CN106353430A

CN106353430A - 一种基于多指标活性成分测定的前列欣胶囊质量评价方法

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Publication number: CN106353430A
Application number: CN201610873671.8A
Authority: CN
Inventors: 赵恒强; 赵志国; 王晓; 刘倩; 于金倩; 闫慧娇; 刘伟; 耿岩玲
Original assignee: Shandong Analysis and Test Center
Current assignee: Shandong Analysis and Test Center
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2017-01-25
Anticipated expiration: 2036-09-30
Also published as: CN106353430B

Abstract

本发明公开了一种基于多指标活性成分测定的前列欣胶囊质量评价方法，其特征在于，包括基于高效液相色谱‑电喷雾飞行时间质谱技术测定前列欣胶囊中八种活性成分和构建前列欣胶囊HPLC指纹图谱；其中，所述八种活性成分分别为没食子酸、绿原酸、咖啡酸、王不留行黄酮苷、异槲皮苷、丹酚酸B、丹酚酸A和隐丹参酮。本发明同时采用高效液相色谱‑电喷雾飞行时间质谱技术测定前列欣胶囊中八种活性成分并构建前列欣胶囊HPLC指纹图谱同时用于对前列欣胶囊药品的质量评价，二者相互印证，从而更全面地反映前列欣胶囊药品的质量，有利于研究和保证前列欣胶囊药品原料及制剂的质量。

Description

一种基于多指标活性成分测定的前列欣胶囊质量评价方法

技术领域

本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种基于多指标活性成分测定的前列欣胶囊质量评价方法。

背景技术

前列欣胶囊收载于《中华人民共和国药典》2015年版(一部)，主要由桃仁(炒)、没药(炒)、丹参、赤芍、红花、泽兰、王不留行(炒)、皂角刺、败酱草、蒲公英、川楝、白芷、石韦、枸杞子等药味组成，具有活血化瘀、清热利湿的功效，临床用于治疗瘀血凝聚，湿热下注所致的慢性前列腺炎及前列腺增生的症状，疗效显著，应用广泛。

目前，2015年版《中华人民共和国药典》(一部)仅采用薄层色谱法结合对照品芍药苷和对照药材没药、白芷进行鉴别，或采用高效液相色谱法测定欧前胡素的含量，质控指标单一，不能全面反应中药方剂多成分、多靶点的特点。而目前有关前列欣胶囊化学成分分析测定的研究仅仅针对其中某一成分进行分析，如季国明等使用HPLC测定前列欣胶囊中欧前胡素的含量；伦立军等则通过HPLC法测定前列欣胶囊中芍药苷的的含量，史雪红等同样采用HPLC法测定了前列欣胶囊中丹酚酸B的含量，如前所述，这些研究仅针对前列欣胶囊中的某一成分进行检测分析，实际上根本无法反映药剂整体质量，无法满足实际生产中对成药的质量控制。

发明内容

针对以上问题，本发明提供一种基于多指标活性成分测定的前列欣胶囊质量评价方法，该方法通过高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱技术准确测定前列欣胶囊多种化学成分并结合HPLC指纹图谱技术，从而全面地对前列欣胶囊的质量进行评价，保证产品质量的稳定性及临床用药的有效性与安全性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于多指标活性成分测定的前列欣胶囊质量评价方法，包括基于高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱技术测定前列欣胶囊中八种活性成分和构建前列欣胶囊HPLC指纹图谱；其中，所述八种活性成分分别为没食子酸、绿原酸、咖啡酸、王不留行黄酮苷、异槲皮苷、丹酚酸B、丹酚酸A和隐丹参酮。

上述基于高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱技术对前列欣胶囊中八种活性成分进行测定，包括如下步骤：

(1)取出前列欣胶囊中药粉，称取一定量药粉待用；

(2)向步骤(1)中的药粉中加入100％色谱甲醇，超声提取后摇匀过滤，滤液过0.22μm微孔滤膜后得待测液；采用纯色谱甲醇作为提取溶剂时，色谱峰较多，各峰分布均匀，峰强度好；

(3)分别精密称取一定量没食子酸、绿原酸、咖啡酸、王不留行黄酮苷、异槲皮苷、丹酚酸B、丹酚酸A、隐丹参酮对照品，加甲醇溶解，定容至刻度，配成各化合物质量浓度为1mg·mL^-1的标准储存液；使用时，分别移取8种对照品溶液制成混合标准溶液并按一定比例逐级稀释成不同浓度，待用；

