CN111487343A - 一种保元汤制剂指纹图谱的建立方法 - Google Patents

一种保元汤制剂指纹图谱的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种保元汤制剂指纹图谱的建立方法，采用UPLC‑DAD‑ELSD法，按照下述条件进行检测：色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；DAD检测器串联ELSD检测器，检测波长258‑262nm；流动相A：乙腈，流动相B为醋酸铵缓冲溶液，梯度洗脱。本发明提供的方法，能够一次测定得到指纹图谱，且该方法建立的指纹图谱所提供的化学信息丰富，通过DAD检测到41个共有峰，ELSD检测到19个共有峰，归属了12个已知峰，能够全面的反应保元汤的特性，具有良好的专属性，为保元汤制剂的质量控制提供依据，具有良好的实用性。

Description

一种保元汤制剂指纹图谱的建立方法
技术领域
本发明涉及药物检测技术领域，尤其涉及一种保元汤制剂指纹图谱的建立方法。
背景技术
中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。它可以较全面地反映药材所含化学成分的种类和数量，有效地体现中药成分的整体性和综合作用，以其快速、准确等特点已被广泛运用于中药分析鉴定和质量控制等方面。
保元汤出自明孙志宏编纂的《简明医彀》(1629年)，是古代经典名方，主“元气虚弱，精神倦怠，肌肉柔慢，饮食少进，面青
Figure BDA0002465825240000011
白，睡卧宁静及有杂证，皆属虚弱，宜服”，其组方由人参、黄芪、甘草、肉桂组成，煎煮时加生姜一片。作为中医药传承与发展过程中保留下来的中药方剂杰出代表之一，在现代临床上有着广泛的应用，主要用于冠心病、慢性肾衰、再生障碍性贫血、乙型肝炎、白细胞减少等病证的治疗。目前，中国药典中以人参皂苷Rg1/Re、人参皂苷Rb1作为人参质控标准，以黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为黄芪质控标准，以甘草苷、甘草酸作为甘草质控标准，以桂皮醛作为肉桂质控标准。但由于保元汤药味较多，成分复杂，个别成分的定性定量分析仍难以全面反应保元汤的全面信息。此外，由于地理气候条件、采收时间和预处理方式等方面的差异，不同产区的同种中药其化学成分含量存在较大差异。因此，建立一种保元汤的指纹图谱，对于保元汤的质量控制具有十分重要的意义。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种保元汤制剂指纹图谱的建立方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
一种保元汤制剂指纹图谱的建立方法，采用UPLC-DAD-ELSD法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液和混合对照品溶液的配制：
将保元汤制剂制成供试品溶液；
取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、甘草苷、甘草酸单铵盐、芹糖异甘草苷、异甘草苷和肉桂酸对照品，用溶剂配制成混合对照品溶液；
(2)对所述混合对照品溶液和供试品溶液进行检测，色谱条件为：
色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；
DAD检测器串联ELSD检测器；
检测波长258-262nm；
流动相A：乙腈，流动相B：醋酸铵缓冲溶液；
洗脱方式为梯度洗脱。
相对于现有技术，本发明提供的保元汤制剂指纹图谱的建立方法，采用梯度洗脱的方式在一个流动相系统下，利用紫外检测器与蒸发光检测器串联技术，一次测定得到指纹图谱，通过指纹图谱即可同时检测出保元汤四味中药材中的多种成分，且该方法建立的指纹图谱所提供的化学信息丰富，通过DAD检测到41个共有峰，ELSD检测到19个共有峰，归属了12个已知峰，能够全面的反应保元汤的特性，具有良好的专属性。用本发明所提供的方法建立的保元汤的指纹图谱，能有效地表征保元汤药材的质量，有利于全面监控药材的质量，为保元汤制剂的质量控制提供依据；且该方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点，具有良好的实用性。
本发明中所述用于保元汤的原料为人参、黄芪、甘草和肉桂，附加生姜一片。
本发明所述保元汤制剂包括保元汤的液体制剂和固体制剂，所述液体制剂包括保元汤水煎液和保元汤口服液，所述保元汤固体制剂的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂等。
可选的，混合对照品溶液配制中所用溶剂可为甲醇或乙醇，优选为甲醇。
优选的，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：
0-5min，5％流动相A，95％流动相B；
5-6min，5％→7％流动相A，95％→93％流动相B；
6-16min，7％→23.5％流动相A，93％→76.5％流动相B；
