基-落叶松脂醇-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、落叶松脂醇-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷；

更优选的，所述的有效部位提取物中以(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷和(+)松脂素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷为主要成分，二者的含量之和占有效部位提取物总重量的在13％以上。

本发明还提供了一种制备上述黑水缬草有效部位提取物的方法，该方法包括以下步骤：

a.将黑水缬草用水或乙醇回流提取2～4次，过滤，合并滤液；

b.滤液回收溶剂至黑水缬草药材3～6倍的体积，得乙醇提取物药液1；

c.将药液1用水混悬后用石油醚萃取，分别得到石油醚萃取物和水溶液药液2；

d.将水溶液药液2上样到大孔吸附树脂柱色谱进行吸附，水洗后，用30％～70％乙醇洗脱，合并洗脱液，浓缩，即得。

上述制备方法中，步骤a中：提取黑水缬草的乙醇的重量优选是黑水缬草药材重量的5～20倍；所述的乙醇浓度优选为30～100wt％，更优选为50～95wt％；所述的回流提取时间优选为每次回流提取1-3小时；

步骤d中所述的大孔吸附树脂柱色谱可选自D101，AB-8，HPD500，HPD300，NKA或H103等大孔吸附树脂柱色谱；所述的上样优选在流速为每小时1.1～1.3倍柱体积的条件下将水溶液药液2上样到大孔吸附树脂柱色谱进行吸附；

步骤d中优选用30～70％乙醇进行洗脱，更优选用50％乙醇进行洗脱；洗脱液的流速优选为每小时0.5～0.6倍柱体积。

本发明所述的黑水缬草为败酱科缬草属植物黑水缬草Valeriana amurensisSmir.ex Kom.的干燥根及根茎。

本发明还提供了一种用中药指纹图谱技术检测上述黑水缬草有效部位的方法，包括下述步骤：

色谱条件：Waters超高效液相；色谱柱：Hypersil C₁₈柱；流动相：甲醇-水(25-35：75-65)为流动相梯度洗脱；流速：1.0ml/min；检测波长：280nm；柱温：30℃；

第一步，建立黑水缬草对照品液相色谱图

①对照品溶液的制备：取经过鉴定的(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)松脂素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素、(+)8，9′-二羟基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷、橄榄树脂素-4′-O-β-D-葡萄糖苷、落叶松脂醇-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷、橄榄树脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、8-羟基-落叶松脂醇-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、落叶松脂醇-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷对照品各5.0mg，用甲醇定容至2ml，滤过，即得；

②分别精密吸取对照品溶液溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，测定对照品色谱图，建立峰面积与含量间的关系；

③将对照品溶液各取10μl混合，定容至1ml。取10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，测定混合对照品色谱图；

第二步，建立黑水缬草有效部位指纹图谱共有模式图谱

①供试品溶液的制备：取经鉴定的为黑水缬草有效部位的粉末5.0g，用甲醇定容至2ml，滤过，即得；

②黑水缬草有效部位指纹图谱测定：分别精密吸取黑水缬草有效部位供试品溶液溶液10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，即得黑水缬草有效部位供试品指纹图谱；

③取(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷对照品10μl，再取供试品溶液40μl中，混匀定容至0.5ml，精密吸取混合溶液10μl，注入液相色谱仪，进行加样回收测定；

④对所收集并经鉴定为黑水缬草有效部位的10批样品按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，并逐一按上述方法检测，分别得到各批黑水缬草有效部位相应的指纹图谱；经计算机辅助相似性评价系统进行计算，即可得出黑水缬草有效部位共有模式图谱；

⑤色谱图中应检出与对照指纹图谱相同的13个共有特征峰。其中5号峰为(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷，应与对照品指纹图谱一致；供试品指纹图谱与相应的共有模式图谱经计算机辅助相似性评价系统进行计算，相关系数应大于0.9000。

将有效量的本发明黑水缬草有效部位提取物(总木脂素)与药学上可接受的载体或辅料组合在一起后可得到一种治疗老年痴呆性疾病的药物有效部位。

本发明黑水缬草抗老年痴呆及抑郁症有效部位提取物可以加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的赋形剂或载体后，以常规的中药制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂，例如可以是注射剂、片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、滴丸等，其中，所述的辅料可以是抗氧剂、填充剂、骨架材料等；所述的药学上可接受的载体是淀粉、糖粉、木糖醇、甘露醇、乳糖、果糖、聚乙烯吡咯烷酮、低分子右旋糖酐中的一种或几种，优选为淀粉或乳糖。

