CN106645508B - 风热感冒颗粒hplc特征图谱的构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种风热感冒颗粒HPLC特征图谱的构建方法,包括下述步骤(1)参照物溶液的制备:精密称取牛蒡苷对照品适量,加30~70%甲醇制成每1ml含牛蒡苷60~80μg的溶液,即得。(2)供试品溶液的制备:取风热感冒颗粒,研细,取约1~3g,精密称定,(3)色谱条件:采用ZORBAX SB‑C18色谱柱;流动相为以乙腈‑0.1%磷酸溶液为5~45:95~55的混合溶液;流速为0.5~1.5ml/min;DAD检测器,检测波长为205~285nm;柱温25~45℃,理论板数均不低于10000。(4)测定:分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5~20μl,注入液相色谱仪,照高效液相色谱法测定,得到风热感冒颗粒的HPLC特征图谱,本发明的优点是能有效的监控不同批次间风寒感冒颗粒的质量,方法具有精密度高、重现性好等特点,有利于全面监控产品的质量。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及一种风热感冒颗粒HPLC特征图谱的构建方法。
背景技术
风热感冒颗粒为临床常用中药复方制剂,由板蓝根、连翘、薄荷、荆芥穗、桑叶、芦根、牛蒡子、菊花、苦杏仁、桑枝、六神曲等组成,功能主治为清温解毒,宜肺利咽。用于感冒身热,鼻塞,头痛,咳嗽,多痰。现执行标准收载于中成药部颁标准,标准编号为WS3-B-0044-89,标准中仅收载了性状、溶化性等颗粒剂常规检查项,由于质量控制水平较低,在药材投料过程中可能存在少投或以次充好现象,不能保证产品内在质量的均一和疗效的稳定,存在质量安全隐患。为了提高风热感冒颗粒药品的质量,已经对全方进行了质量检测方法研究,但因中药复方制剂中药味较多成分复杂不易分离鉴定等特点,现有技术检测均集中为薄层鉴别及含量测定单一指标的研究,仅对风热感冒颗粒处方中连翘、牛蒡子等个别药味进行了定性鉴别和定量检测,由于本品处方药味较多,难以反映样品的整体质量。
本发明中我们对风热感冒颗粒进行了HPLC特征图谱试验研究,建立了特征图谱的质量检测方法,并对所建立方法进行了精密度、重复性等方法学验证试验,结果表明本发明中检测方法稳定可行。本发明克服了风热感冒颗粒现在执行标准中缺少质量检测方法的不足,以及现有技术中检测方法指标针对性强、覆盖面小的片面性,建立起的特征图谱可全面反映风热感冒颗粒复杂的化学成分及其相对比例,是一种符合中药复方特色的质量控制模式,可有效地表征药品质量。
发明内容
本发明的目的之一是提供中成药风热感冒颗粒的HPLC特征图谱的构建方法,该方法包括以下步骤:
(1)参照物溶液的制备:精密称取牛蒡苷对照品适量,加30~70%甲醇制成每1ml含牛蒡苷60~80μg的溶液,即得。
(2)供试品溶液的制备:取风热感冒颗粒,研细,取约1~3g,精密称定,精密加入30~70%甲醇25~75ml,称定重量,超声处理15~45分钟,待溶液冷却至室温,用30~70%甲醇补足减失的重量,摇匀,用0.22~0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
(3)色谱条件:采用ZORBAX SB-C18色谱柱(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒径为5μm);流动相为以乙腈-0.1%磷酸溶液为5~45:95~55的混合溶液;流速为0.5~1.5ml/min;DAD检测器,检测波长为205~285nm;柱温25~45℃,理论板数均不低于10000。
(4)测定:分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5~20μl,注入液相色谱仪,照高效液相色谱法测定,得到风热感冒颗粒的HPLC特征图谱。
本发明的HPLC特征图谱的最佳构建方法如下:
优选地,步骤(1)所述参照物溶液浓度为每1ml含牛蒡苷对照品70μg的50%甲醇溶液。
优选地,步骤(2)所述供试品溶液的制备步骤如下:取风热感冒颗粒,研细,取约2g,精密称定,精密加入50%甲醇50ml,称定重量,超声处理30分钟,待溶液冷却至室温,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,用0.22~0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
优选地,步骤(3)所述流动相为以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,梯度洗脱。梯度洗脱的时间及流动相比例如表1所示:
表1风热感冒颗粒特征图谱流动相时间及梯度
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~10 | 5→5 | 95→95 |
10~20 | 5→10 | 95→90 |
20~50 | 10→20 | 90→80 |
50~65 | 20→30 | 80→70 |
65~75 | 30→45 | 70→55 |
75~77 | 45→5 | 55→95 |
本发明的另一个目的是提供风热感冒颗粒的HPLC对照特征图谱的构建方法,按照前述方法构建16批风热感冒颗粒的HPLC特征图谱,采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成由17个共有峰构成的风热感冒颗粒HPLC对照特征图谱,所述共有峰中峰3为腺苷峰,峰5为绿原酸峰,峰13为橙皮苷峰,峰15为连翘苷峰,峰16为牛蒡苷峰。
