CN102114060A

CN102114060A - 黑水缬草提取物及其制备方法和应用

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Publication number: CN102114060A
Application number: CN2011100422300A
Authority: CN
Inventors: 都晓伟; 梁朝锋
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-02-22
Filing date: 2011-02-22
Publication date: 2011-07-06
Anticipated expiration: 2031-02-22
Also published as: CN102114060B

Abstract

本发明涉及黑水缬草有效成分提取物，尤其涉及二氧化碳超临界萃取提取物及其软胶囊制剂的制备，以及在医药和保健食品领域的应用。采用二氧化碳超临界萃取可得到含有挥发油、缬草素类、缬草烯酸类成分的黑水缬草提取物，经药理实验证明提取物具有镇静安眠及抗抑郁作用。提取物经明胶、甘油、水等原料制成的囊壳包合后形成软胶囊制剂。

Description

黑水缬草提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及黑水缬草提取物，尤其涉及黑水缬草有效成分提取物及其制备方法，还涉及其软胶囊制剂和应用。

背景技术

缬草是欧洲最古老的植物药之一，从十八世纪中期就开始作为镇静剂使用，现已被美、德、法、英、俄、荷兰、意大利、日本等多国药典收载，以镇静安眠治疗作用开发的缬草制剂在欧美植物药市场具有举足轻重的地位，并且近年以较高的价格进口到中国，但目前尚无国产缬草制剂上市。

黑水缬草与欧缬草为同属近缘植物。黑水缬草Valeriana amurensis Smir.ex Kom.为败酱科缬草属药用植物，在我国历代本草书籍中未见记载，仅见其同属植物蜘蛛香V.jatamansi Jones。蜘蛛香始载于《滇南本草》(明·兰茂)：“马蹄香，一名鬼见愁，形似小牛舌，叶根黑，采枝叶入药，味苦、性寒。主治妇人潮热，阴虚火动，头眩发晕，虚劳可疗，晒干烧烟，可避邪物”。之后在《本草纲目》(明·李时珍)中也有记载：“蜘蛛香，出蜀西茂州松藩山中，草根也。黑色有粗须，状如蜘蛛及蒿本、芎，气味芳香，彼人亦重之。或云猫喜食之”。1977年中国药典曾收载蜘蛛香，具有理气止痛、消炎止泻、祛风除湿的功效。关于黑水缬草的药用研究报道较少。目前对黑水缬草的研究主要集中于挥发油类，挥发油的镇静催眠作用已被广泛认可。但经研究发现，除了挥发油类，非挥发性部分(主要为缬草素类和缬草烯酸类)对试验小鼠和大鼠均具有良好的镇静催眠和抗抑郁作用。

文献报道中，挥发油的提取方法多采用水蒸汽蒸馏法，缬草素类在40℃以上容易分解，可见水蒸汽蒸馏法对缬草素类破坏很大。另外，黑水缬草镇静催眠有效成分挥发油类和缬草素类都属于不稳定成分，遇光、热容易分解和氧化，并且具有酸败气味。这些都限制了黑水缬草类制剂的发展。

软胶囊对挥发油类药物来说是较为理想的剂型，研究表明比微囊、β-环糊精包结物更能较好掩盖药物的酸败气味。其囊材一般由甘油、明胶等组成，壁厚又无透气性，防止提取物氧化更优良，生产周期短，挥发油的损失、浪费较少。因此，可以将黑水缬草提取物制成软胶囊剂型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑水缬草提取物，其中含有的有效成分为缬草素类、缬草烯酸类和挥发油类，从而具有镇静催眠及抗抑郁的作用。

为了解决现有的提取方法对缬草素类破坏很大的问题，本发明的目的还在于提供所述黑水缬草提取物的提取方法，能够保留黑水缬草中的缬草素类、缬草烯酸类和挥发油类。

另外，由于黑水缬草镇静催眠有效成分挥发油类和缬草素类都属于不稳定成分，遇光、热容易分解和氧化，并且具有酸败气味。为了解决这些缺陷，本发明的目的还在于提供所述黑水缬草提取物的软胶囊制剂。