16-24min，23.5％流动相A，76.5％流动相B；
24-26min，23.5％→26％流动相A，76.5％→74％流动相B；
26-30min，26％→32％流动相A，74％→68％流动相B；
30-37.5min，32％→52％流动相A，68％→48％流动相B；
37.5-40min，52％→90％流动相A，48％→10％流动相B；
40-44min，90％流动相A，10％流动相B；
44-46min，90％→50％流动相A，10％→40％流动相B。
优选的梯度洗脱顺序，有利于提高各组分之间的分离度，提高检测的灵敏度。
优选的，ELSD检测器的条件为：雾化器温度为38-42℃，漂移管温度为58-62℃，载气流速为1.5-1.7L/min。
更优选的，ELSD检测器的条件为：雾化器温度为40℃，漂移管温度为60℃，载气流速为1.6L/min。
优选的蒸发管检测器的参数设置有利于提高检测的灵敏度，提高各组分之间的分离度。
优选的，所述醋酸铵缓冲液的浓度为0.8-1.2mmol/L，pH为4.3-4.7。
更优选的，所述醋酸铵缓冲液的浓度为1.0mmol/L，pH为4.5。
优选的流动相的浓度、pH值，可以减少谱带拖尾，改善峰形，从而有利于提高各组分之间的分离度。
优选的，流速为0.4-0.6mL/min，柱温为25-35℃。
更优选的，流速为0.5mL/min，柱温为30℃，进样体积为5μL。
优选的流速和柱温，有利于进一步提高各组分之间的分离度。
优选的，检测波长为260nm。
优选的检测波长，可尽量避免中药提取物中大量杂质对检测的干扰，提高检测的灵敏度。
优选的，所述色谱柱的规格为100*4.6mm，填料直径为2.7μm。
更优选的，所述色谱柱为Agilent Proshell 120EC-C18。
优选的色谱柱规格、型号可以使各组分峰形、分离度及检测的灵敏度俱佳，且基线干扰较小。
优选的，所述供试品溶液的配制包括如下步骤：
精密量取所述保元汤液体制剂或保元汤固体制剂的水溶液，加入无水乙醇，涡旋，离心，取上清液蒸干后，甲醇溶解定容，过滤，得供试品溶液。
优选的，无水乙醇的加入量为量取保元汤液体制剂或保元汤固体制剂的水溶液体积的5.8-6.2倍，将上清液蒸干后，用甲醇定容至2mL。
保元汤水煎液的制备方法步骤如下：将人参3.75g、黄芪7.5g、甘草1.85g和肉桂0.75g混匀，附加生姜1片，加入8-12倍量的水浸泡25-35min，武火煮沸，文火煎煮35-45min，过滤，60℃减压浓缩，加水定容至25mL，得保元汤水煎液。
保元汤的原料含有4-5味药材，水提液中含有大量糖类及蛋白质等成分，固体制剂中含有多种辅料，通过上述制备方法可以减少杂质的干扰，并使各检测成分的色谱峰的峰形、色谱峰的响应值及分离度良好。
优选的，所述混合对照品溶液中人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的浓度分别为200μg·mL-1；毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草酸单铵盐、肉桂酸、芒柄花苷、芒柄花素的浓度分别为250μg·mL-1；异甘草苷的浓度分别为100μg·mL-1。
优选的对照品溶液的浓度，有利于使对照品溶液中各组分的峰形更好，从而有利于进行峰归属确认。
采用现代化方法对中成药进行开发与研究具有重要意义，为中成药的质量提供一个客观、整体的评价依据。本发明采用UPLC-DAD-ELSD法对保元汤制剂进行指纹图谱的构建，有利于全面监控保元汤制剂的质量，有效保证保元汤制剂质量的稳定性、一致性和可控性，为今后对保元汤的开发和质量控制提供了参考。
附图说明
图1为实施例1中保元汤供试品溶液与混合对照品溶液在紫外260nm下的色谱图，其中，a混合对照品溶液，b保元汤供试品溶液，峰1为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰2为甘草苷，峰3为肉桂酸，峰4为芹糖异甘草苷，峰5为异甘草苷，峰6为芒柄花苷，峰7为毛蕊异黄酮，峰8甘草酸(对照品为甘草酸单铵盐)，峰9芒柄花素；
图2为实施例1中保元汤供试品溶液与混合对照品溶液在蒸发光检测器下的色谱图，其中，a混合对照品溶液，b保元汤供试品溶液，峰1为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰2为甘草苷，峰4为芹糖异甘草苷，峰7为毛蕊异黄酮，峰8甘草酸(对照品为甘草酸单铵盐)，峰9芒柄花素，峰10为人参皂苷Rg1/Re，峰11为人参皂苷Rb1；
图3为实施例1中1.6.1项下不同检测波长下的色谱图，其中，(a)203nm，(b)360nm，(c)290nm，(d)260nm；
图4为实施例3中3.1项下16批保元汤供试品溶液在紫外260nm下的色谱图，按照箭头方向，由下向上依次为S1-S16样品、对照图谱R；
图5为实施例3中3.1项下16批保元汤供试品溶液在蒸发光检测器下的色谱图，按照箭头方向，由下向上依次为S1-S16样品、对照图谱R；
图6为实施例3中3.1项下由16批保元汤供试品溶液在紫外260nm下的色谱图采用均值法自动匹配生成对照图谱R；