在对照特征图谱中,以牛蒡苷峰为参照峰S峰,计算各特征峰与S峰的相对保留时间,所述相对保留时间在第一规定值的±5%之内,所述第一规定值分别为:0.15-峰1、0.23-峰2、0.27-峰3、0.29-峰4、0.40-峰5、0.43-峰6、0.57-峰7、0.69-峰8、0.73-峰9、0.74-峰10、0.81-峰11、0.84-峰12、0.89-峰13、0.91-峰14、98-峰15、1.00-峰S、1.06-峰17。
取风热感冒颗粒,按上述方法操作,得到风热感冒颗粒样品特征图谱,采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对样品图谱与对照特征图谱进行分析,相似度大于0.90为合格产品。
本发明的有益效果如下:
(1)用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次风热感冒颗粒的质量,使其质量稳定,方法具有精密度高、重现性好等特点,有利于全面监控产品的质量。
(2)本发明的质量检测方法以连翘苷、牛蒡苷、绿原酸、橙皮苷、腺苷为对照,建立的风热感冒颗粒特征图谱注重各个特征峰的顺序和关系,能全面评价产品的整体质量面貌特征,方法科学可靠。
(3)本发明的最佳紫外吸收波长为245nm。采用本发明中方法用DAD检测器对风热感冒颗粒进行测定,根据三维扫描图中所有色谱峰出现最大吸收的检测波长结果分别调取各波长下色谱图,当检测波长为245nm时,特征峰数目较多,各峰面积较高且各特征峰之间分离效果也最好。
附图说明
图1是风热感冒颗粒HPLC特征图谱
图2是风热感冒颗粒16批次HPLC特征图谱叠加图
图3是风热感冒颗粒对照特征图谱
附图解释:图1中峰3为腺苷峰,峰5为绿原酸峰,峰13为橙皮苷峰,峰15为连翘苷峰,峰16为牛蒡苷峰。
具体实施方式
实施例1:建立风热感冒颗粒特征图谱构建方法
1仪器:UltiMate 3000高效液相色谱仪,紫外DAD检测器;Mettler AE240十万分之一分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);AB204-E电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)等。
2试剂:甲醇等为分析纯,磷酸、乙腈为色谱纯,水为超纯水。
2.1试药:连翘苷、牛蒡苷、绿原酸、橙皮苷、腺苷(均来自中国食品药品鉴定研究院)。
3方法与结果
3.1参照物溶液的制备:精密称取牛蒡苷对照品适量,加50%甲醇制成每1ml含牛蒡苷70μg的溶液,即得。
3.2供试品溶液的制备:取风热感冒颗粒,研细,取约2g,精密称定,精密加入50%甲醇50ml,称定重量,超声处理30分钟,待溶液冷却至室温,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
3.3色谱条件:采用ZORBAX SB-C18色谱柱(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒径为5μm);流动相为以乙腈-0.1%磷酸溶液为5-45:95-55的混合溶液;流速为1.0ml/min;DAD检测器,检测波长为245nm;柱温35℃,理论板数均不低于100000。
梯度洗脱的时间及流动相比例为:0~10min,A相:5%、B相:95%;10~20min,A相:5~10%、B相:95~90%;20~50min,A相:10~20%、B相:90~80%;50~65min,A相:20~30%、B相:80~70%;65~75min,A相:30~45%、B相:70~55%;75~77min,A相:45~5%、B相:55~95%。
3.4测定:分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,照高效液相色谱法测定,得到风热感冒颗粒的HPLC特征图谱,如图1所示。
4风热感冒颗粒特征图谱特征峰指认
取连翘苷、牛蒡苷、绿原酸、橙皮苷、腺苷对照品适量,加50%甲醇制成每1ml含连翘苷30μg、牛蒡苷70μg、绿原酸50μg、橙皮苷50μg和腺苷30μg的溶液,依法测定。通过上述对照品测定结果,对风热感冒颗粒的HPLC特征图谱进行色谱峰指认,结果:峰3为腺苷峰,峰5为绿原酸峰,峰13为橙皮苷峰,峰15为连翘苷峰,峰16为牛蒡苷峰。
5风热感冒颗粒特征图谱测定方法学考察
5.1精密度试验:取风热感冒颗粒,按步骤(2)方法制成供试品溶液,连续进样6次,依法检测。结果:6次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值均﹤2%,表明仪器精密度良好。
5.2稳定性试验:取风热感冒颗粒,按步骤(2)方法制成供试品溶液,分别在0、2、4、8、12小时依法进行检测。结果:5次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值均﹤2%,表明供试品溶液在12小时之内稳定。
5.3重复性试验:取同一批风热感冒颗粒,按步骤(2)方法制备6份供试品溶液,依法测定。结果:6次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值均﹤2%,表明方法的重复性较好。
6构建风热感冒颗粒的对照特征图谱