进一步，本发明目的还在于提供所述黑水缬草提取物及其软胶囊制剂的应用。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种黑水缬草提取物的制备方法，是在低于40℃的条件下采用超临界萃取法(SFE-CO₂)提取黑水缬草的有效成分，具体的包括如下步骤：取黑水缬草药材粗粉，采用二氧化碳超临界萃取技术，萃取温度30～40℃，萃取压力20～30MPa，夹带剂的量(ml)为药材重量(g)的2～4倍，所述夹带剂选自甲醇、无水乙醇或95％乙醇，解析温度30～40℃，解析压力3～6MPa，CO₂流量10～20L/h，萃取时间1～2h。

优选的提取条件为：萃取温度35℃，萃取压力25MPa，夹带剂的量(ml)为药材重量(g)的3倍，夹带剂为95％乙醇，解析压力5MPa，CO₂流量15L/h，萃取时间1.5h。

按照本发明提供的制备方法所得到的黑水缬草提取物，其中有效成分包括缬草素类、缬草烯酸类和挥发油类。优选的各成分的重量百分比为：缬草素1.60±0.40％，缬草烯酸2.10±0.53％，挥发油30.26±7.57％。

本发明还提供一种黑水缬草提取物的制备方法，是在低于40℃的条件下采用渗漉法提取黑水缬草的有效成分，具体的包括如下步骤：取黑水缬草药材粗粉，用95％乙醇浸润2小时，然后上柱放置24小时，以95％乙醇渗漉，收集渗漉液，至末次渗漉液中无检测量缬草烯酸和缬草素成分。合并渗漉液，在35℃以下减压回收至无醇味。

本发明还提供另一种黑水缬草提取物的制备方法，是在低于40℃的条件下采用浸提法提取黑水缬草的有效成分，具体的包括如下步骤：取黑水缬草药材粗粉，加入95％乙醇浸泡过夜，其间用搅拌器搅拌。过滤，收集滤液，在35℃以下减压回收至无醇味。

进一步，本发明所述的黑水缬草提取物可以按照常规制剂方法制备成各种口服制剂，例如冲剂、颗粒剂、微囊、软胶囊、片剂、口服液等；优选为软胶囊。

本发明还提供所述黑水缬草提取物的软胶囊制剂，是由囊壳及内容物组成；其中所述内容物为所述的黑水缬草提取物与植物油的混合物，所述植物油优选色拉油，重量配比为4∶1-1∶1，优选2.5∶1，混合溶液温度为4-30℃，并添加抗氧化剂；所述囊壳包括胶料、增塑剂、水、附加剂，所述胶料主要为明胶或阿拉伯胶，增塑剂为甘油，附加剂包括防腐剂、色素、香料等，其中胶料与水、增塑剂的重量配比为1-2.5∶1∶1-1.5，优选1∶1∶0.4，其熔胶温度为70-80℃，优选70℃；所述防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，其用量分别为明胶重量的0.16％和0.04％。

本发明所述黑水缬草有效成分提取物的软胶囊制剂的制备方法，是取黑水缬草提取物与植物油混匀，按比例取明胶，加入适量水使其溶胀，加入加热至70-80℃的甘油及剩余水中，加热，搅拌使溶解，静置去泡，滤去杂质，加入防腐剂混匀，胶液粘度保持40mPas^-1左右，胶液温度保持60℃左右，室温为20～25℃，相对湿度40～45％，自动旋转制丸机制丸，胶丸厚度0.7mm，粒重0.4603g，冷却定型4小时以上，乙醇洗丸，于25～30℃干燥12～15小时，再将丸置糖衣锅中，石蜡打光处理，装瓶，即得成品。

本发明还在于提供所述黑水缬草有效成分提取物在制备镇静催眠、抗抑郁类药物中的应用，以及所述黑水缬草有效成分提取物的软胶囊制剂在制备镇静催眠、抗抑郁类药物中的应用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1 SFE-CO₂提取法：

