CN108020611A - 一种检测银杏叶制剂中多种双黄酮含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测银杏叶制剂中多种双黄酮含量的方法，该方法可同时检测银杏叶制剂中穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、白果双黄酮、金松双黄酮，该方法采用HPLC(Waters e2695)，Welch Bolimate C18柱进行测定；流动相为乙腈‑水，梯度洗脱，乙腈的体积分数是40％‑80％，流速0.5ml/min；检测波长为330nm；柱温30℃，分别对标准品和供试品进行自动进样，用外标法计算五种双黄酮含量。本发明中双黄酮含量的检测大大提高了银杏叶制剂的质量控制标准，该方法无需复杂前处理，能做到快速检测，节约检测时间和检测成本。

Description

一种检测银杏叶制剂中多种双黄酮含量的方法

技术领域：

本发明涉及一种中药制剂的含量测定方法，具体涉及一种检测银杏叶制剂中多种双黄酮含量的方法。

技术背景：

银杏Ginkgo biloba L.是冰川时期存活在地球上的孑遗植物，素有“活化石”之称。中国是银杏的发源地，其资源占世界总量的70％左右。目前，德国、法国、美国已成为银杏叶提取物3大销售市场，而在亚洲，以日本、中国和韩国的银杏叶提取物销售情况最好。

银杏叶具有抗氧化、清除体内自由基、抗血小板激活因子、降低血液黏度、改善微循环、改善记忆力、增加脑血流量、保护脑微血管平滑肌细胞、减轻脑损伤、对胃黏膜的保护作用、提高神经可塑性、改善神经退行性疾病、抗辐射作用等多种药理作用。自上世纪六十年代以来，银杏叶的植物提取物在很多国家，例如欧盟国家及日本韩国，被广泛用于心脑血管及周围血液循环病症。

德国威玛舒培博士大药厂是欧洲知名的植物药生产商，也是银杏叶制剂领域的原研者、全球最大的银杏叶制剂厂商，其制定的银杏叶提取物标准被采纳为欧美药典标准，以法律形式公布，同时拥有大量的核心基础专利，其中 CN101175506B报道了采用树脂洗脱降低银杏叶提取物中的双黄酮含量的方法，接着又分别申请了其改进方法的专利CN101175505A，其在美国申请的专利中已将银杏双黄酮的含量控制在100ppm以内，其多篇专利(CN1282252A 、 CN200680013462.0)均显示，银杏叶提取物中双黄酮应该越低越好，专利中同时提到双黄酮具有生物活性的同时，具有生物毒性。

目前国内外文献中已有报道的银杏叶双黄酮主要是五种，分别为穗花杉双黄酮、白果双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮和金松双黄酮，其中有报道穗花杉双黄酮是P450酶强抑制剂，如果穗花杉双黄酮成分在制剂中不加控制大幅波动容易引起联用安全性问题，同时在《梅氏药物副作用》中也提示金松双黄酮有肾毒性风险。目前欧洲药品管理局European Medicines Agency(EMA)《2014年银杏叶年度评估报告》中规定银杏双黄酮类的含量应控制在0.1％以内。同时银杏叶提取物进口标准中也规定了银杏双黄酮类的含量应控制在0.1％以内，其检测方法针对的是总双黄酮，方法耗时较长，检测灵敏度低。目前国内银杏叶制剂的药典标准中未见其限量标准，明确各类双黄酮的具体含量对银杏叶制剂的质量提高有重要作用，且关系到患者的用药安全。

发明内容

本发明针对目前银杏叶制剂中双黄酮含量测定方法的不足，提供了一种更加合理高效的含量测定方法用于产品的质量控制，在原检测总双黄酮类含量的基础上，精确检测五种不同种类双黄酮—穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、白果双黄酮、金松双黄酮的含量。

本发明采用高效液相色谱法，在同一色谱条件下，采用流动相梯度洗脱，使用紫外检测器，在相同波长处同时测得五种双黄酮含量。

本发明提供一种检测银杏叶制剂中穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、白果双黄酮、金松双黄酮含量的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1，供试品溶液的制备；