本发明还提供一种由本发明黑水缬草有效部位提取物制备成的胶囊剂质量控制方法；

一种黑水缬草有效部位提取物胶囊剂质量控制方法，包括以下步骤：

含量测定：(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷标准曲线的制备：称取在60℃减压干燥至恒重的(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀；精密量取0.5mI，1.0mI，1.5ml，2.5ml与3.5ml，分别置50mI量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；照分光光度法，在280nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

测定法：取本品内容物，研细，取15mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；照分光光度法，在280nm的波长处分别测定吸收度，分别从标准曲线上读出供试品溶液中(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷的重量，计算，即得，本品每粒含总木脂素以(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷计，不得少于150.0mg；

(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷对照高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；25-35：75-65甲醇-水为流动相：检测波长为280nm，理论板数按(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：称取在60℃减压干燥至恒重的(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本品内容物，研细，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得；

测定法，分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；本品每粒含(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷不得少于1.50mg。

药理学实验结果表明，本发明黑水缬草有效部位提取物对大鼠在Morris水迷宫试验探索能力均具有增强的作用；能明显提高大鼠血清中SOD活力、MDA含量明显降低、抑制羟自由基能力增加；可在一定程度上保护大鼠海马区和皮质区的神经细胞，减少各种刺激因素对其的破坏；可以减少β-APP和Aβ1-40的阳性细胞的表达；能够减轻iNOS过表达，抑制COX-2活性和减少对核因子NF-kB的激活来降低AD大鼠的脑损伤过程；能够抑制Caspase-3的活化，并增加Bcl-2的表达量，减少Bax的表达，从而减少细胞凋亡。实验证明总木脂素物质为黑水缬草抗老年痴呆及抑郁症的有效部位。对该部位经口服给药未测出LD₅₀，经最大给药量测定证明，小鼠口服给药最大给药量为198.0g/kg，相当临床成人用量的69300倍。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

取黑水缬草原料5000g，先用原料20倍重量的50％乙醇提取3次，每次提取时间1.5小时，合并上述提取液，减压回收乙醇至小于或等于15000ml，得到药液1；

将药液1水混悬后用石油醚萃取，分别得石油醚萃取物和水溶液药液2；

将水溶液药液2上样到D101型大孔吸附树脂柱色谱D101(树脂重80g，柱体积100ml，柱径∶柱高＝1∶2)进行吸附，上样流速为每小时1.2倍柱体积，上完样后用蒸馏水冲洗柱子，直至水洗脱液近无色，弃去水洗脱液，用6倍柱体积含30％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液流速控制在每小时0.5倍柱体积，洗脱过程中用TCL检测是否洗脱完全；收集洗脱液，合并，减压浓缩，减压干燥，得到黑水缬草总木脂素粗品200g。

上述黑水缬草总木脂素提取物经高效液相-紫外检测法(UV-HPLC)测定，总木脂素类化合物含量占总提取物总重量的52.5％；其中所含木脂素类各成分占有效部位提取物总重量的百分含量分别为：(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷(11.8％)、(+)8-羟基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(3.0％)、(+)8-羟基-松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(2.4％)、(+)松脂素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(4.6％)、(+)松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(5.2％)、(+)8-羟基-松脂素(4.1％)、(+)8，9′-二羟基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(2.5％)、(+)8-羟基-松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷(2.6％)、橄榄树脂素-4′-O-β-D-葡萄糖苷(4.8％)、落叶松脂醇-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷(3.4％)、橄榄树脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(1.7％)、8-羟基-落叶松脂醇-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(2.9％)、落叶松脂醇-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(3.5％)。

实施例2

取黑水缬草根及根茎粗粉原料2500g，先用原料20倍重量的70％乙醇提取3次，每次提取时间1.5小时，合并上述提取液，减压回收乙醇至小于或等于7500ml，得到药液1；