(4)定性检测：采用高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱技术测定步骤(2)中的待测液，根据精确分子质量、相对保留时间，确定待测液中的八种活性成分；

(5)定量检测：采用高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱技术分别测定步骤(2)中的待测液和步骤(3)中的混合标准溶液，采用外标法对待测液中的八种活性成分进行定量检测。

优选的，所述步骤(2)中，所述药粉与色谱甲醇的质量体积比为1g：15-20mL，进一步优选的，所述药粉与色谱甲醇的质量体积比为1g：20mL；

超声处理条件为：超声功率300～320W，频率30～40kHz，处理时间为30～60min；

优选的，所述步骤(4)或(5)中高效液相色谱的的色谱条件为：Kromasil 100-5C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流速为0.8mL·min^-1；柱温为25℃；检测波长为300nm；流动相：乙腈(A)-0.8％甲酸水溶液(B)；梯度洗脱；进样量为10μL。

本研究表明采用Kromasil 100-5C₁₈色谱柱前列欣胶囊提取物中各化合物分离效果较好，同时，在实验中发现部分色谱峰的拖尾现象，因此考察了流动相加入不同比例弱酸(0.2％甲酸、0.4％甲酸、0.6％甲酸、0.8％甲酸)对色谱分离的影响，结果表明，水相中加入0.8％甲酸时各色谱峰分离度较好，峰型尖锐；同时经紫外检测器考察样品在不同波长(190～400nm)下的色谱图，结果表明，选择300nm时，样品HPLC色谱峰较多，基线稳定，因此，选择300nm作为样品指纹图谱的检测波长。

进一步优选的，所述梯度洗脱程序具体为：0～15min，5％A→10％A；15～30min，10％A→20％A；30～50min，20％A→30％A；50～65min，30％A→45％A；65～90min，45％A→100％A；90～100min，100％A→100％A。

优选的，所述步骤(4)或(5)中质谱条件为：分别采用电喷雾正、负离子模式；全扫描范围m/z 100-1000；毛细管电压：4.0kV；喷雾气压：310.28Kpa；干燥气流速：10.0L·min^-1；干燥气温度：325℃；裂解电压：100V；锥孔电压：60V。

上述构建前列欣胶囊HPLC指纹图谱的方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的配置：取出前列欣胶囊中药粉，称取一定量药粉；向药粉中加入色谱甲醇，超声提取后摇匀过滤，滤液过0.22μm微孔滤膜后得供试品溶液；

(2)高效液相色谱HPLC分析：Kromasil 100-5C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：乙腈(A)-0.8％甲酸水溶液(B)；梯度洗脱：0～15min，5％A→10％A；15～30min，10％A→20％A；30～50min，20％A→30％A；50～65min，30％A→45％A；65～90min，45％A→100％A；90～100min，100％A→100％A；流速为0.8mL·min^-1；柱温为25℃；检测波长为300nm；进样量为10μL；

(3)测定10批前列欣胶囊样品并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的前列欣胶囊HPLC的标准指纹图谱。

优选的，所述前列欣胶囊HPLC的标准指纹图谱具有的34个共有峰的相对保留时间t_R分别为：7.40min,8.20min,10.77min,20.10min,20.88min,22.77min,24.62min,26.59min,27.39min,33.81min,36.50min,37.69min,39.03min,40.56min,42.69min,44.65min,48.36min,51.56min,57.52min,59.41min,64.88min,67.59min,68.71min,72.20min,72.69min,74.11min,74.50min,76.79min,78.43min,79.74min,81.32min,84.84min,91.04min,91.79min。

本发明还公开了上述前列欣胶囊HPLC指纹图谱的构建方法得到的前列欣胶囊HPLC的标准指纹图谱。

本发明的有益效果：

本发明同时采用高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱技术测定前列欣胶囊中八种活性成分并构建前列欣胶囊HPLC指纹图谱同时用于对前列欣胶囊药品的质量评价，二者相互印证，从而更全面地反映前列欣胶囊药品的质量，有利于研究和保证前列欣胶囊药品原料及制剂的质量。所述检测方法灵敏可靠，比目前已有的前列欣胶囊药品分析方法有更强更全面的分析能力，能够有效提高对前列欣胶囊药品成品的质控水平，对于保证临床用药的有效性和安全性具有积极的意义。