步骤2，将供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图，采用标准曲线法，计算供试品溶液中穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、白果双黄酮、金松双黄酮五种双黄酮的含量。

其中，所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：

检测条件为：HPLC(Waters e2695)；色谱柱为Welch Bolimate C18；流动相为乙腈(A)-水(B)溶液；梯度洗脱，流速0.5ml/min；检测波长为330nm；柱温30℃；检测器灵敏度0.04AUFS。

优选的，色谱柱为AgilentC18(250mm×4.6mm，5μm)、Welch Bolimate C18 (100mm×3mm，2.7μm)，和色谱柱Welch Bolimate C18，型号100mm×3mm， 2.7μm，相比传统的250mm的C18柱，可节约三分之一的检测时间，且有更具优势的分离度。

所述梯度洗脱，洗脱条件为洗脱条件为0分钟，30％A；0～20分钟， 30％～45％A；20～25分钟，45％～100％A；25～30分钟，100％～30％A；30～35分钟，30％A。

其中所述标准曲线，采用上述同样的色谱条件，标准品溶液的制备方法如下：分别将五种双黄酮标准品用2mlDMSO溶解，甲醇溶液定容，取不同体积的标准品溶液注入高效液相色谱仪，根据结果绘制五个标准品的标准曲线。

其中，步骤1所述供试品溶液的制备方法如下；取待测样品，2ml DMSO溶解定容，取1ml上述溶液用甲醇定容至5ml，然后在超声提取器中超声30min。进样前用尼龙膜滤头过滤，其中超声过程中需旋摇容量瓶1～5次，以防止样品附着于瓶底。

本发明所述待测样品或供试品选自：银杏叶提取物、银杏叶滴丸、银杏叶片、银杏叶分散片、银杏叶胶囊、银杏酮脂滴丸、银杏酮脂分散片、银杏叶颗粒和银杏叶注射剂等。其中若为滴丸、片剂需去除包衣，胶囊剂去除胶囊壳。

根据本发明的检测方法，进一步制定本发明的质量标准，即以银杏叶提取物计，中含穗花杉双黄酮含量少于100ppm，银杏双黄酮含量少于250ppm，白果双黄酮含量少于250ppm，异银杏双黄酮含量少于400ppm，金松双黄酮含量少于 50ppm

本发明的目的是为了控制银杏叶制剂的质量，以降低制剂的毒副作用，为此本发明进行了以下研究：

穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、白果双黄酮、金松双黄酮五种双黄酮的毒理研究：

SD小鼠，60～70日龄，体重18～22g。大鼠于实验前先饲养一周，观察动物活动、进食、排泄等情况，挑选无异常者，将实验动物随机分成6组，每组10 只，雌雄各半。分别设空白对照组和穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、白果双黄酮、金松双黄酮组。灌胃给药1次/d，给药100μg/次，连续7天。第1、 3、5、7天称重，于第7天取血3000r/min，离心10min，取血清，按照相关试剂盒说明书的操作说明，测定血清ALT、AST、ALP、TG水平。

表1双黄酮连续灌胃给药7天对小鼠体重增长的影响

组别	1d(g)	3d(g)	5d(g)	7d(g)
					空白对照组	19.4±1.58	20.1±0.81	19.8±0.97	20.7±0.64
穗花杉双黄酮	20.1±0.58	19.4±1.23*	18.3±2.49**	17.8±1.07**
					银杏双黄酮	20.0±1.05	19.1±1.93*	17.5±0.89**	16.9±1.12**
异银杏双黄酮	19.4±0.99	19.7±1.52	17.7±2.12**	17.2±1.73**
					白果双黄酮	20.2±1.31	20.1±1.59	19.4±1.85	18.8±0.47**
金松双黄酮	19.3±1.44	19.6±0.53	18.9±2.31*	18.6±2.75**

与空白对照组比较，*：P<0.05，**：P<0.01(下同)

