CN106442789A - 复方血脂宁提取物指纹图谱的建立及其活性成分定量分析方法 - Google Patents

复方血脂宁提取物指纹图谱的建立及其活性成分定量分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了复方血脂宁提取物指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、色谱条件检测、建立指纹图谱。本发明还公开了复方血脂宁提取物的活性成分定量分析方法，其特征在于包括如下步骤：步骤一、选取多组处方量复方血脂宁，分别制备血脂宁水提取物以及血脂宁β‑环糊精提取物；步骤二、分别建立所述血脂宁水提取物以及所述血脂宁β‑环糊精提取物的指纹图谱，确定34个共有指纹峰；步骤三、对所述共有指纹峰进行药材归属以及对所述共有峰进行成分确定，在确定的成分中选取多个活性指标成分，建立复方血脂宁多指标成分定量分析方法。

Description

复方血脂宁提取物指纹图谱的建立及其活性成分定量分析 方法
技术领域
本发明涉及中药制剂质量控制领域，具体涉及基于复方血脂宁提取物指纹图谱的建立及其活性成分定量分析方法。
背景技术
中药复方血脂宁收载于2010年版《中华人民共和国药典》一部中，由决明子、制首乌、荷叶、山楂四味中药组成，具有活血行气，化瘀降脂之功效，适用于血脉瘀滞所致高脂血症。环糊精(Cyclodextrin，简称CD)及其衍生物是近年来发展较快的新型药用材料，具有生物毒性低、水溶性好的特点。β-环糊精(β-CD)是淀粉经葡萄糖糖基转移酶发酵后得到的α-1,4-葡萄糖苷键连接的环状低聚物，其包含7个吡喃葡萄糖单元。具有内疏水、外亲水的特殊分子结构，能与多种“客体”药物形成包含物，从而可以增加药物的溶解度、稳定性并提高生物利用度。国内学者利用环糊精水溶液对金银花、银杏、广枣、虎杖等药材进行提取，发现环糊精对黄酮类，蒽醌类等成分具有增加提取率、改善溶出速率的作用，提示环糊精对药物分子具有选择包合作用，可提高中药活性成分的提取率。
中药指纹图谱技术谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，通过现代信息技术和质量分析手段能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价，基于中药指纹图谱并结合多指标成分定量分析的中药质量控制模式是以传统中医药理论为基础，体现了中医药整体治疗的特色，突出了指标性成分的作用，同时兼顾了微量成分和多成分融合调节作用的传统中医药理论，其在指纹图谱的基础上赋予指纹图谱定性、定量信息，对指纹图谱中多个目标成分尤其是有效成分进行准确定量分析，使得中药质量控制更加准确、真实反映中药的质量状况，使产品的组成更加清晰、产品的质量和稳定性更加可靠[。
复方血脂宁中存在大量的其他有效成分，而这些有效成分对于血脂宁的质量控制也是有重要意义的，因此，需要构建复方血脂宁指纹图谱，以全面地反映中药复方血脂宁所含有的化学有效成分，更好的控制复方血脂宁的药品品质，并且通过复方血脂宁的指纹图谱去进行多指标活性成分定量分析对于复方血脂宁提取物的质量控制也具有重要意义。
发明内容
本发明设计开发了复方血脂宁提取物指纹图谱的建立，本发明的发明目的是通过建立复方血脂宁高效液相指纹图谱，能够为中药复方血脂宁的鉴别和质量控制提供可靠依据。
本发明还设计开发了复方血脂宁提取物的活性成分定量分析方法，本发明的发明目的在于基于指纹图谱选取活性成分作为定量指标，建立复方血脂宁提取物活性成分定量分析方法。
本发明提供的技术方案为：
复方血脂宁提取物指纹图谱的建立方法，采用高效液相色谱法，包括如下步骤：
取二苯乙烯苷对照品，加甲醇溶解，定容，作为供试品溶液；
按照复方血脂宁处方量称取药材，用水或者β-环糊精水溶液提取，定容，作为供试品溶液；
采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以体积分数100％甲醇为A相，体积分数0.1％甲酸为B相，组成流动相，采用梯度洗脱，柱温为45℃，检测波长为280nm，流速为0.2mL/min，分析时间为40min；
采用进样量为3μL注入高效液相色谱仪，得到所述指纹图谱。
优选的是，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：
0分钟时，流动相A为10％的甲醇溶液，流动相B为90％的甲酸溶液；
2分钟时，流动相A为25％的甲醇溶液，流动相B为75％的甲酸溶液；