图7实施例3中3.1项下由16批保元汤供试品溶液在蒸发光检测器下的色谱图采用均值法自动匹配生成对照图谱R；
图8为实施例3中3.2项下保元汤供试品溶液和各单方饮品供试品溶液在在紫外260nm下的色谱图，其中，a保元汤供试品溶液；b人参饮片水煎液；c黄芪饮片水煎液；d甘草饮片水煎液；e肉桂饮片水煎液；
图9为实施例3中3.2项下保元汤供试品溶液和各单方饮品供试品溶液在在蒸发光检测器下的色谱图，其中，a保元汤供试品溶液；b人参饮片水煎液；c黄芪饮片水煎液；d甘草饮片水煎液；e肉桂饮片水煎液。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1.溶液的配制
1.1供试品溶液的配制
S1，将人参3.75g、黄芪7.5g、甘草1.85g和肉桂0.75g混匀，加入10倍量的水于陶瓷锅中浸泡30min，武火煮沸，文火保持微沸状态继续煎煮40min，趁热过滤，60℃减压浓缩，以水定容至25mL，得煎液；
S2，精密量取所述煎液1mL加入量瓶中，加入6倍体积无水乙醇，涡旋涡旋3min，12000rpm离心10min，取上清液蒸干后用甲醇定容至2mL容量瓶中，取续滤液，得供试品溶液。
1.2混合对照品溶液的配制
分别称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、甘草苷、甘草酸单铵盐、芹糖异甘草苷、异甘草苷和肉桂酸对照品适量，精密称定，加入甲醇溶解，分别制成人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的浓度分别为200μg·mL-1；毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草酸单铵盐、肉桂酸、芒柄花苷、芒柄花素的浓度分别为250μg·mL-1；异甘草苷的浓度分别为100μg·mL-1的混合对照品溶液。
1.3单味饮片供试品溶液的配制
分别取人参、黄芪、甘草或肉桂药材单独饮片，按上述供试品溶液的制备方法制备相对应单味饮片供试品溶液。
1.5超高效液相色谱(UPLC))条件：
色谱柱：AgilentProshell 120EC-C18(100mm×4.6mm，2.7μm)；
流动相：乙腈(A)-醋酸铵缓冲溶液(pH 4.5；1mmol/L)(B)；
流速：0.5mL·min-1；
柱温：30℃；
进样量：5μL；
检测波长：260nm，梯度洗脱条件见表1。
表1梯度洗脱条件
Figure BDA0002465825240000071
Figure BDA0002465825240000081
测定：精密吸取供试品溶液与混合对照品溶液各5μL注入高效液相色谱仪，照上述高效液相色谱法测定，记录色谱图，如图1、图2所示。其中，图1为UPLC-DAD的色谱图，图2为UPLC-ELSD的色谱图，其中，a为对照品溶液，b为供试品溶液；峰1为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰2为甘草苷，峰3为肉桂酸，峰4为芹糖异甘草苷，峰5为异甘草苷，峰6为芒柄花苷，峰7为毛蕊异黄酮，峰8甘草酸，峰9芒柄花素，峰10为人参皂苷Rg1/Re，峰11为人参皂苷Rb1。
注：甘草酸的对照品为甘草酸单铵盐，对应于供试品溶液中的甘草酸。
1.6色谱条件的优化
1.6.1检测波长的选择
通过203nm，260nm，360nm，290nm 4个检测波长的比较分析，260nm检测波长能较全面的反映保元汤中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，所以选择260nm为保元汤指纹图谱测定波长，其他各色谱条件与1.5超高效液相色谱(UPLC))条件项下相同。各波长下的色谱图见图3。
1.6.2流动相的选择
使用AgilentProshell 120EC-C18(100mm×4.6mm，2.7μm)色谱柱比较了乙腈-0.1％甲酸溶液、乙腈-1mmol/L醋酸铵溶液对本品指纹图谱的影响。结果表明，上述流动相系统所得指纹图谱中乙腈-醋酸铵系统分离情况和峰形较好，因此保元汤指纹图谱流动相选择乙腈-1mmol/L醋酸铵溶液。检测条件除了流动相，其他各色谱条件与1.5超高效液相色谱(UPLC))条件项下相同。
实施例2
方法学验证：
精密度、重复性和稳定性试验
精密度：取1.1项下配制的供试品溶液，按上述高效液相色谱条件测定，连续进样6次，UPLC-DAD/ELSD指纹图谱中260nm下以保留时间31.32min处色谱峰作为参照峰，ELSD下以保留时间31.42min处色谱峰作为参照峰，以各主要色谱峰的相对峰面积及相对保留时间的RSD值来评价精密度。
重复性：取同一批次保元汤供试品溶液，按1.1项下供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液，按上述高效液相色谱条件测定，UPLC-DAD/ELSD指纹图谱中260nm下以保留时间31.32min处色谱峰作为参照峰，ELSD下以保留时间31.42min处色谱峰作为参照峰，以各主要色谱峰的相对峰面积及相对保留时间的RSD值来评价重复性。