表2双黄酮给药7天对小鼠血液生化指标的影响

组别	ALT(U/L)	AST(U/L)	ALP(U/L)	TG(mmol/L)
					空白对照组	28.00±10.30	49.46±13.93	105.48±25.61	1.87±0.30
穗花杉双黄酮	20.97±10.31*	53.86±19.12	149.48±30.46**	2.95±0.58**
					银杏双黄酮	21.86±12.77*	52.71±12.19	154.81±19.97**	1.64±0.28
异银杏双黄酮	22.91±7.79*	54.50±18.78	150.90±26.61**	1.76±0.19
					白果双黄酮	27.63±8.22	51.50±15.46	153.21±15.13**	1.92±0.18
金松双黄酮	28.58±14.02	53.13±14.47	153.36±18.76**	3.15±0.21**

实验结果显示，服用穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、白果双黄酮、金松双黄酮后，动物体重、肝功能等各项指标均有不同程度的损伤，提示双黄酮存在一定的毒性风险。

本发明有益的技术效果在于：目前已公开的关于检测双黄酮的方法只是针对提取物的，对于市面上多种制剂都没有可靠的方法，且只限定了总双黄酮的含量，对于存在联用风险的穗花杉双黄酮和已有报道肾毒性的金松双黄酮没有进行单独控制，而银杏叶制剂在临床上服药周期长，且需要长期与化药联用。同时现有方法耗时长、分离度差。本发明同时解决了以上问题，弥补了银杏叶制剂没有检测双黄酮的方法，且无需复杂的前处理，并同时适用于包括滴丸剂、片剂、胶囊剂、注射剂等不同剂型。使用了新型的液相短柱，使检测时间大大缩短，分离效果良好，生产监控涉及到大批次量的检测，此方法有效的节约了企业检测时间和成本，且能更加有效的控制产品的安全性。

以下为样本，请按照类似样本提供贵公司的检测方法的筛选过程

本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

2.4.2色谱柱的选择：选择UPLC^TMHSS T₃色谱柱(2.1mm*100mm，1.8μm) 和UPLC^TMBEHC₁₈色谱柱(2.1mm*100mm，1.7μm)进行六种指标性成分检测，结果见图2。

图2结果显示：两种C18色谱柱均能将六种成分分离开，但T3柱子的分离度优于BEH，且T3出峰时间较均匀，所以优先选择T3的色谱柱。

2.4.3波长的选择：对提取物进行全波长扫描，见图3

图3结果显示：根据每种指标性物质的紫外全波长扫描图可知，6种指标性物质在230nm处均有吸收，且接近芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷的最大吸收波长，甘草苷最大吸收波长小于230nm，甘草酸最大吸收波长大于230nm，但在230nm处均有较强吸收。综合考虑六种指标性物质的吸收波长，选择230nm 作为检测波长。

2.4.4柱温的选择：按照现有供试品处理方法和色谱条件，分别选择30、35、40℃柱温。

图4结果显示：30℃的色谱图峰型较好，分离度较大，所以优选30℃柱温。 2.4.5流动相的选择：分别选取0.1％磷酸、0.05％磷酸、水作为水相进行考察。

结果显示：水的洗脱能力较差；而0.05％磷酸的图谱基线较0.1％磷酸平稳，故选择乙腈-0.05％磷酸为流动相。

水-乙腈体系中：芍药内酯苷、甘草酸峰不可见；0.05％磷酸-乙腈与0.1％磷酸乙腈相比，分离度明显更佳，所以选择0.05％磷酸水-乙腈体系。

2.4.6梯度条件的选择：

2.4.6.1采用超高效液相色谱法，以UPLC^TMHSS T₃色谱柱(2.1mm*100mm， 1.8μm)为分析柱，流动相为0.05％磷酸水溶液(B)-乙腈(A)；柱温30℃，体积流量为0.3mL/min，检测波长230nm；进样量2μL；分析时间15min。梯度洗脱条件见表3。

表3梯度洗脱表

时间(min)	A(乙腈)	B(0.05％磷酸溶液)
			initial	10	90
5	18	82
			7.5	100	0
9	100	0
			10	10	90
12	10	90

此条件下得到的色谱图，前三种成分已基本分开，后面成分未分开。

2.4.6.2条件同2.4.6.1，梯度洗脱条件见表4。

表4梯度洗脱表

时间(min)	A(乙腈)	B(0.05％磷酸溶液)
			initial	15	85
5	25	75
			5.5	55	45
6.5	65	35
			7.0	85	15
7.5	100	0
			9	100	0
10	15	85
			12	15	85

