CN105806975B - 一种银翘散uplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents
一种银翘散uplc指纹图谱的建立方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种银翘散UPLC指纹图谱的建立方法。该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣，具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；用该方法还能较为全面地反映银翘散中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价，可将银翘散质量与其药效真正结合起来，有助于阐明其作用机理为本银翘散的技术提升与深度开发提供了依据。且用该方法检测到的银翘散指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。
Description
技术领域
本发明涉及一种银翘散UPLC指纹图谱的建立方法，属于药品技术的领域。
背景技术
银翘散出自于清·吴塘(鞠通)所著的《温病条辨》一书中。具有辛凉解表、清热解毒的功效，丰治风温初起，当时以治疗风温、温热病以及某些杂病属于邪在卫分、上焦而闻名，并一直沿用至今,是中医临床上广泛使用并且疗效确切的中药方剂之一。银翘散的处方组成：君：银花、连翘.辛凉透表，清热解毒，芳香避秽；臣：薄荷、牛蒡子.味辛而性凉，疏散风热清利头目，解毒利咽；荆芥、淡豆豉.辛而微温，助君药发散表邪，透热外出；佐：芦根、淡竹叶.清热生津止渴；桔梗.宣肺止咳化痰；使：甘草一调和诸药，护胃安中。
银翘散由传统中药古方发展而来，受当时科研水平限制，其质量标准起点较低，对药理药效等基础研究较为有限。为进一步探索其作用机理与药用基础，确保产品安全有效、质量可控，迫切需要运用现代医药科研手段对本产品进行质量标准的提升与药理药效实验研究。
中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。目前，尚无银翘散超高液指纹图谱研究工作的报道。
发明内容
本发明目的在于，提供一种银翘散UPLC指纹图谱的建立方法。该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣，具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；用该方法还能较为全面地反映银翘散中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价，可将银翘散质量与其药效真正结合起来，有助于阐明其作用机理为本银翘散的技术提升与深度开发提供了依据。且用该方法检测到的银翘散指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：一种银翘散UPLC指纹图谱的建立方法，所述银翘散按照重量组份计算，主要由金银花100份、连翘100份、桔梗60份、薄荷60份、淡豆鼓50份、淡竹叶40份、牛蒡子60份、荆芥40份、芦根100份和甘草40份按照下述方法制备而成：根据配方称取各药物，粉碎成细粉，过筛，混匀，即得；
所述UPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
1、混合对照品溶液的制备：称取绿原酸、连翘苷、甘草苷、牛蒡苷、橙皮苷置于25mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成绿原酸10-18μg/ml、连翘苷5-15μg/ml、甘草苷8-18μg/ml、牛蒡苷15-25μg/ml、橙皮苷6-18μg/ml的混合对照品溶液；
2、供试品溶液的制备：精密称取银翘散样品，加入浓度为75-85％的甲醇，称定质量，回流提取,放冷，再称定质量，用浓度为75-85％的甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得；
3、指纹图谱的制作：色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相：0.2％磷酸水溶液(A)-乙腈：甲醇(1:1)(B)，梯度洗脱，洗脱程序为：0～1min，7％～8％(B)；1～5.56min，8％～12％(B)；5.56～6.95min，12％～17％(B)；6.95～12.5min，17％～25％(B)；12.5～19.05min，25％～31％(B)；19.05～25min，31％～55％(B)；流速0.3ml/min，检测波长200-260nm，柱温40℃，进样量1μL；记录谱图得到银翘散的UPLC指纹图谱；
4、标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次银翘散建立了UPLC指纹图谱，通过分析比较确定了28个共有峰，这些共有峰构成了银翘散的指纹特征，作为银翘散的标准指纹图谱。
前述的银翘散UPLC指纹图谱的建立方法中，所述混合对照品溶液这样制备：称取绿原酸0.37mg、连翘苷0.29mg、甘草苷0.34mg、牛蒡苷0.48mg、橙皮苷0.32mg置于25mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得绿原酸14.8μg/ml、连翘苷11.6μg/ml、甘草苷13.6μg/ml、牛蒡苷19.2μg/ml、橙皮苷12.8μg/ml的混合对照品溶液。
前述的银翘散UPLC指纹图谱的建立方法中，所述供试品溶液这样制备：精密称取银翘散样品6.5g，加入80％甲醇100mL，称定质量，回流提取1h,放冷，再称定质量，用80％甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得。
前述的银翘散UPLC指纹图谱的建立方法中，所述检测波长为230nm。