稳定性：取同一批次保元汤供试品溶液，按1.1项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液6份，按上述高效液相色谱条件测定，UPLC-DAD/ELSD指纹图谱中260nm下以保留时间31.32min处色谱峰作为参照峰，ELSD下以保留时间31.42min处色谱峰作为参照峰，以各主要色谱峰的相对峰面积及相对保留时间的RSD值来评价供试液稳定性。UPLC-DAD的结果见表2，ELSD的结果见表3。
上述各项方法学验证选取了响应较高、保留时间适当、分离度较好的色谱峰(DAD选择了27个色谱峰；ELSD选取了14个色谱峰)作为代表进行了方法学验证。选择的上述色谱峰可以很好地代表DAD检测出的41个色谱峰和ELSD的19个色谱峰，完全可以证明本发明提供的保元汤指纹图谱构建方法的可靠性。
表2 UPLC-DAD指纹图谱方法学考察结果(n＝6)
Figure BDA0002465825240000101
表3 UPLC-ELSD指纹图谱方法学考察结果(n＝6)
Figure BDA0002465825240000111
注：
Figure BDA0002465825240000112
平均相对峰面积；
Figure BDA0002465825240000113
平均相对保留时间
结果表明，分别测得260nm、ELSD下各主要色谱峰相对峰面积RSD均小于3％、4％，相对保留时间RSD均小于1％、1％，表明仪器精密度良好。分别测得260nm、ELSD下各主要色谱峰相对峰面积RSD均小于3％、4％，相对保留时间RSD均小于1％、1％，表明方法重复性较好。分别测得260nm、ELSD下各主要色谱峰相对峰面积RSD均小于3％、4％，相对保留时间RSD均小于1％、1％，表明保元汤供试品溶液在12h内稳定。
实施例3
3.1共有峰的确定：
取16批保元汤原料，将组方中每味药饮片根据批次不同按随机组合原则组合成16批次(记为S1-S16)，其中1-13批次采用SPSS软件进行随机组合，14、15批次则根据各饮片含量测定结果(中国药典测试方法)，将每味药饮片含量测定最高的批次组合为第14批次，最低的批次组合为第15批次；称取等量的每批次各单味药饮片，将其混匀，再将混匀所得的各单味药饮片组合为第16批次，组合情况见表4。
表4单味饮片随机组合情况
Figure BDA0002465825240000121
按实施例1，1.1项下供试品溶液的制备操作制备供试品溶液，按照上述超高效液相色谱条件进样检测，不同批次的保元汤的指纹图谱如图4、图5所示。
将UPLC-DAD 260nm下以保留时间31.32min处色谱峰(37号峰)作为参照峰，确定了41个峰，如图4所示。将16批保元汤的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版相似度软件，采用均值法自动匹配生成对照图谱R，如图6所示。16批样品于对照指纹图谱的相似度数据如表5所示。
表5 16批次供试品溶液UPLC-DAD指纹图谱相似度比较
Figure BDA0002465825240000131
UPLC-ELSD下以保留时间31.42min处色谱峰(13号峰)作为参照峰，确定了19个峰，如图5所示。将16批保元汤的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版相似度软件，采用均值法自动匹配生成对照图谱R，如图7所示。16批样品于对照指纹图谱的相似度数据如表6所示。
表6 16批次供试品溶液UPLC-ELSD指纹图谱相似度比较
Figure BDA0002465825240000132
由上表可以看出，16批次保元汤供试品溶液的指纹图谱与对照指纹图谱相比较，DAD 260nm下相似度均不低于0.888，批次间相似度在0.853-0.948之间；ELSD下相似度均不低于0.888，批次间相似度在0.777-0.903之间，说明各批次样品质量具有较好的一致性。
3.2保元汤的指纹图谱成分来源分析
分别将保元汤供试品溶液、人参饮片水煎液、黄芪饮片水煎液、甘草饮片水煎液和肉桂饮片水煎液，按照上述色谱条件进行检测，UPLC-DAD的色谱图如图8所示，对DAD下的41个共有峰可能的来源进行了归属，结果如表7所示。
表7 16批保元汤供试品溶液的UPLC-DAD共有指纹峰指标参数
Figure BDA0002465825240000141
UPLC-ELSD的色谱图如图9所示，对ELSD下的19个共有峰可能的来源进行了归属，结果如表8所示。
表8
Figure BDA0002465825240000151
注：“—”表示未归属成分。
从结果可以看出，UPLC-DAD下以37号峰作为参照，样品间的共有峰保留时间差异较小，但峰面积却有一定差异；UPLC-ELSD下以19号峰作为参照，样品间的共有峰保留时间差异较小，但峰面积却有一定差异。表明不同批次样品部分化学成分含量有所不同。
采用本发明提供的检测方法也可实现对保元汤口服液和保元汤固体制剂指纹图谱的构建方法，所得指纹图谱与上述保元汤水煎液的指纹图谱相同。