1、夹带剂种类的选择

取黑水缬草粉末，过20～40目筛，称取一定重量，按照萃取条件：萃取温度40℃，萃取压力30Mpa，解析温度35℃，解析压力5MPa，CO₂流量15L/h，萃取时间1.5h，夹带剂用量200ml，以甲醇、无水乙醇或95％乙醇作为夹带剂进行提取，提取液用乙醇定容，在35℃下减压干燥至无醇味，称重，计算出膏率。

选用不同夹带剂时的提取结果见表1所示。

表1

注：mg/g代表1g黑水缬草药材所提取有效成分的量

从以上可以看出，95％乙醇对缬草素和缬草烯酸的提取量都比较高，并且从安全性和成本方面考虑优选95％乙醇。

2、提取物测定

取SFE-CO₂提取物0.5g，精密称定，加甲醇适量，超声处理20min，用甲醇定容至50ml量瓶中。采用高效液相色谱法分别测定提取物中缬草烯酸和缬草素的含量。高效液相检测条件为：岛津LC-2010A型高效液相色谱仪，色谱柱Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-0.5％磷酸梯度洗脱，柱温35℃，流速1ml/min，进样量20μl。其中缬草烯酸和缬草素的检测波长分别为268nm和255nm，按标准曲线法分别计算提取物中缬草烯酸和缬草素的含量。同时采用水蒸汽蒸馏法提取挥发油，计算提取物中挥发油的含量，所得结果见表2。

表2 SFE-CO₂提取物实验结果

注：mg/g代表1g SFE-CO₂提取物中各成分的含量

3、SFE-CO₂提取条件的优选

A.正交实验设计

以萃取温度、萃取压力、夹带剂用量为考察因素，以缬草素、总缬草素和缬草烯酸提取量为考核指标筛选最佳提取条件，选用L₉(3⁴)正交表，按表3进行试验。

表3 SFE-CO₂提取法正交试验因素水平表

注：夹带剂用量＝夹带剂量(ml)/萃取物质量(g)

B.正交实验结果

取黑水缬草粉末，过20～40目筛，称取一定重量，按选定的正交试验表进行试验。所得提取液用乙醇作为稀释剂，定容，按照高效液相测定方法分别测定缬草素、缬草烯酸的提取量，采用滴定法测定总缬草素的提取量，结果见表4，表5。

总缬草素的含量测定方法是以缬草素为对照品，采用滴定法测定。

①滴定曲线的制备

供试品溶液的制备：取黑水缬草超临界提取物浓缩干膏0.125g，精密称定，加氯仿溶解，超声提取10min，滤过，转移至100ml量瓶中，加氯仿稀释至刻度，作为供试品溶液。

样品试验：精密量取供试品溶液10ml，减压收干，残渣加丙酮30ml溶解后，精密加入0.01mol/L氢氧化钠滴定液15ml，置56～59℃水浴加热水解30min。照电位滴定法(05版药典附录Ⅷ)项下，用0.01mol/L盐酸滴定液滴定，以酸度计测定pH值，记录消耗盐酸的体积和相应的pH值，以ΔpH/ΔV-V作图，一阶微商法确定计量点。

空白试验：精密量取供试品溶液10ml，减压收干，残渣加丙酮30ml溶解后，精密加入纯净水15ml，置56～59℃水浴加热水解30min，照电位滴定法(05版药典附录Ⅷ)项下，用0.01mol/L氢氧化钠滴定液滴定，以酸度计测定PH值，记录消耗氢氧化钠的体积和相应的pH值，以ΔpH/ΔV-V作图，一阶微商法确定计量点。

②线性关系考察

精密量取已知含量的缬草素对照品溶液(2.27mg/ml)1，3，5，7，9ml分别按样品测定方法测定含量，以总缬草素的量(mg)为纵坐标(Y)，所消耗的氢氧化钠滴定液(0.01mol/L)的体积(ml)为横坐标(X)，作标准曲线，得线性回归方程为：Y＝1.4055X+0.0075(r＝0.9999)，表明总缬草素在2.27mg～20.43mg范围内线性关系良好。