将药液1水混悬后用石油醚萃取，分别得石油醚萃取物和水溶液药液2；

将水溶液药液2上AB-8型大孔吸附树脂柱色谱(树脂重80g，柱体积100ml，柱径∶柱高＝1∶2)，流速为每小时1.3倍柱体积，上完样后用蒸馏水冲洗柱子，直至水洗脱液近无色，弃去水洗脱液，用6倍柱体积含40％的乙醇洗脱，洗脱液流速控制在每小时0.5倍柱体积，洗脱过程中用TCL检测是否洗脱完全；收集洗脱液，合并，减压浓缩，减压干燥，得到黑水缬草总木脂素粗品151g。

上述黑水缬草总木脂素提取物经高效液相-紫外检测法(UV-HPLC)测定，总木脂素类化合物含量占总提取物总重量的61.1％；所含木脂素类各成分占有效部位提取物总重量的百分含量分别为：(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷(11.2％)、(+)8-羟基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(3.6％)、(+)8-羟基-松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(2.0％)、(+)松脂素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(5.2％)、(+)松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(5.8％)、(+)8-羟基-松脂素(6.7％)、(+)8，9′-二羟基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(3.1％)、(+)8-羟基-松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷(5.2％)、橄榄树脂素-4′-O-β-D-葡萄糖苷(4.4％)、落叶松脂醇-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷(4.1％)、橄榄树脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(3.3％)、8-羟基-落叶松脂醇-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(2.9％)、落叶松脂醇-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(3.6％)。

实施例3

取黑水缬草根及根茎粗粉原料2000g，先用原料20倍重量的95％乙醇提取3次，每次提取时间1.5小时，合并上述提取液，合并上述提取液，减压回收乙醇至小于等于6000ml，得到药液1；

将药液1水混悬后用石油醚萃取，分别得石油醚萃取物和水溶液药液2；

将水溶液药液2上H103型大孔吸附树脂柱色谱H103(树脂重80g，柱体积100ml，柱径∶柱高＝1∶2)，流速为每小时1.1倍柱体积，上完样后用蒸馏水冲洗柱子，直至水洗脱液近无色，弃去水洗脱液，用6倍柱体积含50％的乙醇洗脱，洗脱液流速控制在每小时0.6倍柱体积，洗脱过程中用TCL检测是否洗脱完全；收集洗脱液，合并，减压浓缩，减压干燥，得到黑水缬草总木脂素粗品168g。

上述黑水缬草总木脂素提取物经高效液相-紫外检测法(UV-HPLC)测定，总木脂素类化合物含量占总提取物总重量的54.5％；其中所含木脂素类各成分占有效部位提取物总重量的百分含量分别为：(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷(11.2％)、(+)8-羟基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(2.4％)、(+)8-羟基-松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(1.8％)、(+)松脂素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(4.0％)、(+)松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(4.6％)、(+)8-羟基-松脂素(5.5％)、(+)8，9′-二羟基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(1.9％)、(+)8-羟基-松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷(5.0％)、橄榄树脂素-4′-O-β-D-葡萄糖苷(4.2％)、落叶松脂醇-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷(4.2％)、橄榄树脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(3.1％)、8-羟基-落叶松脂醇-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(1.7％)、落叶松脂醇-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(4.9％)。

实施例4  注射液的制备

取实施例1所制备的黑水缬草有效部位提取物适量，加入适量增溶剂，研磨，再加少量注射用水稀释，混匀，然后加入氯化钠适量，溶解后再加注射用水至规定量，滤过，灌封，灭菌，即得。

实施例5  口服液的制备

取实施例2所制备的黑水缬草有效部位提取物适量，加入适量增溶剂，研磨，再加少量水稀释，混匀，然后加入矫味剂及防腐剂，混匀，加水至规定量。混匀，分装，灭菌，即得。

实施例6  胶囊剂的制备

取实施例3所制备的黑水缬草有效部位提取物适量，加入辅料适量，混匀，制成颗粒，装胶囊，即得。

试验例1 本发明黑水缬草有效部位提取物的制备工艺条件的考察试验

一、上样流速的考察

将黑水缬草水提取液(用黑水缬草药材5～20倍重量的水回流提取黑水缬草2～4次制备得到)(每12.5ml提取液相当于1g浸膏或3g原药材)上样于AB-8型大孔树脂柱(树脂重80g，，柱体积100ml，柱径∶柱高＝1∶2)的过程中，分别采用不同的流速，以Liberman试剂检测，考察了上样流速与吸附量的关系，检测结果见表1。