9分钟时，流动相A为35％的甲醇溶液，流动相B为65％的甲酸溶液；
12分钟时，流动相A为40％的甲醇溶液，流动相B为60％的甲酸溶液；
40分钟时，流动相A为90％的甲醇溶液，流动相B为10％的甲酸溶液；
所述柱温为45℃；所述流速：0.2mL/min；所述进样量：3μL。
优选的是，用水提取复方血脂宁物制备工艺包括：按照处方量复方血脂宁分别称取决明子3g，制首乌2g，荷叶1.5g，山楂1g，加入25倍量水，浸泡1小时，提取3次，每次2小时，提取液过滤后合并，得到复方血脂宁水提取供试液。
优选的是，用β-环糊精提取血脂宁物制备工艺包括：按照处方量复方血脂宁分别称取决明子3g，制首乌2g，荷叶1.5g，山楂1g，加入占药材量5％β-环糊精，25倍量水，浸泡1小时，提取3次，每次2小时，提取液过滤后合并，得到所述复方血脂宁β-环糊精提取供试液。
优选的是，所述指纹图谱包括34个共有指纹峰，相对保留时间分别为：
1号峰：0.52；2号峰：0.57；3号峰：0.61；4号峰：0.66；5号峰：0.89；6号峰：0.97；7号峰：1.00；8号峰：1.03；9号峰：1.13；10号峰：1.22；11号峰：1.26；12号峰：1.32；13号峰：1.35；14号峰：1.37；15号峰：1.46；16号峰：1.65；17号峰：1.68；18号峰：1.80；19号峰：1.83；20号峰：1.86；21号峰：1.88；22号峰：1.91；23号峰：2.06；24号峰：2.16；25号峰：2.21；26号峰：2.50；27号峰：2.67；28号峰：2.78；29号峰：2.87；30号峰：2.92；31号峰：2.96；32号峰：3.26；33号峰：3.53；34号峰：3.69。
复方血脂宁提取物的活性成分定量分析方法，包括：
选取多组处方量复方血脂宁，分别制备血脂宁水提取物以及血脂宁β-环糊精提取物，根据得到所述血脂宁水提取物以及所述血脂宁β-环糊精提取物的指纹图谱，确定34个共有指纹峰，对所述共有指纹峰进行药材归属以及对所述共有峰进行成分确定，在确定的成分中选取多个活性指标成分，建立复方血脂宁多指标成分定量分析方法；
其中，所述活性指标成分包括荷叶碱、二苯乙烯苷、红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷、槲皮素、橙黄决明素、大黄素。
优选的是，建立复方血脂宁多指标成分定量分析方法包括如下步骤：
取荷叶碱、二苯乙烯苷、红镰霉素-龙胆二糖苷、槲皮素、橙黄决明素、大黄素对照品，加甲醇溶解并定容，作为对照品溶液；
量取血脂宁提取物，加甲醇定容，摇匀，超声，离心，上清液经滤膜过滤，收集续滤液，作为供试品溶液；
采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以体积分数100％甲醇为A相，体积分数0.1％甲酸为B相，组成流动相，采用梯度洗脱，柱温为40℃～50℃，检测波长为254nm～320nm，流速为0.2mL/min，分析时间为40min。
优选的是，采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以体积分数100％甲醇为A相，体积分数0.1％甲酸为B相，组成流动相，采用梯度洗脱，柱温为45℃，检测波长为254nm、280nm、320nm，流速为0.2mL/min，分析时间为40min，进样量为3μL；以及
所述梯度洗脱的洗脱程序如下：
0分钟时，流动相A为10％的甲醇溶液，流动相B为90％的甲酸溶液；
2分钟时，流动相A为25％的甲醇溶液，流动相B为75％的甲酸溶液；
9分钟时，流动相A为35％的甲醇溶液，流动相B为65％的甲酸溶液；
12分钟时，流动相A为40％的甲醇溶液，流动相B为60％的甲酸溶液；
40分钟时，流动相A为90％的甲醇溶液，流动相B为10％的甲酸溶液。
优选的是，所述血脂宁水提取物制备工艺包括：按照处方量复方血脂宁分别称取决明子3g，制首乌2g，荷叶1.5g，山楂1g，加入25倍量水，浸泡1小时，提取3次，每次2小时，提取液过滤后合并，得到所述血脂宁水提取物；所述血脂宁β-环糊精提取物制备工艺包括：按照处方量复方血脂宁分别称取决明子3g，制首乌2g，荷叶1.5g，山楂1g，加入占药材量5％β-环糊精，25倍量水，浸泡1小时，提取3次，每次2小时，提取液过滤后合并，得到所述血脂宁β-环糊精提取物。
优选的是，对所述共有峰进行药材归属包括如下步骤：
