CN106324167A

CN106324167A - 一种uplc测定黄芪提取物中黄酮类成分的方法

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Publication number: CN106324167A
Application number: CN201510389879.8A
Authority: CN
Inventors: 牛涛; 徐波; 王苹; 陈红; 孙茜
Original assignee: TIANJIN TASLY MODERN CHINESE MEDICINE RESOURCE CO Ltd
Current assignee: TIANJIN TASLY MODERN CHINESE MEDICINE RESOURCE CO Ltd
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2015-07-06
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2035-07-06
Also published as: CN106324167B

Abstract

本发明涉及一种UPLC同时测定黄芪提取物中四种黄酮类成分的方法，所述方法包括以下步骤：

Description

一种UPLC测定黄芪提取物中黄酮类成分的方法

技术领域

本发明涉及一种超高效液相色谱法测定中药提取物的方法，特别涉及测定黄芪提取物中四种黄酮类成分的方法。

背景技术

黄芪为豆科植物蒙古黄芪和荚膜黄芪的根，其有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。黄芪中主要含有三类主要成分，分别为三萜皂苷、黄酮类化合物和多糖。

黄酮类化合物(flavonoids)是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮(flavone)结构的化合物。根据三碳键(C3)结构的氧化程度和B环的连接位置等特点，黄酮类化合物可分为下列几类：黄酮和黄酮醇；黄烷酮和黄烷酮醇；异黄酮；异黄烷酮；查耳酮；黄烷和黄烷醇等。黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，例如由银杏叶制成的舒血宁片含有黄酮和双黄酮类，用于冠心病、心绞痛的治疗。

在传统HPLC系统基础上开发的超高效液相色谱(Ultra PerformanceLC，UPLC)系统突破了色谱科学的瓶颈，充分利用了传统HPLC望尘莫及的亚二微米小粒度色谱柱的优势，使色谱分离的解析度达到新的高度；主要优势表现在：高分离度、高分离速度和高灵敏度。

黄芪提取物是芪参益气滴丸的制剂中间体，是由黄芪药材经水提、醇沉、减压浓缩制成的提取物。经过前期针对黄芪提取物的研究，我们发现黄芪提取物中主要含有四种黄酮类成分：毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷。

针对黄芪提取物，目前已经建立起了一整套全面的工艺和质量控制体系，但对于黄芪提取物中的黄酮类成分还缺乏检测方法。因此需要建立这样一种方法，进一步提升产品质量控制水平，从而更加准确的把握产品质量。

发明内容

本发明目的在于提供一种测定黄芪提取物中的黄酮类成分的方法，该方法采用超高效液相色谱法，其中供试品采用50～80％的甲醇提取，色谱条件为采用HSST3色谱柱，流动相A为含0-0.5％甲酸的水，流动相B为含0-0.5％甲酸的乙腈，流速为0.3-0.6mL/min，检测波长205-280nm。

根据本发明的实施方式之一，其中，供试品采用70％甲醇超声提取。

根据本发明的优选方式之一，其中，流动相A相为0.2％甲酸水溶液，B相为乙腈。

根据本发明的实施方式之一，其中，流动相速度为0.4mL/min。

根据本发明的又一实施方式，其中，检测波长为254nm。

根据本发明，流动相梯度程序可以为：

根据本发明所提供的方法，对照品采取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷，加甲醇配制成每毫升含毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分别为0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液。

根据本发明的实施方式之一，采用超高效液相色谱检测黄芪提取物中黄酮类成分的方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：分别取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷对照品，加50～80％的甲醇配制成每毫升含毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分别为0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液；

(2)供试品溶液的制备：取黄芪提取物0.5克，用50～80％的甲醇提取，提取液定容至25毫升；

(3)测定法：取各对照品溶液和供试品溶液各1-3μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的含量。

色谱条件：色谱柱：HSS T3

流动相：流动相A为含0-0.5％甲酸的水；流动相B为含0-0.5％

甲酸的乙腈；

流速：0.3-0.6mL/min；

检测波长：205-280nm。

流动相梯度程序

根据本发明优选方法，其中对照品溶液和供试品溶液均采用70％甲醇配制，测定过程中各对照品溶液和供试品溶液加样量均为2μl，流动相A为含0.2％甲酸的水，流动相B为乙腈，流速为0.4mL/min，检测波长为254nm。

本发明中的黄芪提取物，包括任何一种黄芪经过水提，醇提，水提醇沉，醇提水沉等方法提取得到的黄芪提取物，可以通过现有技术制备，也可以从市场上购买得到。

黄芪提取物制备方法，可以参考以下方法：

黄芪饮片加水回流提取两次，提取液合并，浓缩，进行两次醇沉，回收乙醇至密度约为1.3g/ml的浸膏，既得。

本发明优选的实验方法、色谱条件和溶剂提取方法，是经过筛选得到的，筛选过程如下：

(一)仪器与试药

1、仪器

液相色谱仪：Waters 2695四元泵，Waters 2996 PDA检测器，Empower3化学工作站

Milli-Q超纯水处理系统(MILLIPORE公司)