③样品测定

按供试品溶液制备方法制备3份样品溶液，分别进行滴定，计算总缬草素含量。

表4正交实验结果

注：mg/g代表1g黑水缬草药材中所提取有效成分的量

综合评分＝(缬草素提取量/缬草素提取量最大值)×0.1+(缬草烯酸提取量/缬草烯酸提取量最大值)×0.2+(总缬草素提取量/总缬草素提取量最大值)×0.7

表5方差分析表

F_0.10 ^(2，2)＝9.00 F_0.05 ^(2，2)＝19.00

根据方差分析可以看出A因素对提取效果有显著影响，B，C因素对提取效果影响不明显。根据直观分析，主次因素由极差(R)大小确定：A＞B＞C，即萃取温度＞萃取压力＞夹带剂用量，最佳工艺条件为A₁B₁C₃。即最佳提取条件为：萃取温度35℃，萃取压力25MPa，夹带剂3倍量。

实施例2渗漉法

取黑水缬草粉末，过20～40目筛，称取50g，用60ml 95％乙醇浸润2小时，然后上柱放置24小时，95％乙醇渗漉，以1ml/min的速度收集渗漉液，以柱体积为单位测定渗漉液中缬草烯酸和缬草素的含量，当收集到第六个柱体积时，几乎检测不到缬草烯酸和缬草素。合并渗漉液，用95％乙醇定容，在35℃下减压干燥至无醇味，称重，计算出膏率。

取所得干膏1g，精密称定，加甲醇适量，超声处理20min，用甲醇定容至25ml量瓶中，采用高效液相法分别测定缬草烯酸、缬草素在干膏中的含量。剩余干膏，用水蒸汽蒸馏法提取挥发油，计算干膏中挥发油的含量，所得结果见表6。

表6渗漉法提取试验结果

注：mg/g代表1g黑水缬草药材所提取有效成分的量

实施例3浸提法

取黑水缬草粉末，过20～40目筛，称取20g，加入400ml的95％乙醇浸泡过夜，然后用电动搅拌器搅拌4小时，过滤，收集滤液，用95％乙醇定容，在35℃下减压干燥至无醇味，称重，计算出膏率。

取所得干膏1g，精密称定，加甲醇适量，超声处理20min，用甲醇定容至25ml量瓶中，采用高效液相法分别测定缬草烯酸、缬草素在干膏中的含量。剩余干膏，用水蒸汽蒸馏提取挥发油，计算干膏中挥发油的含量，所得结果见表7。

表7浸提法提取试验结果

注：mg/g代表1g黑水缬草药材所提取有效成分的量

比较例1

选择有效成分的含量和出膏率为指标进行综合评分，所得结果见表8。

表8三种提取方法结果比较

评分标准：综合评分＝[(缬草烯酸含量/缬草烯酸含量最大值+缬草素含量/缬草素含量最大值+挥发油含量/挥发油含量最大值)/3]*0.7+(出膏率/出膏率最大值)*0.3

由比较结果可以看出：SFE-CO₂提取法最好，渗漉法次之，浸提法最差。

实验例1本发明黑水缬草有效成分提取物效果试验：

分别取SEF-CO₂提取、渗漉提取、浸提提取的提取液(相当于10g生药)，在35℃下减压收干乙醇，分别用1％Tween-80水溶液定容至25ml作为给药组溶液；并配制1％Tween-80水溶液作为空白对照组溶液。

在25℃条件下，选取体重18～22g小鼠，雌雄各半，随机分成4组，分别为空白组、渗漉组、超临界组、浸提组，每组12只。空白对照组灌胃给予1％Tween-80水溶液，其余三组分别按剂量灌胃给予受试药物，给药60min后，各组小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg，观察记录动物睡眠持续时间(翻正反射消失至恢复所需的时间)，用SPSS16.0做LSD-t检验，统计结果见表9。