取风热感冒颗粒16批,按实施例1的条件进行测定,得到16批次样品HPLC特征图谱,如图2所示。采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对16批特征图谱进行比较,确定共有特征峰,生成由17个共有峰构成的对照特征图谱,如图3所示。其中参照峰为牛蒡苷峰(16号峰)。
相似度分析:计算16批供试品特征图谱与生成的对照特征图谱的相似度,结果均大于0.90。相似度比较结果见表1。
表1HPLC特征图谱相似度评价结果
样品批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
相似度 | 1 | 0.961 | 0.982 | 0.931 | 0.945 | 0.977 | 0.962 | 0.918 |
样品批次 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 |
相似度 | 0.936 | 0.964 | 0.991 | 0.987 | 0.932 | 0.958 | 0.944 | 0.969 |
7、风热感冒颗粒的质量检测方法
7.1取10批风热感冒颗粒制剂(由A、B、C、D四个不同厂家生产),按实施例1的条件进行测定,得到10批次样品的HPLC特征图谱,采用中药色谱指纹图谱相似度评价对样品特征图谱与对照特征图谱进行分析,相似度大于0.90为合格产品。
7.2检测结果为A、B、C三个厂家8批次产品为合格品,C、D厂家各1批次产品为不合格品。
综上所述,本发明所构建质量检测方法的稳定性好,精密度高,重复性好,因此本发明发案具有可行性。利用本发明质量检测方法监控所获得的中成药风热感冒颗粒,质量一致,疗效稳定。
Claims (6)
1.风热感冒颗粒HPLC特征图谱的构建方法,其特征包括下述步骤:
(1)参照物溶液的制备:精密称取牛蒡苷对照品适量,加30~70%甲醇制成每1ml含牛蒡苷60~80μg的溶液,即得;
(2)供试品溶液的制备:取风热感冒颗粒,研细,取1~3g,精密称定,精密加入30~70%甲醇25~75ml,称定重量,超声处理15~45分钟,待溶液冷却至室温,用30~70%甲醇补足减失的重量,摇匀,用0.22~0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
(3)色谱条件:采用ZORBAX SB-C18色谱柱,所述色谱柱的柱长为250mm,内径为4.6mm,粒径为5μm;流动相为以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,进行梯度洗脱,梯度洗脱的时间及流动相比例为:0~10min,A相:5%、B相:95%;10~20min,A相:5~10%、B相:95~90%;20~50min,A相:10~20%、B相:90~80%;50~65min,A相:20~30%、B相:80~70%;65~75min,A相:30~45%、B相:70~55%;75~77min,A相:45~5%、B相:55~95%;流速为0.5~1.5ml/min;DAD检测器,检测波长为205~285nm;柱温25~45℃,理论板数均不低于10000;
(4)测定:分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5~20μl,注入液相色谱仪,照高效液相色谱法测定,得到风热感冒颗粒的HPLC特征图谱。
2.根据权利要求1所述的风热感冒颗粒HPLC特征图谱的构建方法,其特征是:
步骤(1)取参照物溶液浓度为每1ml 50%甲醇溶液含牛蒡苷对照品70μg。
3.根据权利要求1所述的风热感冒颗粒HPLC特征图谱的构建方法,其特征是:
步骤(2)取风热感冒颗粒,研细,取约2g,精密称定,精密加入50%甲醇50ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,用0.22~0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
4.根据权利要求1所述的风热感冒颗粒HPLC特征图谱的构建方法,其特征是:
步骤(4)采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成由17个共有峰构成的风热感冒颗粒HPLC对照特征图谱,所述共有峰中峰3为腺苷峰,峰5为绿原酸峰,峰13为橙皮苷峰,峰15为连翘苷峰,峰16为牛蒡苷峰。
5.根据权利要求1所述的风热感冒颗粒HPLC特征图谱的构建方法,其特征是,还包括:
步骤(5)上述步骤(1)-(4)同法操作,得到的样品特征图谱,采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件与对照特征图谱进行分析,相似度大于0.90为合格产品。
6.根据权利要求5所述的风热感冒颗粒HPLC特征图谱的构建方法,其特征是对照特征图谱中,以牛蒡苷峰为参照峰S峰,计算各特征峰与S峰的相对保留时间,所述相对保留时间在第一规定值的±5%之内,所述第一规定值分别为:0.15-峰1、0.23-峰2、0.27-峰3、0.29-峰4、0.40-峰5、0.43-峰6、0.57-峰7、0.69-峰8、0.73-峰9、0.74-峰10、0.81-峰11、0.84-峰12、0.89-峰13、0.91-峰14、98-峰15、1.00-峰S、1.06-峰17。
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