AG104电子天平、XS105DU电子天平(METTLER TOREDO公司)

KQ-100DB超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)

2、试药

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号：111920-201304)、芒柄花素对照品(批号：111703-200603)，均购自中国食品药品检定研究院；毛蕊异黄酮对照品(批号：20575-57-9，含量98％)、芒柄花苷对照品(批号：20587-51-3，含量98％)，均购自天津士兰科技有限公司

甲醇：天津化学试剂二厂，20140511

3、试验样品

黄芪浸膏(在线产品)：天津天士力现代中药资源有限公司

(二)色谱条件的选择

1、流动相选择

分别考查0.1％、0.2％、0.5％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，结果显示，0.1％甲酸水溶液为流动相A时，黄酮成分的色谱峰峰形较差，分离度偏低，0.2％、0.5％甲酸水溶液为流动相A的色谱峰峰形及分离度较好，考虑试验条件的温和性，采用0.2％甲酸水溶液为流动相A。

2、检测波长选择

分别对毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷四个对照品溶液进样分析，通过对色谱峰的二极管阵列波长扫描，四个成分均在254nm处有较大吸收，因此采用254nm为检测波长。

3、洗脱梯度

为使各黄酮成分色谱峰得到了良好的分离效果，考查了不同梯度洗脱条件，在保证分离度的前提下尽量缩短检验周期。梯度条件如下：

表2梯度条件(1)

表3梯度条件(2)

表4梯度条件(3)

相应色谱图参见附图1。

(三)样品处理方法的选择

分别考查30％、50％、70％甲醇溶解样品后的色谱峰，结果显示，70％甲醇溶解样品后，色谱峰杂峰较少，黄酮成分的色谱峰更高，回收率更好。

(四)方法学考察

1、线性关系考察：

精密称取经五氧化二磷干燥过的毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷对照品适量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分别为0.1mg、0.4mg、0.04mg和1.5mg的混合对照溶液，再分别取量取0.5、1、2、4、5、10ml混合对照溶液置于50ml量瓶中，加水至刻度，混匀，制成系列溶液，注入液相色谱仪，测定，以浓度对测得的峰面积进行线性回归，求得回归方程。

1.1毛蕊异黄酮线性关系考察数据：

表5毛蕊异黄酮线性关系数据

参见附图2。

1.2毛蕊异黄酮葡萄糖苷线性关系考察数据：

表6毛蕊异黄酮葡萄糖苷线性关系数据

参见附图3。

1.3芒柄花苷线性关系考察数据：

表7芒柄花苷线性关系数据

参见附图4。

1.4芒柄花素线性关系考察数据：

表8芒柄花素线性关系数据

浓度(mg/ml)	0.000405	0.00081	0.001619	0.004048	0.008096
						峰面积	10190	19316	44590	102316	214553

参见附图5。

2、进样精密度试验：

取20140103批样品，依法制备供试品溶液，重复进样6次，记录毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的峰面积，计算相对标准偏差。

表9进样精密度验证数据

3、重现性试验：

取20140103批样品，依法制备供试品溶液6份，分别测定毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的含量，计算相对标准偏差。

表10重现性验证数据

4、回收率试验：

精密称取20140103批样品6份，每份约0.25g，置25ml量瓶中，各分别精密加入混合对照品溶液5ml(每毫升含毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素分别为0.0185mg、0.1055mg、0.4765mg和0.01055mg)，自“加70％甲醇溶液适量，超声溶解”起，照含量测定项下依法处理，作为供试品溶液，取2ul注入色谱仪，分别计算毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素的回收率。

表11毛蕊异黄酮葡萄糖苷回收率数据

表12毛蕊异黄酮回收率数据

表13芒柄花苷回收率数据

表14芒柄花素回收率数据

5、稳定性考察

取20140103批制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样，记录毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的峰面积，计算相对标准偏差。

表15方法稳定性数据

经方法学验证，本专利涉及的含量测定方法的线性、精密度、重现性及准确性良好，能够有效测定黄芪提取物中的黄酮类成分。

本发明的方法中采用超高效液相色谱法，色谱填料为亚二微米杂化颗粒填料，分离效率更高，分析时间更短，工作效率大大提高。

本发明的色谱柱应用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，特别适用于反相色谱分离中增强对极性化合物的保留，本色谱柱C18碳链键合密度低，使分析物能更容易进入颗粒材料的孔结构中，为极性和疏水性分子提供均衡的保留性能而无需使用离子对试剂，能够使单一色谱方法用于分析多种不同极性的成分；而黄芪提取物中的黄酮成分极性差别很大，使用HSS T3色谱柱保证了各成分的色谱分离度。

本方法采用的流动相非常简单，以0.2％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，色谱条件温和，操作简单，重现性更好。因为采用的色谱柱对极性化合物有很好的保留，免去了在流动相B中添加甲酸或异丙醇等高粘度溶剂，使柱压更低。