表9黑水缬草有效部位对阈下催眠剂量戊巴比妥钠作用的影响

注：^***P＜0.001，与空白对照组比较

结果表明：与空白对照组相比，三个给药组都有极显著性差异(p＜0.001)，说明三种提取方法提取的有效部位均能明显延长催眠剂量戊巴比妥钠小鼠的睡眠时间；其中，渗漉组和浸提组与超临界组具有显著性差异(p＜0.01)，渗漉组与浸提组之间没有显著性差异(P＞0.05)，说明超临界提取方法提取的有效部位延长催眠剂量戊巴比妥钠小鼠的睡眠时间效果最佳。从而证明SEF-CO₂提取法最好。

实验例2给药剂量的确定

分别取经SFE-CO₂最佳提取工艺所得黑水缬草提取液5份(相当于1.25g生药，2.5g生药，5g生药，10g生药，20g生药量)，在35℃下减压收干乙醇，用1％Tween-80水溶液定容至25ml作为5个给药组溶液；并配制1％Tween-80水溶液作为空白对照组溶液。

在25℃条件下，选取体重18～22g小鼠，雌雄各半，随机分成6组，分别为空白组和5个给药组，每组12只。空白对照组灌胃给予1％Tween-80水溶液，其余四组分别按剂量灌胃给予受试药物，给药60min后，各组小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg，观察记录动物睡眠持续时间(翻正反射消失至恢复所需的时间)，用SPSS16.0做LSD-t检验，统计结果见表10。

表10黑水缬草有效部位对阈下催眠剂量戊巴比妥钠作用的影响

注：^***P＜0.001，与空白对照组比较

由上表可以看出，除了1给药组外，其它给药组与空白组相比，均具有极显著性差异(p＜0.001)，说明1给药组为无效剂量给药组，2、3、4、5给药组为有效剂量给药组。2、3、4三个给药组相互之间具有显著性差异，说明随着给药剂量的增加，药理作用不断增强(表现为小鼠睡眠时间的增加)。4、5给药组之间不具有显著性差异，说明随着给药剂量的增加，药理作用不再显著增强。所以4给药组为最佳有效剂量给药组。

实验动物和人临床用药剂量通常采用下列公式：

d_B＝d_A×K_B/K_A(人：K＝0.11，小鼠：K＝1)

式中d_B是欲求算B种动物(包括人)的公斤体重剂量，d_A是已知A种动物(包括人)的公斤体重剂量。根据人和小鼠之间的剂量换算，70kg人的给药剂量为77g生药，临床上为安全计取其1/3-1/5，即15g～26g生药。根据最佳提取条件的出膏率，20g生药的出膏量为0.3765～0.6526g。

实验例3黑水缬草抗抑郁作用的初步实验研究

将实施例1的黑水缬草的SFE-CO₂提取物用1％Tween-80水溶液配制成相当于1g/ml生药的乳浊液做为给药溶液，并配制1％Tween-80水溶液作为空白对照组溶液。实验动物为昆明种小鼠，雄性各半，(20±2)g。高、低剂量组给药剂量分别为37.5g.kg^-1、18.75g.kg^-1，空白组给予1％Tween-80水溶液，灌胃给药，给药后1h进行实验。

1、小鼠悬尾实验将小鼠尾部2cm的部位用胶布固定于铁架台边缘，使小鼠头向下悬挂，倒挂于箱(30cm×30cm×25cm)中，头部离箱底6cm，每只小鼠之间保持一定距离。开始时小鼠头部上下左右活动，企图找到攀抓的地方，一段时间后因失望而使活动减少，即出现间断性不动。小鼠活动时开动秒表，观察6min，计算后4min内小鼠悬尾不动时间，结果见表11。

2、小鼠强迫游泳不动实验小鼠放入水中后即游泳，寻找栖息的地方，一段时间后便因失望而漂浮不动，单只小鼠放入水深16cm的大烧杯中(18cm×14cm)，水温(24±2)℃，观察6min，计算后4min内小鼠游泳不动时间，结果见表12。