步骤a、分别称取处方量阴性决明子复方、阴性制首乌复方、阴性荷叶复方、阴性山楂复方，并且分别制备水提取物以及β-环糊精提取物；
步骤b、分别建立所述水提取物以及所述β-环糊精提取物的指纹图谱，其与34个共有指纹峰进行比对；
步骤c、确定27个指纹峰归属于决明子，4个指纹峰归属于制首乌，4个指纹峰归属于荷叶，1个指纹峰归属于山楂。
本发明与现有技术相比较所具有的有益效果：
1、本发明所建立的复方血脂宁指纹图谱具有精密度高、稳定性和重现性好、方法简便的特点，能够快速、准确的鉴别复方血脂宁的质量品质；
2、本发明采用具有高分离度、高速度、高灵敏度特点的超高效液相色谱法建立血脂宁的中药指纹图谱，并选取荷叶碱、二苯乙烯苷、红镰霉素-龙胆二糖苷、槲皮素、橙黄决明素、大黄素作为活性指标成分，建立血脂宁多指标成分定量分析方法，为β-环糊精提取血脂宁新方法的应用提供可靠质量控制方法，同时能够为血脂宁复方优化及β-CD对血脂宁中主要活性成分稳定性及溶出度研究提供实验基础。
附图说明
图1为本发明所述的复方血脂宁水提物高效液相色谱图。
图2为本发明所述的复方血脂宁β-环糊精提取物高效液相色谱图。
图3为二苯乙烯对照品高效液相色谱图。
图4为血脂宁传统水提取样品指纹图谱图。
图5为血脂宁β-环糊精提取样品指纹图谱图。
图6为血脂宁共有指纹峰色谱图。
图7为决明子阴性复方指纹图谱图。
图8为制首乌阴性复方指纹图谱图。
图9为荷叶阴性复方指纹图谱图。
图10为山楂阴性复方指纹图谱图。
图11为决明子和制首乌阴性复方指纹图谱图。
图12为制首乌和山楂阴性复方指纹图谱图。
图13为采用BEH C18色谱柱，柱温45℃，甲醇起始比例为10％，检测波长为280nm色谱条件的高效液相色谱图。
图14为采用BEH shield RP18色谱柱，柱温45℃，甲醇起始比例为10％，检测波长为280nm色谱条件的高效液相色谱图。
图15为采用BEH shield RP18色谱柱，柱温45℃，甲醇起始比例为5％，检测波长为280nm色谱条件的高效液相色谱图。
图16为采用BEH shield RP18色谱柱，柱温40℃，甲醇起始比例为10％，检测波长为280nm色谱条件的高效液相色谱图。
图17为采用BEH shield RP18色谱柱，柱温50℃，甲醇起始比例为10％，检测波长为280nm色谱条件的高效液相色谱图。
图18为采用BEH shield RP18色谱柱，柱温45℃，甲醇起始比例为10％，检测波长为280nm色谱条件的高效液相色谱图。
图19为254nm对照品溶液高效液相色谱图。
图20为280nm对照品溶液高效液相色谱图。
图21为320nm对照品溶液高效液相色谱图。
图22为254nm血脂宁供试品溶液高效液相色谱图。
图23为280nm血脂宁供试品溶液高效液相色谱图。
图24为320nm血脂宁供试品溶液高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
复方血脂宁提取物指纹图谱的建立方法，采用高效液相色谱法，包括如下步骤：
对照品溶液的制备：取二苯乙烯苷对照品，加甲醇溶解，定容，作为供试品溶液；
供试品溶液的制备：按照复方血脂宁处方量称取药材，用水或者β-环糊精水溶液提取，定容，作为供试品溶液；
色谱条件：采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以体积分数100％甲醇为A相，体积分数0.1％甲酸为B相，组成流动相，采用梯度洗脱，柱温为40℃～50℃，检测波长为280nm，流速为0.2mL/min，分析时间为40min；
建立指纹图谱：采用进样量为3μL注入高效液相色谱仪，得到所述指纹图谱。
在另一种实施例中，梯度洗脱的洗脱程序如下：
0分钟时，流动相A为10％的甲醇溶液，流动相B为90％的甲酸溶液；
2分钟时，流动相A为25％的甲醇溶液，流动相B为75％的甲酸溶液；
9分钟时，流动相A为35％的甲醇溶液，流动相B为65％的甲酸溶液；
12分钟时，流动相A为40％的甲醇溶液，流动相B为60％的甲酸溶液；
40分钟时，流动相A为90％的甲醇溶液，流动相B为10％的甲酸溶液；
所述柱温为45℃；所述流速：0.2mL/min；所述进样量：3μL。
在另一种实施例中，用水提取复方血脂宁物制备工艺包括：按照处方量复方血脂宁分别称取决明子3g，制首乌2g，荷叶1.5g，山楂1g，加入25倍量水，浸泡1小时，提取3次，每次2小时，提取液过滤后合并，得到复方血脂宁水提取供试液；用β-环糊精提取血脂宁物制备工艺包括：按照处方量复方血脂宁分别称取决明子3g，制首乌2g，荷叶1.5g，山楂1g，加入占药材量5％β-环糊精，25倍量水，浸泡1小时，提取3次，每次2小时，提取液过滤后合并，得到所述复方血脂宁β-环糊精提取供试液。