在表4的梯度洗脱条件下得到的色谱图，结果显示：后半部分色谱峰分离有所改善，前半部分仍待优化。

2.4.6.3条件同2.4.6.1，梯度洗脱条件见表5。

表5梯度洗脱表

在表5的梯度洗脱条件下得到的色谱图，结果显示：前三个峰分离度已较好，苯甲酰芍药苷和甘草酸已能分开。

2.4.6.4条件同2.4.6.1，梯度洗脱条件见表6。

表6梯度洗脱表

时间(min)	A(乙腈)	B(0.05％磷酸溶液)
			Initial	5.0	95.0
5	13.0	87.0
			8	13.0	87.0
13	15.0	85.0
			14	20.0	85.0
23	45.0	55.0
			24	100.0	0.0
26	100.0	0.0
			27	5.0	95.0
29	5.0	95.0

在表6的梯度洗脱条件下得到色谱图，结果显示：除甘草苷外，其它峰已分离良好。

2.4.6.5条件同2.4.6.1，梯度洗脱条件见表1。采用超高效液相色谱法，以UPLC^TMHSS T₃色谱柱(2.1mm*100mm，1.8μm)为分析柱，流动相为0.05％磷酸水溶液(B)-乙腈(A)；柱温30℃，体积流量为0.4mL/min，检测波长230nm；进样量2μL；分析时间24min。

在表1的梯度洗脱条件下得到色谱图，结果显示：此条件下，6种指标性成分峰型较好，分离度较大，最终确定此色谱条件。

附图说明

图1为实施例1中双黄酮含量测定色谱图。

图2为实施例2中双黄酮含量测定色谱图。

图3为实施例4中双黄酮含量测定色谱图。

图4为实施例5中双黄酮含量测定色谱图。

具体实施方法

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

(1)高效液相色谱条件

仪器：HPLC(Waters e2695)；

色谱系统：色谱柱：Welch Bolimate C18(100mm×3mm，2.7μm)；

检测波长：330nm；柱温30℃；进样量：20μl；检测器灵敏度0.04AUFS；

流动相：流速0.5ml/min。

洗脱条件为0分钟，30％A；0～20分钟，30％～45％A；20～25分钟，45％～100％A；25～30分钟，100％～30％A；30～35分钟，30％A。

(2)标准品溶液的制备：

(a)穗花杉双黄酮标准品溶液：精密称取穗花杉双黄酮标准品2mg，用 2mlDMSO溶解，摇匀，取1ml用色谱甲醇定容至200ml，制成5.320μg/ml的穗花杉双黄酮标准品溶液。

(b)银杏双黄酮标准品溶液：精密称银杏双黄酮标准品2mg，用2mlDMSO 溶解，摇匀，取1ml用色谱甲醇定容至200ml，制成5.064μg/ml的银杏双黄酮标准品溶液。

(c)异银杏双黄酮标准品溶液：精密称异银杏双黄酮标准品2mg，用 2mlDMSO溶解，摇匀，取1ml用色谱甲醇定容至200ml，制成5.116μg/ml的异银杏双黄酮标准品溶液。

(d)白果双黄酮标准品溶液：精密称白果双黄酮标准品2mg，用2mlDMSO 溶解，摇匀，取1ml用色谱甲醇定容至200ml，制成5.010μg/ml的白果双黄酮标准品溶液。

(e)金松双黄酮标准品溶液：精密称金松双黄酮标准品2mg，用2mlDMSO 溶解，摇匀，取1ml用色谱甲醇定容至200ml，制成5.248μg/ml的金松双黄酮标准品溶液。

(3)标准曲线的制作：

取上述浓度为5μg/mL的对照品溶液，依次进样1μL、2μL、6μL、12μL、 20μL、25μL、35μL，以进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

(4)待测样品溶液的制备：

银杏叶滴丸，厂家：万邦德制药集团股份有限公司。

精密称取除去包衣并已研细混匀的银杏叶滴丸100mg，2mL DMSO溶解定容，取1mL上述溶液用甲醇定容至5mL。超声处理30分钟，超声频率25khz，超声功率100w，然后取出，放冷。进样前用尼龙膜滤头过滤，得待测样品溶液。