前述的银翘散UPLC指纹图谱的建立方法中，所述28个共有峰，以22号峰牛蒡苷为参照峰，其相对保留时间分别为0.045，0.056,0.068,0.165，0.255，0.281，0.305，0.324，0.356，0.518，0.526，0.536，0.587，0.606，0.628，0.683，0.703，0.795，0.811，0.946，0.972，1.000，1.011，1.124，1.186，1.202，1.261，1.267。
发明人进行了大量的实验，以下是本发明所述检测方法的研究
实验例：检测方法研究
1仪器与试药
Waters ACQUITY I Class高效液相色谱仪(在线脱气机、自动进样器、柱温箱、UV检测器)，SG8200H超声仪(上海冠特超声仪器有限公司)，AB104-N电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，PHS-25B型酸度计(上海大谱仪器有限公司)。绿原酸(批号：110753-201415)连翘苷(批号110821-201514)牛蒡苷(批号120903-201109)橙皮苷(批号110721-201316)甘草苷(批号111610-201106)；甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯；银翘散由贵州德昌祥药业有限公司提供(批号：20150102、20150429、20130306、20141109、20140340、20140601、20150540、20140908、20131147、20150231)
2色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相：0.2％磷酸水溶液(A)-乙腈：甲醇(1:1)(B)，梯度洗脱，0～1min，7％～8％(B)；1～5.56min，8％～12％(B)；5.56～6.95min，12％～17％(B)；6.95～12.5min，17％～25％(B)；12.5～19.05min，25％～31％(B)；19.05～25min，31％～55％(B)；流速0.3ml/min，检测波长230nm，柱温40℃，进样量1μL。
3银翘散指纹图谱的测定
3.1银翘散指纹图谱的确立
(1)混合对照品溶液的制备：称取绿原酸0.37mg、连翘苷0.29mg、甘草苷0.34mg、牛蒡苷0.48mg、橙皮苷0.32mg置于25mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得绿原酸14.8ug/ml、连翘苷11.6ug/ml、甘草苷13.6ug/ml、牛蒡苷19.2ug/ml、橙皮苷12.8ug/ml的混合对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备：精密称取银翘散样品6.5g，加入80％甲醇100mL，称定质量，回流提取1h,放冷，再称定质量，用80％甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得。
(3)标准指纹图谱的测定：精密吸取供试品溶液，按照步骤2项下色谱条件进行洗脱，记录谱图得到银翘散UPLC标准指纹图谱，见图1。
3.2共有峰的确定
通过比较10批银翘散的色谱图，确定共有28个共有峰，其中6号峰为绿原酸，13号峰为甘草苷，18号峰为橙皮苷，22号峰为牛蒡苷，23号峰为连翘苷，并以22号峰为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见图2、图6、表1、表2。
表1 10批银翘散指纹图谱共有峰的相对保留时间
表2 10批银翘散指纹图谱共有峰的相对峰面积
4.稳定性试验：取同一供试品，分别在0,2,4,8,16,24h进样，结果见图3，结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，表明供试品溶液在24h内稳定。
5.精密度实验：取同一供试品，连续进样6次，测得的结果见图4，结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3％，结果表明本方法精密度良好，符合指纹图谱测定要求。
6.重复性试验：取同一批号(20150102)的样品，平行制备6份供试品溶液，进行测定，结果见图5，结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，表明该方法重复性良好。
7.指纹图谱的相似度评价
应用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)”对10批银翘散进行评价。本发明专利中的各共有峰与对照指纹图谱相对比相似度均大于0.9，说明10批指纹图谱的色谱峰整体上基本一致。结果见图2，表3。
表3 10批银翘散的相似度结果
以上试验表明，该测定方法稳定可靠，指纹图谱相对稳定，可以用于控制银翘散的质量。
与现有技术相比，本发明方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣，具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；用该方法还能较为全面地反映银翘散中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价，可将银翘散质量与其药效真正结合起来，有助于阐明其作用机理，为本银翘散的技术提升与深度开发提供了依据。且用该方法检测到的银翘散指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。
附图说明
图1是本发明银翘散UPLC标准指纹图谱；
图2是本发明的10批银翘散样品的UPLC指纹图谱；
图3是稳定性试验指纹图谱的叠加图；
图4是精密度试验指纹图谱的叠加图；
图5是重复性试验指纹图谱的叠加图；
图6是本发明的银翘散指纹图谱与混合对照品色谱图。
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实施例1：
一种银翘散UPLC指纹图谱的建立方法，
银翘散处方：金银花100g、连翘100g、桔梗60g、薄荷60g、淡豆鼓50g、淡竹叶40g、牛蒡子60g、荆芥40g、芦根100g和甘草40g。
制作方法：根据配方称取各药物，粉碎成细粉，过筛，混匀，即得。
所述UPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