表11黑水缬草醇提物对悬尾实验中小鼠不动时间的影响(x±s)

注：与空白组比较P＜0.05

表12黑水缬草醇提物对强迫游泳实验中小鼠不动时间的影响(x±s)

注：与空白组比较P＜0.05

实施例4黑水缬草有效成分提取物软胶囊

根据药效及拟临床用量，设计每粒胶丸含黑水缬草提取物0.2157g，因量较小，需用分散介质稀释制成每1粒约含0.3g内容物胶丸，便于服用、制备。

软胶囊多选用植物油作为分散介质，无毒，易于肠道吸收，油量的多少，需通过试验加以确定。对于固体内容物，油量多，触变值低，流动性好，但易泄漏；油少稳定性好，但流动性差，压丸困难，本品原料主要为挥发油，常温下为粘稠状液体，不存在与介质混合后触变值高低问题，可与植物油混容，根据相似相溶原理，选用价廉质优的色拉油为分散剂。

1、与分散介质的混溶性考察

取实施例1的黑水缬草提取物10g，3份，分别加入2.5g、10g、15g色拉油混合，观察不同温度下溶解情况，结果见表13。

表13油与分散介质混合比例考察

上表结果表明，提取物与色拉油比例在4∶1-1∶1范围内，混合溶液温度在4℃以上，为稳定、均匀的一相，提取物和色拉油配比可选择2.5∶1，符合软胶囊制备工艺及临床推荐用药量要求，无需加入助溶剂、乳化剂等辅料。

2、软胶囊囊材的选择

选用L₉(3⁴)正交试验方法，考察组成囊材的明胶、甘油、水量，以明胶与甘油的比例、水与明胶比例、熔胶温度作为考察三因素，根据预试验设计三个水平，以制成胶丸的崩解时间为指标进行考察。试验方法为：按比例称取明胶、甘油、水，明胶先用约80％水使其吸水膨胀，另将甘油及余下的水置煮胶锅中，加热至熔胶温度，混匀，加入膨胀的明胶，搅拌使之溶融成均匀的胶液，保温60℃静置，除去上浮的泡沫，滤过，约20℃制丸，胶皮厚度控制在0.7mm，粒重0.4603g，乙醇洗取胶丸表面油迹，30℃干燥12小时，测定崩解时间，进行综合评分，评分标准：11-20min为81-100分，21-30min为71-80分，31-40min为61-70分，41-50min为51-60分，51-60min为41-50分，＞60min为11-40分，结果见表14，表15，表16。

表14 因素水平表

表15 L₉(3⁴)正交设计表及结果

表16 方差分析表

F_0.05 ^(2，2)＝19.00 F_0.01 ^(2，2)＝99.00

由方差分析结果可以看出，因素A(明胶与甘油比)、B(水与明胶比)有显著性差异(P＜0.05)，因素C(熔胶温度)无显著性差异(P＞0.05)；结合直观分析和生产实际，确定最佳方案为A₁B₃C₁，即囊材的配比为明胶∶水∶甘油＝1∶1∶0.4，熔胶温度定为70℃。

3、防腐剂的用量

根据文献资料，选用常用防腐剂对羟基苯甲酸甲酯，用量为明胶重量的0.16％，对羟基苯甲酸丙酯用量为明胶重量的0.04％。

4、软胶囊制备

软胶囊车间正常的生产条件为室温20～25℃，相对湿度40～45％，胶液温度保温60℃左右较适宜，温度高或低均易出现内容物泄漏。

用上述确定的囊材比例，取明胶先用约80％水浸泡溶胀；将剩余水与甘油混合，置煮胶锅中，加入防腐剂，加热至70℃，加入明胶液，搅拌使之完全溶融均匀，放冷，保温60℃静置，除去上浮的泡沫，滤过，测定胶液粘度，根据试验结果，胶液粘度约为40mpas^-1左右。取黑水缬草提取物与色拉油以2.5∶1混合均匀，在室温20～25℃，用WYJ100-IP型软胶囊机制丸。