(5)待测样品含量测定：精密吸取步骤(4)配置的样品20μL，注入高效液相色谱仪，根据条件(1)测定待测样品吸收峰，根据待测样品吸收峰及五条双黄酮标准曲线计算待测样品中双黄酮含量。

结果为：穗花杉双黄酮含量为87.11ppm，白果双黄酮含量为209.54ppm，银杏双黄酮含量为174.04ppm，异银杏双黄酮含量为324.48ppm，金松双黄酮含量为3.87ppm，总双黄酮含量为799.03ppm。

实施例2

与实施例1不同之处在于色谱柱为：AgilentC18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)溶液，梯度洗脱，洗脱条件为0～30分钟，47％A； 30～33分钟，47％～80％A；33～42分钟，80％A；42～45分钟，80％～47％A；45～55 分钟，47％A；流速1.0ml/min；检测波长：270nm；柱温40℃。

实施例3

取同一批次的银杏叶滴丸对实施例1进行方法学验证，分别获得待测样品溶液用于测定双黄酮含量，进行了精密度考察，结果见表3所示。结果表明，含量测定的RSD符合RSD在3％以内的要求。

表3本发明方法重复性实验含量测定(单位：ppm)

本方法的方法学验证中准确度考察(回收率实验)符合95％～105％的范围要求，RSD符合5％以内的要求

实验操作同实施例1，结果见表4.

表4本发明方法准确度测定

实施例4

将实施例1中的待测样品改成银杏叶片，其他同实施例1。结果为：穗花杉双黄酮含量为130.23ppm，白果双黄酮含量为181.10ppm，银杏双黄酮含量为 211.39ppm，异银杏双黄酮含量为339.11ppm，金松双黄酮含量为35.69ppm，总双黄酮含量为897.51ppm。

实施例5

将实施例1中的待测样品改成银杏叶酮脂滴丸，其他同实施例1。结果为：穗花杉双黄酮含量为207.26ppm，白果双黄酮含量为892.29ppm，银杏双黄酮含量为2325.71ppm，异银杏双黄酮含量为4499.29ppm，金松双黄酮含量为 720.31ppm，总双黄酮含量为8644.86ppm。

Claims (6)

1.一种检测银杏叶制剂中多种双黄酮含量的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：将银杏叶制剂研细混匀后，取80-120mg粉末加入1-3mlDMSO溶解定容，取0.5-2ml用甲醇定容，超声处理10～30分钟；

(2)含量测定：将步骤(1)制备的供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪进行检测，得到色谱图；采用标准曲线法计算供试品溶液中五种双黄酮的含量；

其中的色谱条件如下：

色谱柱为Welch Bolimate C18；

流动相为乙腈(A)-水(B)溶液；

检测波长为330nm；

柱温30℃；

流速0.5ml/min；

梯度洗脱条件为0分钟，30％A；0～20分钟，30％～45％A；20～25分钟，45％～100％A；25～30分钟，100％～30％A；30～35分钟，30％A。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双黄酮选自：穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、白果双黄酮、金松双黄酮。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备，方法如下：将银杏叶制剂研细混匀后，取100mg粉末加入2mlDMSO溶解定容，取1ml用甲醇定容，超声处理10～30分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，所述双黄酮标准曲线的制备，方法如下：

将双黄酮标准品用2mlDMSO溶解后用甲醇配置成双黄酮标准品溶液，取不同体积的穗花杉双黄酮标准品溶液与待测样品相同的条件下进行高效液相色谱检测，获得穗花杉双黄酮标准溶液的高效液相色谱图，以峰面积为横坐标，以进样量为纵坐标制作穗花杉双黄酮标准曲线。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱条件中，高效液相色谱柱型号为100mm×3mm，2.7μm。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述银杏叶制剂选自：银杏叶提取物、银杏叶滴丸、银杏叶片、银杏叶分散片、银杏叶胶囊、银杏酮脂滴丸、银杏酮脂分散片、银杏叶颗粒和银杏叶注射剂。