在另一种实施例中，如图6所示，指纹图谱包括34个共有指纹峰，相对保留时间分别为：1号峰：0.52；2号峰：0.57；3号峰：0.61；4号峰：0.66；5号峰：0.89；6号峰：0.97；7号峰：1.00；8号峰：1.03；9号峰：1.13；10号峰：1.22；11号峰：1.26；12号峰：1.32；13号峰：1.35；14号峰：1.37；15号峰：1.46；16号峰：1.65；17号峰：1.68；18号峰：1.80；19号峰：1.83；20号峰：1.86；21号峰：1.88；22号峰：1.91；23号峰：2.06；24号峰：2.16；25号峰：2.21；26号峰：2.50；27号峰：2.67；28号峰：2.78；29号峰：2.87；30号峰：2.92；31号峰：2.96；32号峰：3.26；33号峰：3.53；34号峰：3.69。
实施例1
1材料
1.1药品
决明子(产地：越南)、制首乌(产地：四川)、荷叶(产地：山东)、山楂(产地：承德)。
1.2试剂
1.3仪器
2方法与结果
2.1复方血脂宁中药指纹图谱
2.1.1色谱条件
色谱柱：Acquity UPLC BEH shield RP18(2.1×100mm,1.7μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱程序见下表1；流速：0.2mL/min；柱温：45℃；检测波长：280nm；分析时间：40min；进样量3μL；如图1～3所示，为血脂宁高效液相色谱图。
表1梯度洗脱表
2.1.2样品溶液制备
血脂宁传统水提工艺按照血脂宁复方称取药材，决明子3g，制首乌2g，荷叶1.5g，山楂1g，加入25倍量水，浸泡1小时，提取3次，每次2小时。提取液过滤后合并，即为血脂宁传统水提样品。
血脂宁β-环糊精提取工艺按照血脂宁复方称取药材，决明子3g，制首乌2g，荷叶1.5g，山楂1g，加入占药材量5％β-环糊精，25倍量水，浸泡1小时，提取3次，每次2小时。提取液过滤后合并，即为血脂宁β-环糊精提取样品。
供试品溶液制备精密量取1mL提取样品，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，超声30min，10000r·min-1离心10min，上清液经0.22μm滤膜过滤，收集续滤液即为供试品溶液。
对照品溶液制备取二苯乙烯苷对照品适量，精密称定，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。
2.1.3血脂宁指纹图谱
按血脂宁复方称取药材10份，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样分析，10批传统水提取样品与β-环糊精提取样品指纹图谱(图4、图5所示)。对比血脂宁传统提取与β-环糊精提取样品指纹谱图可知，两种提取方法样品指纹峰数目相同，根据各自10批样品共标定34个共有指纹峰(如图6所示)。
2.1.4相似度评价
采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，对血脂宁10批传统提取样品及10批β-环糊精提取样品分别进行相似度判别，结果传统提取样品相似度评价结果均大于0.988，表明各批次样品相关性好，提取工艺稳定；β-环糊精提取样品相似度评价结果均大于0.986，同样表明各批次样品相关性好，提取工艺稳定，并且说明本发明建立的复方血脂宁指纹图谱方法准确可靠，结果见表2和表3。
表2血脂宁10批传统提取样品相似度计算结果
表3血脂宁10批β-环糊精提取样品相似度计算结果
2.1.5方法学验证
精密度试验取同一供试液连续进样6次，以二苯乙烯苷(7号峰)为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间RSD＜2.0％；相对峰面积RSD＜3.0％，表明该色谱方法精密度良好，结果见表4，见表5。
表4共有峰相对保留时间精密度试验结果
表5共有峰相对峰面积精密度试验结果
稳定性试验取同一供试液，分别于0，2，4，8，12，18，24h进样分析，以二苯乙烯苷(7号峰)为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。各共有峰的相对保留时间RSD＜0.34％；相对峰面积的RSD＜2.9％，表明该色谱方法测定样品在24h内稳定，结果见表6、表7。