附图说明

图1为对照品(A)、前列欣胶囊(B)样品的HPLC图；

其中，1-没食子酸色谱峰；2-绿原酸色谱峰；3-咖啡酸色谱峰；4-王不留行黄酮苷色谱峰；5-异槲皮苷；6-丹酚酸B；7.丹酚酸A色谱峰；8-隐丹参酮色谱峰；

图2为10批前列欣胶囊的HPLC指纹图谱叠加图。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

1仪器与材料

安捷伦1260高效液相色谱仪(自动进样器、梯度泵、柱温箱、二极管阵列检测器)；十万分之一电子分析天平(SARTOURIUS BSA)、指纹图谱相似度评价软件为“中药色谱指纹相似度评价系统”(国家药典委员会2004A)；SB-5200D型高功率数控超声波仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

色谱柱：美国Agilent ZORBAX SB-C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)，瑞典Kromasil 100-5C₁₈(4.6mm×250mm,5μm)。没食子酸(批号149-91-7)、绿原酸(批号327-97-9)、咖啡酸(批号331-39-5)、王不留行黄酮苷(批号53452-16-7)、异槲皮苷(批号482-35-9)、丹酚酸B(批号115939-25-8)、丹酚酸A(批号96574-01-5)、隐丹参酮(批号35825-57-1)，标准品纯度均≥98％，均购于上海源叶生物科技有限公司。

甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司)，乙腈(色谱纯，美国FisherScientific)，无水乙醇(分析纯，天津市广成化学试剂有限公司)，甲酸、磷酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，实验用水为密理博超纯水(18MΩ)。10批样品购于济南市各大药店，样品信息见表1。

表1样品来源

2实验方法

2.1供试品溶液的制备

取前列欣胶囊粉末0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入10mL色谱甲醇，超声提取30min(提取功率320W，频率40kHz)，摇匀，过滤，滤液过0.22μm微孔滤膜后作为供试品溶液，备用。

2.2标准溶液的制备

分别精密称取1.0mg没食子酸、绿原酸、咖啡酸、王不留行黄酮苷、异槲皮苷、丹酚酸B、丹酚酸A、隐丹参酮对照品，置1mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成各化合物质量浓度为1mg·mL^-1的标准储存液。分别吸取100μL的上述标准储存溶液，置于同一容量瓶(1mL)中，用甲醇定容至刻度，备用。

2.3色谱条件

瑞典Kromasil 100-5C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：乙腈(A)-0.8％甲酸水溶液(B)；梯度洗脱(0～15min，5％A→10％A；15～30min，10％A→20％A；30～50min，20％A→30％A；50～65min，30％A→45％A；65～90min，45％A→100％A；90～100min，100％A→100％A)；流速为0.8mL·min^-1；柱温为25℃；检测波长为300nm；进样量为10μL。对照品及样品色谱图见图1。

2.4质谱条件

进入高分辨飞行时间质谱的流动相采用三通分流至0.4mL·min^-1。分别采用电喷雾正、负离子模式；全扫描范围m/z 100-1000；毛细管电压：4.0kV；喷雾气压：310.28Kpa；干燥气流速：10.0L·min^-1；干燥气温度：325℃；裂解电压：100V；锥孔电压：60V。

3结果与讨论

3.1ESI-TOF/MS鉴别

根据获得的化合物的精确分子量和相对保留时间信息，DAD检测器获得的紫外吸收信息，并参考相关文献及中国科学院上海有机化学研究所化学专业数据库，对各化合物进行鉴别。鉴别结果与标准对照品进行了对比，以保证结果准确性(结果见表2)。

表2 ESI-TOF/MS精确质量测量结果

3.2八种活性成分定量测定

3.2.1标准曲线及检出限将“2.2”项下的混合对照品溶液稀释到37.5、25、12.5、5、2.5、1.25μg·mL^-1，按“2.3”项下色谱条件进样分析，测定各不同浓度的混合标准液中各化合物的峰面积，以各化合物质量浓度(μg·mL^-1)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程(见表3)。将标准溶液稀释至低浓度进样，以3倍信噪比计算各成分的检测下限，以10倍信噪比计算定量下限，结果见表3。从表3可以看出，各标准曲线的相关系数良好，方法灵敏度较高，可以满足前列欣胶囊提取物中各活性组分的含量测定。