5、软胶囊冷却时间考察

按上述条件压制的软胶囊，最初因其温度较高，囊壳含水量较大，不宜直接干燥，应冷却定型后再行干燥。经考察，室温冷却4小时以上，胶囊基本定型。然后用乙醇洗去胶囊表面油质等，再干燥。

6、软胶囊干燥条件的考察

软胶囊的干燥也是软胶囊生产中的一个重要环节，干燥温度过高或时间过长，会加速软胶囊的老化，使胶丸失去弹性，延长崩解时间，降低稳定性；干燥温度过低，干燥时间延长，干燥效果差，囊壳含水量加大，也影响软胶囊质量，同时降低生产效率。因此，选择适宜的干燥条件，对保证软胶囊的质量具有重要的意义。干燥温度及干燥时间的考察方法为：在35℃、30℃、20℃温度下，对胶丸进行干燥，并测定不同干燥时间的胶丸囊壳的含水量和崩解度。囊壳含水量测定方法为：取囊壳约1g，精密称定，置干燥恒重的表面皿(直径约75mm)中，加水10ml，放置，使膨胀后，置水浴上加热溶解，蒸干，在105℃干燥至恒重，以减失的重量，计算囊壳含水量。结果见表17。

表17胶囊干燥条件考查结果

由上表结果，选择30～35℃，烘干12～15小时，囊壳含水量约9％左右，崩解时间符合要求。

为增加干燥后软胶囊的稳定性，避免储存过程发生粘附，将软胶囊置包衣锅内，用石蜡打光。

7、软胶囊生产工艺

根据以上试验考察结果，确定黑水缬草软胶囊制备工艺为：取实施例1的黑水缬草提取物与色拉油以重量比2.5∶1混匀，明胶∶水∶甘油按重量比1∶1∶0.4的比例，取明胶，加入适量水使其溶胀，加入加热至70℃甘油及剩余水中，加热，搅拌使溶解，静置去泡，滤去杂质，加入对羟基苯甲酸甲酯0.16％，对羟基苯甲酸丙酯0.04％，混匀，胶液粘度保持40mpas^-1左右，胶液温度保持60℃左右，室温为20～25℃，相对湿度40～45％，自动旋转制丸机制丸，胶丸厚度0.7mm，粒重0.4603g，冷却定型4小时以上，乙醇洗丸，于25～30℃干燥12～15小时，再将丸置糖衣锅中，石蜡打光处理，装瓶，即得成品。

8、崩解时限

取本品6粒，照崩解时限检查法(中国药典2005年版一部附录XIIA)检查，结果见表18。

表18 崩解时限检查结果

批号崩解时限(min)

090301 30

090302 35

090303 32

以上结果表明，本品崩解时限均在1小时以内，符合中国药典2005年版一部附录IL胶囊剂项下的有关规定。

9、含量测定

取090301、090402、090503批次样品各三份，分别按供试品溶液制备方法制备样品溶液，进样20μl进行含量测定，计算样品中缬草烯酸含量，结果见表19。

表19样品中缬草烯酸含量测定结果(n＝3)

根据测得结果，考虑到药材的来源及制剂生产、储藏等因素的影响，缬草烯酸含量上下浮动20％，暂定本品中每粒含缬草烯酸，含量不低于3.1336mg/粒。

10、稳定性

根据《中药新药研究指南》关于“中药新药初步稳定性试验要求”的规定制定了本试验方案。取自制样品三批，在室温条件下留样(10℃～25℃、相对湿度为60％～85％)进行观察，时间为3个月，分别于0月、1月、2月、3月取样检测。主要考察了本制剂的性状、鉴别、检察、含量测定。