本方法对洗脱梯度条件进行了优化，最大限度排除了其他成分对目标成分的干扰，能够在8分钟内对四种黄酮类成分实现有效的分离，分离度均大于3，达到了分析时间最短、重现性更好的高效、快速分离的效果。

经方法学验证，本发明涉及的含量测定方法的线性、精密度、重现性及准确性良好。

本发明利用快速高效的UPLC技术建立了针对黄芪提取物中的黄酮类化合物的含量测定方法，通过本方法的应用，可以进一步提升产品质量控制水平，从而更加准确的把握产品质量。

附图说明

图1梯度筛选色谱图

图2毛蕊异黄酮线性关系图

图3毛蕊异黄酮葡萄糖苷线性关系图

图4芒柄花苷线性关系图

图5芒柄花素线性关系图

图6黄芪提取物四种黄酮成分UPLC图谱

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

色谱条件和系统适用性试验仪器为Waters ACQUITY超高效液相色谱仪，采用UPLC HSS T3色谱柱，以0.2％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见下表，流速为0.4mL/min；检测波长：254nm。

对照品溶液的制备分别取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷对照品适量，加70％甲醇配制成每毫升含毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分别为0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液。

供试品溶液的制备取黄芪浸膏约0.5克，精密称定，加70％甲醇溶液适量，超声溶解，定容至25毫升，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取各对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，记录峰面积。外标法计算含量。

随机抽取的黄芪提取物产品，测定其中的黄酮成分，结果如下表16和图6所示：

表16黄芪提取物黄酮成分测定结果

实施例2

色谱条件和系统适用性试验仪器为Waters ACQUITY超高效液相色谱仪，采用UPLC HSS T3色谱柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，0.1％甲酸乙腈为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.3mL/min；检测波长：254nm。

对照品溶液的制备分别取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷对照品适量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分别为0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液。

供试品溶液的制备取黄芪浸膏约0.5克，精密称定，加50％甲醇溶液适量，超声溶解，定容至25毫升，摇匀，即得。

实施例3

色谱条件和系统适用性试验仪器为Waters ACQUITY超高效液相色谱仪，采用UPLC HSS T3色谱柱，以0.5％甲酸水溶液为流动相A，0.5％甲酸乙腈为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.6mL/min；检测波长：280nm。

实施例4

色谱条件和系统适用性试验仪器为Waters ACQUITY超高效液相色谱仪，采用UPLC HSS T3色谱柱，以0.2％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.6mL/min；检测波长：205nm。

供试品溶液的制备取黄芪浸膏约0.5克，精密称定，加80％甲醇溶液适量，超声溶解，定容至25毫升，摇匀，即得。

实施例5

色谱条件和系统适用性试验仪器为Waters ACQUITY超高效液相色谱仪，采用UPLC HSS T3色谱柱，以水为流动相A，0.5％甲酸乙腈为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.3mL/min；检测波长：254nm。

实施例6

色谱条件和系统适用性试验仪器为Waters ACQUITY超高效液相色谱仪，采用UPLC HSS T3色谱柱，以0.2％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.3mL/min；检测波长：270nm。

Claims

1.一种采用超高效液相色谱检测黄芪提取物中黄酮类成分的方法，其特征在于，供试品采用50～80％的甲醇提取，色谱条件为采用HSS T3色谱柱，流动相A为含0-0.5％甲酸的水，流动相B为含0-0.5％甲酸的乙腈，流速为0.3-0.6mL/min，检测波长205-280nm。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，供试品采用70％甲醇超声提取。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相A相为0.2％甲酸水溶液，B相为乙腈。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相速度为0.4mL/min。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测波长为254nm。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相梯度程序如下

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，对照品采取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷，加甲醇配制成每毫升含毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分别为0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液。

8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)测定法：取各对照品溶液和供试品溶液各1-3μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷的含量；

其中色谱条件如下：

色谱柱：HSS T3

流动相：流动相A为含0-0.5％甲酸的水；流动相B为含0-0.5％甲酸的乙腈；

流速：0.3-0.6mL/min；

检测波长：205-280nm；

流动相梯度程序

9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：分别取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷对照品适量，加70％甲醇配制成每毫升含毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和芒柄花苷分别为0.01mg、0.04mg、0.004mg和0.15mg的溶液；

(2)供试品溶液的制备：取黄芪浸膏0.5克，加70％甲醇溶液适量，超声溶解，定容至25毫升；

(3)测定法：取各对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标法计算含量，色谱条件为：色谱柱HSS T3，流动相A为含0.2％甲酸的水，流动相B为乙腈，流速为0.4mL/min，检测波长为254nm，流动相梯度程序为

10.如权利要求1-9所述的检测方法，其特征在于，黄芪提取物的制备方法为：黄芪饮片加水回流提取两次，提取液合并，浓缩，进行两次醇沉，回收乙醇至密度约为1.3mg/ml的浸膏，既得。