CN105112296A - 一株角担菌菌株及其在制备缬草素、镇静安眠类中成药中的应用 - Google Patents

Abstract

一株角担菌菌株，其命名为角担菌XCS-6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC？No.9817，保藏日期为2014年10月22日。该角担菌菌株可应用于制备缬草素，具体是利用液体培养基对角担菌菌株进行发酵培养，摇床振荡，常温下培养至少6天，得到含缬草素的发酵液。将本发明的角担菌XCS-6先应用于制备缬草素后，还可再利用缬草素制备镇静安眠类中成药。

Description

一株角担菌菌株及其在制备缬草素、镇静安眠类中成药中的应用

技术领域

本发明涉及一种产缬草素的内生真菌及其应用，尤其涉及一种角担菌菌株及其应用。

背景技术

植物内生真菌作为一种新的微生物资源，受到了国内外学者的广泛关注，从植物内生菌中发掘新的活性物质已成为研究的热点。研究表明：寄生于药用植物内的内生真菌不但能促进宿主植物某些次生代谢产物的产生，而且自身也会产生相同或相似的代谢产物。绝大部分代谢物质都具有明显的抗肿瘤、抗氧化、抑菌等作用，是良好的医药原料。

缬草(ValerianaofficinalisL.)为败酱科缬草属植物，是我国重要的传统药用植物，以其根状茎及根入药，具有镇静催眠的功效。最新研究表明，缬草素是缬草镇静作用的主要成分，但是缬草根中缬草素含量极低，野生缬草资源较少，同时缬草为多年生草本植物，人工栽培生长缓慢，收获期长，无法满足市场需求。

利用内生真菌发酵，可以工业化生产某些生物活性成分，降低成本，满足市场需求；同时可以避免药用植物被大量采伐引起的生态危机，有利于保护珍稀濒危药用植物资源。对于本领域技术人员而言，尚未见到有利用内生真菌工业化生产缬草素的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一株角担菌菌株，还相应提供前述角担菌菌株在制备缬草素中的应用以及前述角担菌菌株在制备镇静安眠类中成药中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一株角担菌菌株，所述角担菌(Ceratobasidiumsp.AG-A)菌株命名为角担菌XCS-6，其于2014年10月22日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该保藏机构的简称为CGMCC，保藏机构的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.9817，保藏日期为2014年10月22日。

上述本发明的角担菌XCS-6属于一株能产缬草素的内生真菌，其是从缬草根上分离、纯化获得，其在PDA平板上，菌落呈灰白色，菌丝呈辐射状生长；显微镜下观察，菌丝体有隔，分生孢子梗和孢子无色，单胞，卵圆形，表面光滑，分生孢子梗自菌丝单个发生，呈树枝状特征结构。

上述本发明的角担菌XCS-6，其ITS序列在NCBI数据库中用BLAST进行同源性分析，得到相似性较高的序列，运用MEGA6.06软件构建系统发育树；该角担菌XCS-6的ITS序列与角担菌属(Ceratobasidiumsp.AG-A，编号：HQ270170.1)的同源性达到100％，结合形态学观察的结果，可以确定本发明的角担菌XCS-6为担子菌门伞菌纲鸡油菌目角担菌科角担菌(Ceratobasidiumsp.AG-A)。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述角担菌菌株在制备缬草素中的应用。

上述制备缬草素的应用中，优选的，具体包括以下步骤：利用液体培养基对所述角担菌菌株进行发酵培养，摇床振荡，常温下培养至少一周，得到含缬草素的发酵液。

上述制备缬草素的应用中，优选的，所述摇床振荡的转速控制在120～180r/min，培养温度具体控制在25℃～29℃，培养时间具体为6d～8d。

上述制备缬草素的应用中，优选的，所述液体培养基为PDA液体培养基，其包括以下浓度的组分：去皮土豆200g/L，葡萄糖200g/L，pH值6.5～7.0，121℃下灭菌30min。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述角担菌菌株在制备镇静安眠类中成药中的应用。优选的，先依据上述的应用方法制备缬草素，再利用缬草素制备镇静安眠类中成药。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.本发明中通过反复的研究和实验，最终成功分离、筛选出一株能够产缬草素的内生真菌，其命名为角担菌XCS-6，通过利用PDA液体培养基进行发酵培养，其缬草素的产量可达2.2mg/L左右，明显优于传统植物栽培的获取途径，对于工业化生产缬草素具有良好的工业化应用前景；