表3 8种化合物的回归方程、线性范围及检测下限、定量下限

3.2.2精密度试验取S1号供试品溶液，连续进样6次，测得其中8个特征峰的峰面积和保留时间，分别计算其相对标准偏差(RSD)，其特征峰保留时间RSD依次是0.24％、0.14％、0.13％、0.11％、0.03％、0.03％、0.02％、0.01％，均小于1％，峰面积RSD依次是1.79％、1.90％、2.51％、1.21％、2.74％、3.14％、0.47％、0.96％，均小于5％，结果表明仪器精密度良好。

3.2.3重复性试验取S1号样品6份，按“2.1”项下处理方法制成供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进样测定，测得8个特征峰的峰面积和保留时间，并计算其相对标准偏差。结果8个特征峰保留时间RSD依次是0.52％、0.24％、0.25％、0.18％、0.12％、0.13％、0.12％、0.02％，均小于1％，峰面积RSD依次是2.63％、1.31％、1.56％、2.69％、1.16％、1.28％、1.97％、1.25％，均小于5％，结果表明方法重现性良好。

3.2.4稳定性试验取S1号供试品溶液按照“2.3”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24h进样分析，记录色谱图。结果8个特征峰保留时间RSD依次是0.33％、0.15％、0.15％、0.12％、0.05％、0.04％、0.03％、0.01％，均小于1％，峰面积RSD依次是1.83％、2.07％、2.23％、1.28％、2.26％、3.16％、2.73％、1.72％，均小于5％，表明样品在24h内化学性质稳定。

3.2.5回收率试验精密称取已知各目标化合物含量的前列欣胶囊样品0.25g，分别准确加入没食子酸、绿原酸、咖啡酸、王不留行黄酮苷、异槲皮苷、丹酚酸B、丹酚酸A、隐丹参酮对照品适量，按照供试品溶液制备方法处理3份，按上述色谱条件进样分析，测定各目标化合物峰面积，计算平均加样回收率(n＝3)分别为95.25％、96.85％、98.10％、96.71％、97.87％、95.80％、97.57％、96.74％；RSD分别为3.38％、2.82％、3.95％、2.15％、3.02％、2.86％、3.30％、2.24％，见表4。从实验结果可知，本方法的回收率良好。

表4加标回收率实验

3.2.6样品测定按“2.1”项下供试品溶液制备方法制备样品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别进样分析，获得10批前列欣胶囊样品中8种化合物色谱峰面积，将测得结果带入表2线性回归方程，计算前列欣胶囊样品中8种化合物的含量(见表5)。从表中可以看出，不同批次样品中各化合物含量平均值在84.46～615.36μg·g^-1之间，其RSD在1.32％～2.93％之间，说明不同批次样品中各活性成分含量差异不大。

表5样品中8种化合物含量测定结果(μg·g^-1，n＝10)

3.3前列欣胶囊HPLC指纹图谱

3.3.1指纹图谱建立和共有峰标定取10批不同批次的前列欣胶囊样品，按“2.1”项下处理方法将其制备成供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，建立前列欣胶囊的HPLC指纹图谱(见图2)。在本研究所建立的分析系统下，各样品中分离度较好且稳定出现的峰有34个(见图2)，相对保留时间t_R分别为：7.40min,8.20min,10.77min,20.10min,20.88min,22.77min,24.62min,26.59min,27.39min,33.81min,36.50min,37.69min,39.03min,40.56min,42.69min,44.65min,48.36min,51.56min,57.52min,59.41min,64.88min,67.59min,68.71min,72.20min,72.69min,74.11min,74.50min,76.79min,78.43min,79.74min,81.32min,84.84min,91.04min,91.79min。计算结果表明，各色谱峰保留时间的RSD％均在1％以内，而峰面积的RSD均在5％以内，说明不同批次前列欣胶囊中各共有峰重现性较好，可以选为指纹图谱的共有峰用于其质量评价。