表20样品名称：黑水缬草软胶囊批号：090301

表21样品名称：黑水缬草软胶囊批号：090302

表22样品名称：黑水缬草软胶囊批号：090303

Claims

1.一种黑水缬草提取物的制备方法，是在低于40℃的条件下采用超临界萃取法(SFE-CO₂)提取黑水缬草的有效成分，具体的包括如下步骤：取黑水缬草药材粗粉，采用二氧化碳超临界萃取技术，萃取温度30～40℃，萃取压力20～30MPa，夹带剂的量(ml)为药材重量(g)的2～4倍，所述夹带剂选自甲醇、无水乙醇或95％乙醇，解析温度30～40℃，解析压力3～6MPa，CO₂流量10～20L/h，萃取时间1～2h。

2.根据权利要求1所述的方法，所述二氧化碳超临界萃取技术的条件为萃取温度35℃，萃取压力25MPa，夹带剂的量(ml)为药材重量(g)的3倍，夹带剂为95％乙醇，解析压力5MPa，CO₂流量15L/h，萃取时间1.5h。

3.一种黑水缬草提取物的制备方法，是在低于40℃的条件下采用渗漉法提取黑水缬草的有效成分，具体的包括如下步骤：取黑水缬草药材粗粉，用95％乙醇浸润2小时，然后上柱放置24小时，以95％乙醇渗漉，收集渗漉液，至末次渗漉液中无检测量缬草烯酸和缬草素成分；合并渗漉液，在35℃以下减压回收至无醇味。

4.一种黑水缬草提取物的制备方法，是在低于40℃的条件下采用浸提法提取黑水缬草的有效成分，具体的包括如下步骤：取黑水缬草药材粗粉，加入95％乙醇浸泡过夜，其间用搅拌器搅拌；过滤，收集滤液，在35℃以下减压回收至无醇味。

5.根据权利要求1所述方法制备得到的黑水缬草提取物，其中有效成分包括缬草素类、缬草烯酸类和挥发油类；优选的各成分的重量百分比为：缬草素1.60±0.40％，缬草烯酸2.10±0.53％，挥发油30.26±7.57％。

6.根据权利要求1-5任一项所述方法制备得到的黑水缬草提取物，按照常规制剂方法制备成各种口服制剂，例如冲剂、颗粒剂、微囊、软胶囊、片剂、口服液等；优选为软胶囊。

7.根据权利要求6所述的黑水缬草提取物的软胶囊制剂，是由囊壳及内容物组成；其中所述内容物为所述的黑水缬草提取物与植物油的混合物，所述植物油优选色拉油，重量配比为4∶1-1∶1，优选2.5∶1，混合溶液温度为4-30℃，并添加抗氧化剂；所述囊壳包括胶料、增塑剂、水、附加剂，所述胶料主要为明胶或阿拉伯胶，增塑剂为甘油，附加剂包括防腐剂、色素、香料等，其中胶料与水、增塑剂的重量配比为1-2.5∶1∶1-1.5，优选1∶1∶0.4，其熔胶温度为70-80℃，优选70℃；所述防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，其用量分别为明胶重量的0.16％和0.04％。

8.一种制备权利要求7所述黑水缬草提取物软胶囊制剂的方法，是取黑水缬草提取物与植物油混匀，按比例取明胶，加入适量水使其溶胀，加入加热至70-80℃的甘油及剩余水中，加热，搅拌使溶解，静置去泡，滤去杂质，加入防腐剂混匀，胶液粘度保持40mPas^-1左右，胶液温度保持60℃左右，室温为20～25℃，相对湿度40～45％，自动旋转制丸机制丸，胶丸厚度0.7mm，粒重0.4603g，冷却定型4小时以上，乙醇洗丸，于25～30℃干燥12～15小时，再将丸置糖衣锅中，石蜡打光处理，装瓶，即得成品。

9.权利要求1-5任一项制备得到的黑水缬草提取物在制备镇静催眠、抗抑郁类药物中的应用。

10.权利要求6或7所述的黑水缬草提取物制剂在制备镇静催眠、抗抑郁类药物中的应用。