2.本发明通过菌株生产获得的缬草素是缬草药材中的主要活性成分，具有良好的镇静催眠效果，镇静作用温和，在医学上可应用于制备治疗失眠等症状的中成药。

一株能产缬草素的内生真菌，其命名为角担菌(Ceratobasidiumsp.AG-A)XCS-6，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏机构地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.9817，保藏日期为2014年10月22日。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明具体实施方式中角担菌XCS-6的菌落形态图；其中，左图为菌株形态正面图，右图为菌株形态背面图。

图2为本发明具体实施方式中角担菌XCS-6的显微结构图(放大40倍)。

图3为本发明具体实施方式中角担菌XCS-6的PCR扩增后的电泳图。

图4为本发明具体实施方式中角担菌XCS-6的ITS序列构建的系统发育树图。

图5为本发明具体实施方式中角担菌XCS-6的发酵液HPLC图。

图6为缬草素标准品的HPLC图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例：

我们采用微生物学方法，从健康的缬草植株中分离出产缬草素的内生真菌，然后利用PDA液体培养基进行发酵，采用HPLC法对发酵液中缬草素的含量进行测定，确定其为一株产缬草素的内生真菌，再通过形态学观察和ITS序列分析对该株产缬草素的内生真菌进行鉴定，确定其种属为角担菌XCS-6，整个分离、筛选、鉴定及制备缬草素的具体操作过程如下所示。

1.产缬草素的内生真菌的分离、筛选

缬草外植体：缬草采自贵州省贵阳市山区，经中南林业科技大学蒋丽娟教授鉴定为败酱科缬草属植物缬草。

外植体消毒：将新鲜的缬草根用自来水冲洗10min，用无菌水清洗3次。外植体的消毒采用75％酒精浸泡60s、无菌水清洗50s，用质量浓度为0.1％升汞浸泡180s，无菌水清洗50s备用。

外植体表面无菌检测：将消毒的外植体接入PDA固体培养基中，30℃培养48h，检测外植体表面消毒是否彻底。

内生真菌的分离纯化：挑选出表面无任何菌落生长的外植体，接种到PDA固体培养基中27℃培养；为了抑制细菌和放线菌生长，在倒平板前向培养基中加入1mg/L卡那霉素和1mg/L青霉素；待外植体周围长出菌丝后，挑取形态不同的菌落移至新的PDA固体培养基中，采用平板划线法进行纯化，分离出单菌落；将纯化后的菌株接种于PDA固体斜面培养基中，4℃保藏备用。

内生真菌的发酵培养：将上述筛选、分离得到的内生真菌接入50mL液体培养基(250mL三角瓶)中，150r/min摇床振荡，27℃培养7d。用双层无菌纱布在无菌条件下进行初过滤，取出菌丝体和孢子，4℃冷冻离心(8000r，5min)后取上清液，经0.45μm的有机微孔滤膜过滤后用于缬草素的测定。

PDA固体培养基(g/L)：去皮土豆200g，葡萄糖200g，琼脂20g，pH6.5～7.0，121℃灭菌30min。

PDA液体培养基(g/L)：去皮土豆200g，葡萄糖200g，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。

2.产缬草素的内生真菌的鉴定

形态学鉴定：从缬草根中共分离出12株不同形态型的缬草内生真菌，筛选出的一株内生真菌(编号为XCS-6)可产缬草素，根据《真菌分类学》和《真菌鉴定手册》进行形态学鉴定，其菌株的形态学特征与角担菌属特征极为相近，菌落形态如图1所示，孢子显微结构如图2所示。

分子鉴定：利用宝生物工程(大连)有限公司试剂盒(CodeNo.9164)提取上述内生真菌XCS-6的DNA，取上清液作为PCR扩增模板。PCR扩增条件：以94℃预变性5min；94℃变性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸5min，4℃保温的条件进行反应扩增。PCR扩增后用2.0％的琼脂糖凝胶跑电泳，记录其电泳结果，该内生真菌XCS-6经PCR后的凝胶成像结果如图3所示，在600bp附近得到扩增片段，目的条带清晰，证明已经从内生真菌XCS-6中成功提取出基因组DNA。电泳后切胶回收目的片段进行DNA测序，测序交由宝生物工程(大连)有限公司进行测序(测序结果参见附表中的核苷酸序列)。将测定后的DNA序列在NCBI数据库中用BLAST进行同源性分析，运用MEGA6.06软件构建系统发育树(系统发育树如图4所示)。