表6共有峰相对保留时间稳定性试验结果
表7共有峰相对峰面积稳定性试验结果
重复性试验平行制备6份供试液，进样分析，以二苯乙烯苷(7号峰)为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。各共有峰的相对保留时间RSD<0.37％；相对峰面积的RSD<2.9％，表明该色谱方法重复性良好，结果见表8、表9。
表8共有峰相对保留时间重复性试验结果
表9共有峰相对峰面积重复性试验结果
复方血脂宁提取物的活性成分定量分析方法，包括如下步骤：
选取多组处方量复方血脂宁，分别制备血脂宁水提取物以及血脂宁β-环糊精提取物，得到所述血脂宁水提取物以及所述血脂宁β-环糊精提取物的指纹图谱，确定34个共有指纹峰，对共有指纹峰进行药材归属以及对共有峰进行成分确定，在确定的成分中选取荷叶碱、二苯乙烯苷、红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷、槲皮素、橙黄决明素、大黄素活性指标成分，建立复方血脂宁多指标成分定量分析方法。
在另一种实施例中，在所述步骤三中，建立复方血脂宁多指标成分定量分析方法包括如下步骤：
对照品溶液的制备：取荷叶碱、二苯乙烯苷、红镰霉素-龙胆二糖苷、槲皮素、橙黄决明素、大黄素对照品，加甲醇溶解并定容，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：量取血脂宁提取物，加甲醇定容，摇匀，超声，离心，上清液经滤膜过滤，收集续滤液，作为供试品溶液；
色谱条件：采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以体积分数100％甲醇为A相，体积分数0.1％甲酸为B相，组成流动相，采用梯度洗脱，柱温为40℃～50℃，检测波长为254nm～320nm，流速为0.2mL/min，分析时间为40min。
在另一种实施例中，所述色谱条件：
采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以体积分数100％甲醇为A相，体积分数0.1％甲酸为B相，组成流动相，采用梯度洗脱，柱温为45℃，检测波长为254nm、280nm、320nm，流速为0.2mL/min，分析时间为40min，进样量为3μL；
梯度洗脱的洗脱程序如下：
0分钟时，流动相A为10％的甲醇溶液，流动相B为90％的甲酸溶液；
2分钟时，流动相A为25％的甲醇溶液，流动相B为75％的甲酸溶液；
9分钟时，流动相A为35％的甲醇溶液，流动相B为65％的甲酸溶液；
12分钟时，流动相A为40％的甲醇溶液，流动相B为60％的甲酸溶液；
40分钟时，流动相A为90％的甲醇溶液，流动相B为10％的甲酸溶液。
在另一种实施例中，血脂宁水提取物制备工艺包括：按照处方量复方血脂宁分别称取决明子3g，制首乌2g，荷叶1.5g，山楂1g，加入25倍量水，浸泡1小时，提取3次，每次2小时，提取液过滤后合并，得到所述血脂宁水提取物；血脂宁β-环糊精提取物制备工艺包括：按照处方量复方血脂宁分别称取决明子3g，制首乌2g，荷叶1.5g，山楂1g，加入占药材量5％β-环糊精，25倍量水，浸泡1小时，提取3次，每次2小时，提取液过滤后合并，得到所述血脂宁β-环糊精提取物。
在另一种实施例中，对共有峰进行药材归属包括如下步骤：
步骤a、分别称取处方量阴性决明子复方、阴性制首乌复方、阴性荷叶复方、阴性山楂复方，并且分别制备水提取物以及β-环糊精提取物；
步骤b、分别建立所述水提取物以及所述β-环糊精提取物的指纹图谱，其与34个共有指纹峰进行比对；
步骤c、确定27个指纹峰归属于决明子，4个指纹峰归属于制首乌，4个指纹峰归属于荷叶，1个指纹峰归属于山楂。
实施例2
1材料
1.1药品
荷叶碱(111566-200703)、槲皮素(100081-200907)、大黄素(110756-200110)、大黄酚(110796-201017)、大黄素甲醚(110758-201013)、2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(简称二苯乙烯苷，110844-200606)购自中国食品药品检定研究院；红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷(简称红镰霉素-龙胆二糖苷，纯度≥98％)购自南京拓海生物科技有限公司。决明子(产地：越南)、制首乌(产地：四川)、荷叶(产地：山东)、山楂(产地：承德)。