表1

结果表明：上样液流速与上样量呈负相关，流速越大，吸附量越小，考虑到流速小于1ml/min(1.1倍柱体积)时，耗时较长，而流速大于3ml/min(1.3倍柱体积)时，吸附量有偏低，耗用树脂量大，所以上样时采用2ml/min的流速，即上样流速为每小时1.2倍柱体积。

二、洗脱溶剂的考察

将已交换于AB-8型大孔吸附树脂柱(树脂重80g，柱体积100ml，柱径∶柱高＝1∶2)上的黑水缬草提取液(实施例1-3所述的药液2)，分别采用以下系统进行洗脱：含不同浓度的乙醇系统：TCL检测，考察了不同洗脱系统的洗脱效率，洗脱流速采用2ml/min，其结果如下：

洗脱系统：分别用含有5％，10％，20％，30％，40％，50％的乙醇洗脱；10％，20％，30％的乙醇洗脱效率无明显差别，40％的乙醇可见柱上有一条棕色的色带被洗下，洗脱至10倍柱体积时都不能将总木脂素完全洗下，TCL阳性，树脂颜色仍较深，呈暗红色。50％的乙醇洗脱时，10倍柱体积时能将总木脂素完全洗下，TCL阴性，树脂颜色仍较深，呈暗红色。50％乙醇洗脱效率高。

试验例2 本发明胶囊剂的质量控制方法：

供试样品：实施例6所制备的胶囊剂；

含量测定：(+)松脂素-4，4′-O-β-D双葡萄吡喃糖苷标准曲线的制备：精密称取在60℃减压干燥至恒重的(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀；精密量取0.5mI，1.0mI，1.5ml，2.5ml与3.5ml，分别置50mI量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；照分光光度法，在280nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

测定法：取供试样品，研细，取15mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；照分光光度法，在280nm的波长处分别测定吸收度，分别从标准曲线上读出供试品溶液中(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷的重量，计算，即得，本品每粒含总木脂素以(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷计，不得少于150.0mg。

(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷对照高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；30：70甲醇-水为流动相：检测波长为280nm，理论板数按(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备，精密称取在60℃减压干燥至恒重的(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备，取本品内容物(供试样品)，研细，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得，本品每粒含(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷不得少于1.50mg。

试验例3 黑水缬草有效部位提取物对老年痴呆大鼠损伤模型的影响

造模方法

空白组不予处理；造模组与给药组分别给予D-gal(50mg/kg·d)腹腔注射，造成亚急性衰老，4W后先进行双侧颈总动脉反复结扎，造成脑缺血性病灶。实验各组反复结扎双侧颈总动脉阻断血流。手术完成后，将大鼠喂养3天，取未死亡的状态良好的大鼠再脑内注射凝聚态Aβ1-40，假损伤组腹腔注射生理盐水4W，4W后先进行双侧颈总动脉反复结扎，再脑内注射等量的生理盐水。操作方法如下：大鼠水合氯醛360mg/kg腹腔注射麻醉，固定在脑立体定位仪上，头部备皮，常规消毒手术区皮肤，无菌下操作，沿颅中线做长2-3cm的切口，分离骨膜，暴露出“人”字缝和“十”字缝。在前囟后3.0mm，中线右侧旁开2.0mm，用7号针头钻开颅骨，暴露硬脑膜，微量注射器自脑表面垂直进针4.0mm，然后向脑组织内缓慢注射5μl Aβ1-40，垂直进针，注射5min，留针5min，注射后用牙科泥封堵颅骨。消炎粉消毒，缝合皮肤。

分组及给药方法

将155只健康的Wistar大鼠随机分成8组：空白组、假损伤组、模型组、抗老年痴呆有效部位提取物(实施例1-3所制备)低剂量组(0.26g/kg·d)、抗老年痴呆有效部位提取物高剂量组(0.52g/kg·d)、中药对照健脑胶囊组(2.41g/kg·d)。空白组15只，实验各组每组20只。空白组不予处理；假损伤组与模型对照组于脑内注射Aβ1-40手术第3天开始灌胃2％吐温-80水溶液7天，每天1次；各给药组于手术第3天开始连续灌胃给药7天，每天1次。

观察指标及取材方法

大鼠行为学检测(Morris水迷宫实验)