综上所述，本发明建立的UPLC-DAD/ELSD保元汤水煎液指纹图谱的相似度均在0.88以上，16批次保元汤水煎液质量较为一致，并且操作简便，有较好的重复性和专属性，可以用于保元汤的质量控制。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种保元汤制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，采用UPLC-DAD-ELSD法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液和混合对照品溶液的配制：
取保元汤制剂制成供试品溶液；
取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、甘草苷、甘草酸单铵盐、芹糖异甘草苷、异甘草苷和肉桂酸对照品，用溶剂配制成混合对照品溶液；
(2)对所述混合对照品溶液和供试品溶液进行检测，色谱条件为：
色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；
检测器：DAD检测器串联ELSD检测器；
检测波长：258-262nm；
流动相A：乙腈，流动相B：醋酸铵缓冲溶液；
洗脱方式为梯度洗脱。
2.如权利要求1所述的保元汤制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：
0-5min，5％流动相A，95％流动相B；
5-6min，5％→7％流动相A，95％→93％流动相B；
6-16min，7％→23.5％流动相A，93％→76.5％流动相B；
16-24min，23.5％流动相A，76.5％流动相B；
24-26min，23.5％→26％流动相A，76.5％→74％流动相B；
26-30min，26％→32％流动相A，74％→68％流动相B；
30-37.5min，32％→52％流动相A，68％→48％流动相B；
37.5-40min，52％→90％流动相A，48％→10％流动相B；
40-44min，90％流动相A，10％流动相B；
44-46min，90％→50％流动相A，10％→40％流动相B。
3.如权利要求1所述的保元汤制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，ELSD检测器的条件为：雾化器温度为38-42℃，漂移管温度为58-62℃，载气流速为1.5-1.7L/min。
4.如权利要求3所述的保元汤制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，ELSD检测器的条件为：雾化器温度为40℃，漂移管温度为60℃，载气流速为1.6L/min。
5.如权利要求1所述的保元汤制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述醋酸铵缓冲液的浓度为0.8-1.2mmol/L，pH为4.3-4.7，流速为0.4-0.6mL/min，柱温为25-35℃。
6.如权利要求1或5所述的保元汤制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述醋酸铵缓冲液的浓度为1.0mmol/L，pH为4.5，流速为0.5mL/min，柱温为30℃，进样体积为5μL。
7.如权利要求1所述的保元汤制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，检测波长为260nm。
8.如权利要求1所述的保元汤制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为100*4.6mm，填料直径为2.7μm。
9.如权利要求8所述的保元汤制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述色谱柱为Agilent Proshell 120 EC-C18。
10.如权利要求1所述的保元汤制剂指纹图谱的建立方法，所述保元汤制剂包括保元汤液体制剂和保元汤固体制剂，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括如下步骤：
精密量取所述保元汤液体制剂或保元汤固体制剂的水溶液，加入无水乙醇，涡旋，离心，取上清液蒸干后，甲醇稀释定容，过滤，得供试品溶液。
11.如权利要求1所述的保元汤制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述混合对照品溶液中人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的浓度分别为200μg·mL-1；毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草酸单铵盐、肉桂酸、芒柄花苷、芒柄花素的浓度分别为250μg·mL-1；异甘草苷的浓度分别为100μg·mL-1。
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