1.2试剂
1.3仪器
2方法与结果
2.1复方血脂宁中药指纹图谱
2.1.1采用实施例1中“2.1.1～2.1.3”项下确定复方血脂宁中药指纹图谱。
2.1.2共有指纹峰归属
分别按复方量称取阴性决明子、制首乌、荷叶、山楂复方，按实施例1中“2.1.2”项下样品制备方法制备各药材阴性药材样品，进样分析，对34个共有指纹峰进行了归属，结果见表10和表11，对阴性样品供试品溶液指纹图谱分析结果见图7～12。
表10共有指纹峰归属
注：表内色谱峰名称经前期质谱定性研究确定。
表11共有指纹峰各药材归属数量
根据复方血脂宁中药指纹图谱中色谱峰药材归属试验结果，选取决明子中的红镰霉素-龙胆二糖苷、橙黄决明素、大黄素，制首乌中的二苯乙烯苷、大黄素，荷叶中的荷叶碱、槲皮素作为多指标成分定量分析方法的指标成分，而山楂在血脂宁复方中用量相对最小，且指纹图谱中山楂成分未获得确认，因此综合考量未选取来源于山楂的化学成分作为指标成分。
中药复方中化学成分复杂，质量控制中指标成分选取应首先考虑已明确的药效活性成分，以保证提取物的有效性，多项研究表明荷叶碱、二苯乙烯苷、红镰霉素-龙胆二糖苷、槲皮素、橙黄决明素和大黄素均具有一定的降血脂活性，因此选取以上成分作为血脂宁定量分析方法的指标以保证提取物的降血脂活性。
2.2血脂宁多指标成分定量分析方法
2.2.1色谱条件的优化
复方血脂宁由四味药材组成，化学成分复杂多样，值得一提的是决明子药材中所含成分同分异构体较多，性质相近，为了提高分析的灵敏度，使色谱峰达到良好的分离效果，本实验采用有机溶剂消耗少、分析效率高的UPLC建立分析方法，试验中对色谱柱、柱温、流动相等条件进行了考察和优化，以甲醇-0.1％甲酸水系统为流动相，0～20分钟内将甲醇比例由10％升至90％，柱温45℃，如图13～14所示，对Acquity UPLC BEH shield RP18(2.1×100mm,1.7μm)、Acquity UPLC BEH C18(3.0×100mm,1.7μm)两种色谱柱进行比较，结果表明，使用Acquity UPLC BEH shield RP18(2.1×100mm,1.7μm)，各色谱峰分离情况且峰形较好；如图14～15所示，对流动相中甲醇的初始比例进行比较，分别采用5％甲醇以及10％甲醇进行考察，采用10％甲醇的初始比例可节省分析时间；如图16～18所示，通过对40℃、45℃、50℃柱温的考察，在柱温45℃下，分离效果较为理想；在280nm下检测到的色谱峰最多，反映的成分信息更为全面，因此选用280nm作为定性的检测波长，最终选取图14所示的色谱初始条件并通过优化流动相梯度洗脱比例，确定复方血脂宁的分析方法，定量分析方法根据所选定的指标成分，分别选择254、280和320nm三个波长，保证活性指标成分含量准确测定。
2.2.2色谱条件的确定
色谱柱：Acquity UPLC BEH shield RP18(2.1×100mm,1.7μm)；流动相：甲醇(A)–0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱程序见下表12；流速：0.2mL/min；柱温：45℃；检测波长：254、280、320nm；分析时间：40min；进样量3μL，如图19～24，图中1为荷叶碱，2为二苯乙烯苷，3为红镰霉素-龙胆二糖苷，4为槲皮素，5为橙黄决明素，6为大黄素。
表12梯度洗脱表
2.2.3样品溶液制备
对照品溶液制备选取活性成分荷叶碱、二苯乙烯苷、红镰霉素-龙胆二糖苷、槲皮素、橙黄决明素、大黄素对照品适量，精密称定，分别置10mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，制得对照品溶液。
供试品溶液制备精密量取1mL提取液，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，超声30min，10000r·min-1离心10min，上清液经0.22μm滤膜过滤，收集续滤液即为供试品溶液。
2.2.4方法学验证
标准曲线绘制精密量取荷叶碱、二苯乙烯苷、红镰霉素-龙胆二糖苷、槲皮素、橙黄决明素以及大黄素对照品溶液适量，逐级稀释，分别配成一系列浓度的对照品溶液，取上述系列对照品溶液3μL进样分析，分别于波长254nm(槲皮素)、280nm(荷叶碱、红镰霉素-龙胆二糖苷、橙黄决明素、大黄素)、320nm(二苯乙烯苷)下测定并记录峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，浓度(X)为横坐标，求得的回归方程，结果见表13。