3.3.2相似度评价通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(国家药典委员会2004A版)对10批前列欣胶囊的指纹图谱进行相似度分析。将色谱工作站数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，选定上述34个共有峰进行谱峰匹配，采用共有模式作为对照指纹图谱，用于10批前列欣胶囊相似度评价，分别采用夹角余弦法和相关系数法用于其相似度计算，结果见表6。

表6相似度评价结果

从表中可以看出，不同批次前列欣胶囊的相似度较为接近，说明其质量差别不大，所得结果与多指标含量测定结果一致，可与之相互印证，有效提高对前列欣胶囊药品成品的质控水平，对于保证临床用药的有效性和安全性具有积极的意义。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种基于多指标活性成分测定的前列欣胶囊质量评价方法，其特征在于，包括基于高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱技术测定前列欣胶囊中八种活性成分和构建前列欣胶囊HPLC指纹图谱；其中，所述八种活性成分分别为没食子酸、绿原酸、咖啡酸、王不留行黄酮苷、异槲皮苷、丹酚酸B、丹酚酸A和隐丹参酮。

2.一种基于高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱技术测定前列欣胶囊中八种活性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取出前列欣胶囊中药粉，称取一定量药粉待用；

(2)向步骤(1)中的药粉中加入100％色谱甲醇，超声提取后摇匀过滤，滤液过0.22μm微孔滤膜后得待测液；

3.如权利要求2所述的一种基于高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱技术测定前列欣胶囊中八种活性成分的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述药粉与色谱甲醇的质量体积比为1g：15-20mL，进一步优选，所述所述药粉与色谱甲醇的质量体积比为1g：20mL。

4.如权利要求2所述的一种基于高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱技术测定前列欣胶囊中八种活性成分的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，超声处理条件为：超声功率300～320W，频率30～40kHz，处理时间为30～60min。

5.如权利要求2所述的一种基于高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱技术测定前列欣胶囊中八种活性成分的方法，其特征在于，所述步骤(4)或(5)中，高效液相色谱的的色谱条件为：Kromasil 100-5C₁₈色谱柱，4.6mm×250mm,5μm；流速为0.8mL·min^-1；柱温为25℃；检测波长为300nm；流动相：A相乙腈-B相0.8％甲酸水溶液；梯度洗脱。

6.如权利要求5所述的一种基于高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱技术测定前列欣胶囊中八种活性成分的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序具体为：0～15min，5％A→10％A；15～30min，10％A→20％A；30～50min，20％A→30％A；50～65min，30％A→45％A；65～90min，45％A→100％A；90～100min，100％A→100％A。

7.如权利要求2所述的一种基于高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱技术测定前列欣胶囊中八种活性成分的方法，其特征在于，所述(4)或(5)中质谱条件为：分别采用电喷雾正、负离子模式；全扫描范围m/z 100-1000；毛细管电压：4.0kV；喷雾气压：310.28Kpa；干燥气流速：10.0L·min^-1；干燥气温度：325℃；裂解电压：100V；锥孔电压：60V。

8.一种构建前列欣胶囊HPLC指纹图谱的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)高效液相色谱HPLC分析：Kromasil 100-5C₁₈色谱柱，4.6mm×250mm,5μm；流动相：A相乙腈-B相0.8％甲酸水溶液；梯度洗脱：0～15min，5％A→10％A；15～30min，10％A→20％A；30～50min，20％A→30％A；50～65min，30％A→45％A；65～90min，45％A→100％A；90～100min，100％A→100％A；流速为0.8mL·min^-1；柱温为25℃；检测波长为300nm；

9.如权利要求8所述的一种构建前列欣胶囊HPLC指纹图谱的方法，其特征在于，所述前列欣胶囊HPLC的标准指纹图谱具有的34个共有特征峰的相对保留时间t_R分别为：7.40min,8.20min,10.77min,20.10min,20.88min,22.77min,24.62min,26.59min,27.39min,33.81min,36.50min,37.69min,39.03min,40.56min,42.69min,44.65min,48.36min,51.56min,57.52min,59.41min,64.88min,67.59min,68.71min,72.20min,72.69min,74.11min,74.50min,76.79min,78.43min,79.74min,81.32min,84.84min,91.04min,91.79min。

10.权利要求8或9所述的构建前列欣胶囊HPLC指纹图谱的方法得到的前列欣胶囊HPLC的标准指纹图谱。