结合上述形态学观察的结果，确定该内生真菌XCS-6为真菌界担子菌门伞菌纲鸡油菌目角担菌科角担菌(Ceratobasidiumsp.AG-A)，其被命名为角担菌XCS-6。

3.缬草内生真菌的发酵液中缬草素的检测

缬草内生真菌角担菌XCS-6的发酵液中缬草素的检测如下：

色谱条件：

色谱柱：phenomenexC₁₈柱(250×4.60mm×10μm)；

流动相：乙腈-水(60∶40)；

流速：0.95mL/min；

检测波长：256nm；

柱温：25℃；

进样量：10μL。

对照品溶液的制备：精密取缬草素10.00mg，用无水甲醇稀释至100mL，得到1mg/mL的缬草素母液。取2mL缬草素母液，用无水甲醇稀释至100mL，得到20μg/mL的缬草素标准液，保存于4℃冰箱备用。

供试品溶液的制备：挑取已活化的角担菌XCS-6接种于含50mL/250mLPDA液体培养基中，于28℃120r/min摇床培养7d取出，用双层无菌纱布在无菌条件下进行初过滤，取出菌丝体和孢子，4℃冷冻离心(8000r，5min)后取上清液，经0.45μm的有机微孔滤膜过滤即为供试品溶液，保存于4℃冰箱备用。

HPLC检测结果：在同一色谱条件下，供试品与缬草素对照品保留时间相同，色谱峰一致，说明角担菌XCS-6发酵液中含有缬草素，结果见图5和图6。

4.角担菌XCS-6在制备缬草素中的应用

一种本发明的角担菌XCS-6在制备缬草素中的应用，具体包括以下步骤：利用液体培养基对所述角担菌菌株进行发酵培养，摇床振荡，常温下培养至少一周，得到含缬草素的发酵液。该角担菌XCS-6产缬草素工艺参数如下表1所示：

表1：角担菌XCS-6产缬草素工艺参数

本发明中培养基发酵7d后发酵液中缬草素含量达到2.1～2.2mg/L，发酵过程中培养基为PDA液体培养基，廉价易得，加上水电费、人工费等成本，每发酵产1mg缬草素的平均成本为5-6元，与现有缬草素的生产方法(例如申请号为200710175441的一种缬草提取物及其制备方法和用途的专利文献)和(例如申请号为201110042230的黑水缬草提取物及其制备方法和应用)相比，不需要采集缬草根茎，有利于保护缬草资源，原料成本大幅降低，与申请号为201110208935的黑水缬草不定根培养生产缬草素的方法中采用组织培养法产缬草素的生产周期3个月相比，本发明产缬草素的生产周期仅为7d，生产周期大幅缩短，且对仪器设备要求不高，且适合工业化生产，应用价值较高。

以上描述了本发明的主要特征和具体实施步骤。本发明不受上述实施例的限制，上述说明书和实施例中描述的是本发明的操作步骤，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种改进，这些改进都落入要求保护的范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一株角担菌菌株，其特征在于，所述角担菌(Ceratobasidiumsp.AG-A)菌株命名为角担菌XCS-6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.9817，保藏日期为2014年10月22日。

2.一种如权利要求1所述角担菌菌株在制备缬草素中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：利用液体培养基对所述角担菌菌株进行发酵培养，摇床振荡，常温下培养至少6天，得到含缬草素的发酵液。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述摇床振荡的转速控制在120～180r/min，培养温度具体控制在25℃～29℃，培养时间具体为6d～8d。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述液体培养基为PDA液体培养基，其包括以下浓度的组分：去皮土豆200g/L，葡萄糖200g/L，pH值6.5～7.0，121℃下灭菌30min。

6.一种如权利要求1所述角担菌菌株在制备镇静安眠类中成药中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，先依据权利要求2～5中任一项所述的应用制备缬草素，再利用缬草素制备镇静安眠类中成药。