表13标准曲线、定量限和检测限
精密度试验取荷叶碱、二苯乙烯苷、红镰霉素-龙胆二糖苷、槲皮素、橙黄决明素以及大黄素对照品混合溶液，按“2.2.2”项下色谱条件，连续进样测定6次，测定峰面积，计算RSD值均小于1.43％，表明该色谱方法精密度良好。结果见表14。
表14精密度试验结果
重复性试验取同一批样品，平行配制6份供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件，测定各成分的峰面积，计算RSD均小于1.85％，表明该色谱方法重复性良好。结果见表15。
表15重复性试验结果(μg·mL-1)
稳定性试验取一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、18、24h进样，按“2.2.2”项下色谱条件，测定各成分的峰面积，计算RSD均小于1.88％，表明供试品溶液室温放置24h基本稳定，结果见表16。
表16稳定性试验结果(μg·mL-1)
加样回收率试验取已知含量的样品，分别加入荷叶碱、二苯乙烯苷、红镰霉素-龙胆二糖苷、槲皮素、橙黄决明素、大黄素对照品储备液适量，按样品制备方法制得供试品溶液6份，进样分析，计算各成分的平均加样回率为99.39％～101.19％，RSD(％)<1.36％，表明测定方法加样回收率符合试验要求。结果见表17。
表17加样回收率试验结果
2.2.5样品测定
分别按照血脂宁处方称取复方药材3份，以传统水提和β-CD提取复方按照实施例1中“2.1.2”制备供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件，测定各成分含量，如表18所示。
表18指标成分含量测定结果
注：**表示与传统水提工艺相比有显著性差异，P<0.01
统计学分析表明，β-环糊精提取血脂宁与传统水提方法比较，指标成分荷叶碱、二苯乙烯苷、红镰霉素-龙胆二糖苷、槲皮素、橙黄决明素、大黄素提取率显著提高(P<0.01)。提取率提高程度不同也表明了β-环糊精的分子选择性，同时通过本发明建立的复方血脂宁提取物的活性定量分析方法能够对β-环糊精提取血脂宁与传统水提血脂宁同时进行定量分析测定。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.复方血脂宁提取物指纹图谱的建立方法，其特征在于采用高效液相色谱法，包括如下步骤：
取二苯乙烯苷对照品，加甲醇溶解，定容，作为供试品溶液；
按照复方血脂宁处方量称取药材，用水或者β-环糊精水溶液提取，定容，作为供试品溶液；
采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以体积分数100％甲醇为A相，体积分数0.1％甲酸为B相，组成流动相，采用梯度洗脱，柱温为45℃，检测波长为280nm，流速为0.2mL/min，分析时间为40min；
采用进样量为3μL注入高效液相色谱仪，得到所述指纹图谱。
2.如权利要求1所述的复方血脂宁提取物指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：
0分钟时，流动相A为10％的甲醇溶液，流动相B为90％的甲酸溶液；
2分钟时，流动相A为25％的甲醇溶液，流动相B为75％的甲酸溶液；
9分钟时，流动相A为35％的甲醇溶液，流动相B为65％的甲酸溶液；
12分钟时，流动相A为40％的甲醇溶液，流动相B为60％的甲酸溶液；
40分钟时，流动相A为90％的甲醇溶液，流动相B为10％的甲酸溶液；
所述柱温为45℃；所述流速：0.2mL/min；所述进样量：3μL。
3.如权利要求1或2所述的复方血脂宁提取物指纹图谱的建立方法，其特征在于，用水提取复方血脂宁物制备工艺包括：按照处方量复方血脂宁分别称取决明子3g，制首乌2g，荷叶1.5g，山楂1g，加入25倍量水，浸泡1小时，提取3次，每次2小时，提取液过滤后合并，得到复方血脂宁水提取供试液。
4.如权利要求3所述的复方血脂宁提取物指纹图谱的建立方法，其特征在于，用β-环糊精提取血脂宁物制备工艺包括：按照处方量复方血脂宁分别称取决明子3g，制首乌2g，荷叶1.5g，山楂1g，加入占药材量5％β-环糊精，25倍量水，浸泡1小时，提取3次，每次2小时，提取液过滤后合并，得到所述复方血脂宁β-环糊精提取供试液。