1、混合对照品溶液的制备：称取绿原酸0.37mg、连翘苷0.29mg、甘草苷0.34mg、牛蒡苷0.48mg、橙皮苷0.32mg置于25mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得绿原酸14.8μg/ml、连翘苷11.6μg/ml、甘草苷13.6μg/ml、牛蒡苷19.2μg/ml、橙皮苷12.8μg/ml的混合对照品溶液；
2、供试品溶液的制备：精密称取银翘散样品6.5g，加入80％甲醇100mL，称定质量，回流提取1h,放冷，再称定质量，用80％甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得；
3、指纹图谱的制作：色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相：0.2％磷酸水溶液(A)-乙腈：甲醇(1:1)(B)，梯度洗脱，洗脱程序为：0～1min，7％～8％(B)；1～5.56min，8％～12％(B)；5.56～6.95min，12％～17％(B)；6.95～12.5min，17％～25％(B)；12.5～19.05min，25％～31％(B)；19.05～25min，31％～55％(B)；流速0.3ml/min，检测波长230nm，柱温40℃，进样量1μL；记录谱图得到银翘散的UPLC指纹图谱；
4、标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次银翘散建立了UPLC指纹图谱，通过分析比较确定了28个共有峰，这些共有峰构成了银翘散的指纹特征，作为银翘散的标准指纹图谱；所述28个共有峰，以22号峰牛蒡苷为参照峰，其相对保留时间分别为0.045，0.056,0.068,0.165，0.255，0.281，0.305，0.324，0.356，0.518，0.526，0.536，0.587，0.606，0.628，0.683，0.703，0.795，0.811，0.946，0.972，1.000，1.011，1.124，1.186，1.202，1.261，1.267。
Claims (4)
1.一种银翘散UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述银翘散按照重量组份计算，主要由金银花100份、连翘100份、桔梗60份、薄荷60份、淡豆鼓50份、淡竹叶40份、牛蒡子60份、荆芥40份、芦根100份和甘草40份按照下述方法制备而成：根据配方称取各药物，粉碎成细粉，过筛，混匀，即得；
所述UPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
（1）混合对照品溶液的制备：称取绿原酸、连翘苷、甘草苷、牛蒡苷、橙皮苷置于25mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成绿原酸10-18μg/ml、连翘苷5-15μg/ml、甘草苷8-18μg/ml、牛蒡苷15-25μg/ml、橙皮苷6-18μg/ml的混合对照品溶液；
（2）供试品溶液的制备：精密称取银翘散样品，加入浓度为75-85%的甲醇，称定质量，回流提取,放冷，再称定质量，用浓度为75-85%的甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得；
（3）指纹图谱的制作：色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 ，2.1mm×100mm，1.7μm；流动相：A相为：0.2%磷酸水溶液，B相为：乙腈：甲醇=1:1，梯度洗脱，洗脱程序为：0～1min，7%～8%的B相；1～5.56min，8%～12%的B相；5.56～6.95min，12%～17%的B相；6.95～12.5min，17%～25%的B相；12.5～19.05min，25%～31%的B相；19.05～25min，31%～55%的B相；流速0.3ml/min，检测波长200-260nm，柱温40℃，进样量1μL；记录谱图得到银翘散的UPLC指纹图谱；
（4）标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次银翘散建立了UPLC指纹图谱，通过分析比较确定了28个共有峰，这些共有峰构成了银翘散的指纹特征，作为银翘散的标准指纹图谱；
所述混合对照品溶液这样制备：称取绿原酸0.37mg、连翘苷0.29mg、甘草苷0.34mg、牛蒡苷0.48mg、橙皮苷0.32mg置于25mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得绿原酸14.8μg/ml、连翘苷11.6μg/ml、甘草苷13.6μg/ml、牛蒡苷19.2μg/ml、橙皮苷12.8μg/ml的混合对照品溶液。
2.如权利要求1所述的银翘散UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述供试品溶液这样制备：精密称取银翘散样品6.5g，加入80%甲醇100mL，称定质量，回流提取1h,放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得。
3.如权利要求1所述的银翘散UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述检测波长为230nm。
4.如权利要求1所述的银翘散UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述28个共有峰，以22号峰牛蒡苷为参照峰，其相对保留时间分别为0.045，0.056,0.068,0.165，0.255，0.281，0.305，0.324，0.356，0.518，0.526，0.536，0.587，0.606，0.628，0.683，0.703，0.795，0.811，0.946，0.972，1.000，1.011，1.124，1.186，1.202，1.261，1.267。
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