预先在水池里注入清水使水面高出平台1～2cm，水温控制在24士2℃左右。水池内壁涂有黑漆，水池共分为4个象限。将平台放在第一象限中间，在其他三个象限任选一点面向水池池壁将大鼠放入水中，试验历时5天，每天上午每个象限各测试一次，每次测试1min。若大鼠在1min之内尚未找到平台，则将大鼠拿到平台上并使它在上面站15s，若大鼠在1min之内找到平台，也让其在平台上站15s，方结束一次训练，如此训练4天。在第5天，将平台移走，每只大鼠游1min，记录每只大鼠第一次经过原平台的时间(潜伏期)，每只大鼠在1min内经过平台的次数、游过的总距离以及在原平台所在象限及其它三个象限内逗留的时间、距离；并分别计算出在第一象限游泳的时间(t₁)和距离(l₁)占整个游泳时间(t_总)和距离(l_总)的百分比。

大鼠血清中的生化指标的测定

在大鼠行为学检测后，每组取8只用水合氯醛(300mg/kg)麻醉后，快速开胸，行心脏采血，3500r/min离心10min取血清，置于-70℃低温保存。按试剂盒说明书进行检测SOD、MDA和羟自由基的含量。

实验结果

黑水缬草有效部位提取物对AD大鼠Morris水迷宫行为学的影响(见表2)

表2 大鼠空间探索试验结果(x±s)

注：^#与空白组、假损伤组比较p＜0.05；^##与空白组、假损伤组比较p＜0.01；^*与模型组比较p＜0.05；^**与模型组比较p＜0.01

结果表明，空白组与假损伤组比较无显著性差异(P＞0.05)。与空白组比较，模型组潜伏期延长、过台次数减少，在第一象限逗留时间短，差异显著(P＜0.01)，表明模型鼠空间探索能力下降。给药组和对照组均能缩短潜伏期、增加过台次数，在第一象限逗留时间延长，与模型组相比具有明显差异(P＜0.05或P＜0.01)，说明治疗有效，其中黑水缬草有效部位提取物高剂量组效果更显著。

黑水缬草有效部位提取物对AD大鼠血清中SOD、MDA和羟自由基的含量的影响(见表3)

表3 大鼠血清中SOD、MDA和羟自由基的含量(x±s，n＝8)

注：#与空白组、假损伤组比较p＜0.05；##与空白组、假损伤组比较p＜0.01；*与模型组比较p＜0.05；**与模型组比较p＜0.01

结果表明，空白组与假损伤组比较无显著性差异(P＞0.05)。与空白组比较，模型组血清SOD活力明显降低(P＜0.01)，MDA含量升高，抑制羟自由基能力降低(P＜0.01)；与模型组比较，给药组和对照组大鼠血清中SOD活力明显增加(P＜0.01)，MDA含量明显降低，抑制羟自由基能力增加(P＜0.05或P＜0.01)，其中黑水缬草有效部位提取物高剂量组效果更显著。

Claims (10)

1、黑水缬草(Valeriana amurensis Smir.ex Kom.)有效部位提取物，其特征在于：所述有效部位提取物中总木脂素类物质的含量占提取物总重量的50％以上；其中，所述的总木脂素类物质包括以下化合物：(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)松脂素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素、(+)8，9′-二羟基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷、橄榄树脂素-4′-O-β-D-葡萄糖苷、落叶松脂醇-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷、橄榄树脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、8-羟基-落叶松脂醇-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、落叶松脂醇-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷。

2、按照权利要求1所述的黑水缬草有效部位提取物，其特征在于：所述的有效部位提取物中以(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷和(+)松脂素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷为主要有效成分，二者的含量之和占有效部位提取物总重量的13％以上。