5.如权利要求1、2或4所述的复方血脂宁提取物指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述指纹图谱包括34个共有指纹峰，相对保留时间分别为：
1号峰：0.52；2号峰：0.57；3号峰：0.61；4号峰：0.66；5号峰：0.89；6号峰：0.97；7号峰：1.00；8号峰：1.03；9号峰：1.13；10号峰：1.22；11号峰：1.26；12号峰：1.32；13号峰：1.35；14号峰：1.37；15号峰：1.46；16号峰：1.65；17号峰：1.68；18号峰：1.80；19号峰：1.83；20号峰：1.86；21号峰：1.88；22号峰：1.91；23号峰：2.06；24号峰：2.16；25号峰：2.21；26号峰：2.50；27号峰：2.67；28号峰：2.78；29号峰：2.87；30号峰：2.92；31号峰：2.96；32号峰：3.26；33号峰：3.53；34号峰：3.69。
6.复方血脂宁提取物的活性成分定量分析方法，其特征在于，包括：
选取多组处方量复方血脂宁，分别制备血脂宁水提取物以及血脂宁β-环糊精提取物，根据得到所述血脂宁水提取物以及所述血脂宁β-环糊精提取物的指纹图谱，确定34个共有指纹峰，对所述共有指纹峰进行药材归属以及对所述共有峰进行成分确定，在确定的成分中选取多个活性指标成分，建立复方血脂宁多指标成分定量分析方法；
其中，所述活性指标成分包括荷叶碱、二苯乙烯苷、红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷、槲皮素、橙黄决明素、大黄素。
7.如权利要求6所述的复方血脂宁提取物的活性成分定量分析方法，其特征在于，建立复方血脂宁多指标成分定量分析方法包括如下步骤：
取荷叶碱、二苯乙烯苷、红镰霉素-龙胆二糖苷、槲皮素、橙黄决明素、大黄素对照品，加甲醇溶解并定容，作为对照品溶液；
量取血脂宁提取物，加甲醇定容，摇匀，超声，离心，上清液经滤膜过滤，收集续滤液，作为供试品溶液；
采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以体积分数100％甲醇为A相，体积分数0.1％甲酸为B相，组成流动相，采用梯度洗脱，柱温为40℃～50℃，检测波长为254nm～320nm，流速为0.2mL/min，分析时间为40min。
8.如权利要求7所述的复方血脂宁提取物的活性成分定量分析方法，其特征在于，采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以体积分数100％甲醇为A相，体积分数0.1％甲酸为B相，组成流动相，采用梯度洗脱，柱温为45℃，检测波长为254nm、280nm、320nm，流速为0.2mL/min，分析时间为40min，进样量为3μL；以及
所述梯度洗脱的洗脱程序如下：
0分钟时，流动相A为10％的甲醇溶液，流动相B为90％的甲酸溶液；
2分钟时，流动相A为25％的甲醇溶液，流动相B为75％的甲酸溶液；
9分钟时，流动相A为35％的甲醇溶液，流动相B为65％的甲酸溶液；
12分钟时，流动相A为40％的甲醇溶液，流动相B为60％的甲酸溶液；
40分钟时，流动相A为90％的甲醇溶液，流动相B为10％的甲酸溶液。
9.如权利要求6-8中任一项所述的复方血脂宁提取物的活性成分定量分析方法，其特征在于，所述血脂宁水提取物制备工艺包括：按照处方量复方血脂宁分别称取决明子3g，制首乌2g，荷叶1.5g，山楂1g，加入25倍量水，浸泡1小时，提取3次，每次2小时，提取液过滤后合并，得到所述血脂宁水提取物；所述血脂宁β-环糊精提取物制备工艺包括：按照处方量复方血脂宁分别称取决明子3g，制首乌2g，荷叶1.5g，山楂1g，加入占药材量5％β-环糊精，25倍量水，浸泡1小时，提取3次，每次2小时，提取液过滤后合并，得到所述血脂宁β-环糊精提取物。
10.如权利要求9所述的复方血脂宁提取物的活性成分定量分析方法，其特征在于，对所述共有峰进行药材归属包括如下步骤：
步骤a、分别称取处方量阴性决明子复方、阴性制首乌复方、阴性荷叶复方、阴性山楂复方，并且分别制备水提取物以及β-环糊精提取物；
步骤b、分别建立所述水提取物以及所述β-环糊精提取物的指纹图谱，其与34个共有指纹峰进行比对；
步骤c、确定27个指纹峰归属于决明子，4个指纹峰归属于制首乌，4个指纹峰归属于荷叶，1个指纹峰归属于山楂。
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