3、一种制备权利要求1或2述黑水缬草有效部位提取物的方法，包括以下步骤：

a.将黑水缬草用水或乙醇回流提取2～4次，过滤，合并滤液；

b.滤液回收溶剂至黑水缬草药材3～6倍的体积，得乙醇提取物药液1；

c.将乙醇提取物药液1用水混悬后用石油醚萃取，分别得到石油醚萃取物和水溶液药液2；

d.将水溶液药液2上样到大孔吸附树脂柱色谱进行吸附，水洗后，用30％～70％乙醇洗脱，合并洗脱液，浓缩，即得。

4、按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤a中回流提取黑水缬草的乙醇的重量是黑水缬草药材重量的5～20倍；所述的乙醇浓度为30～100wt％，优选为50～95wt％；所述的回流提取时间为每次回流提取1-3小时；步骤d中所述的大孔吸附树脂柱色谱选自D101，AB-8，HPD500，HPD300，NKA或H103大孔吸附树脂柱色谱；所述的上样在流速为每小时1.1～1.3倍柱体积的条件下将水溶液药液2上样到大孔吸附树脂柱色谱进行吸附。

5、按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤d中用30～70％乙醇进行洗脱，优选用50％乙醇进行洗脱；洗脱液的流速为每小时0.5～0.6倍柱体积。

6、权利要求1或2所述的黑水缬草有效部位提取物的质量控制方法，包括下述步骤：

色谱条件：Waters超高效液相；色谱柱：Hypersil C₁₈柱；流动相：甲醇-水为流动相梯度洗脱，其中甲醇和水的体积比为25-35∶75-65；流速：1.0ml/min；检测波长：280nm；柱温：30℃；

第一步，建立黑水缬草对照品液相色谱图：

①对照品溶液的制备：取经过鉴定的(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)松脂素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素、(+)8，9′-二羟基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羟基-松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷、橄榄树脂素-4′-O-β-D-葡萄糖苷、落叶松脂醇-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷、橄榄树脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、8-羟基-落叶松脂醇-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、落叶松脂醇-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷对照品各5.0mg，用甲醇定容至2ml，滤过，即得；

②分别精密吸取对照品溶液溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，测定对照品色谱图，建立峰面积与含量间的关系；

③将对照品溶液各取10μl混合，定容至1ml；取10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，测定混合对照品色谱图；

第二步，建立黑水缬草有效部位指纹图谱共有模式图谱：

①供试品溶液的制备：取经鉴定的为黑水缬草有效部位的粉末5.0g，用甲醇定容至2ml，滤过，即得；

②黑水缬草有效部位指纹图谱测定：分别精密吸取黑水缬草有效部位供试品溶液溶液10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，即得黑水缬草有效部位供试品指纹图谱；

③取(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷对照品10μl，再取供试品溶液40μl中，混匀定容至0.5ml，精密吸取混合溶液10μl，注入液相色谱仪，进行加样回收测定；

④对所收集并经鉴定为黑水缬草有效部位的10批样品按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，并逐一按上述方法检测，分别得到各批黑水缬草有效部位相应的指纹图谱；经计算机辅助相似性评价系统进行计算，得出黑水缬草有效部位共有模式图谱；

⑤色谱图中应检出与对照指纹图谱相同的13个共有特征峰；其中5号峰为(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷，应与对照品指纹图谱一致；供试品指纹图谱与相应的共有模式图谱经计算机辅助相似性评价系统进行计算，相关系数大于0.9000。

7、一种治疗中枢神经系统退行性疾病的药物组合物，其特征在于：由有效量的权利要求1或2所述的黑水缬草有效部位提取物与药学上可接受的载体或辅料组成。

8、按照权利要求7所述的药物组合物，其特征在于：将所述药物组合物制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸剂、口服液或注射液。

9、权利要求8所述胶囊剂的质量控制方法，包括：

含量测定：(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷标准曲线的制备：称取在60℃减压干燥至恒重的(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷对照品加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀；精密量取0.5mI，1.0mI，1.5ml，2.5ml与3.5ml，分别置50mI量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；照分光光度法，在280nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

测定法：取待检测内容物，研细，取15mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；照分光光度法，在280nm的波长处分别测定吸收度，分别从标准曲线上读出供试品溶液中(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷的重量，计算，即得，本品每粒含总木脂素以(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷计，不得少于150.0mg；

(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷对照高效液相色谱法测定：色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；25-35∶75-65的甲醇-水为流动相：检测波长为280nm，理论板数按(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：称取在60℃减压干燥至恒重的(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷对照品加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取待检测内容物，研细，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得；

测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；本品每粒含(+)松脂素-4，4′-O-β-D-双葡萄吡喃糖苷不得少于1.50mg。

10、权利要求1或2所述的黑水缬草有效部位提取物在制备治疗中枢神经系统退行性疾病药物中的用途。