CN106483220B

CN106483220B - 一种西藏木瓜活性成分的检测方法及多指标定量指纹图谱的构建方法

Info

Publication number: CN106483220B
Application number: CN201610893876.2A
Authority: CN
Inventors: 赵恒强; 赵志国; 王晓; 崔莉; 张敏敏; 刘伟; 耿岩玲
Original assignee: Shandong Analysis and Test Center
Current assignee: Shandong Analysis and Test Center
Priority date: 2016-10-13
Filing date: 2016-10-13
Publication date: 2018-10-02
Anticipated expiration: 2036-10-13
Also published as: CN106483220A

Abstract

本发明公开了一种西藏木瓜活性成分的检测方法及多指标定量指纹图谱的构建方法。本发明以西藏木瓜甲醇水提取物为研究对象，首次建立了HPLC‑ESI‑TOF/MS法分析测定西藏木瓜中活性成分的方法，在对多批次样品分析基础上，首次建立了西藏木瓜药材的多指标定量指纹图谱，结合相似度分析，可以实现西藏木瓜与其他品种木瓜的正确区分。本发明的研究结果可以对西藏木瓜药材的合理利用提供质量评价方法和技术支持。

Description

一种西藏木瓜活性成分的检测方法及多指标定量指纹图谱的构建方法

技术领域

本发明涉及一种西藏木瓜活性成分的检测方法及多指标定量指纹图谱的构建方法。

背景技术

西藏木瓜(Chaenomeles thibetica)为蔷薇科木瓜属植物，主要分布在西藏、四川等省区，具有舒经活络、和胃化湿、健胃之功效，藏医将其果实用做木瓜(藏药名赛亚)入药。《中国藏药》第一卷把西藏木瓜收录其中，但有关其质量标准仅有性状、显微和理化鉴别等方法。2015版《中国药典》一部中仅采用皱皮木瓜Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai作为木瓜药材的主要来源，有关西藏木瓜的药用情况没有表述。目前，《中国药典》和相关文献中有关木瓜的质量控制也仅对其中齐墩果酸和熊果酸进行了含量测定，然而单一的指标成分难以反应中药多成分、多靶点的特点。有关西藏木瓜活性成分的分析测定和质量控制对于安全合理利用西藏木瓜资源具有重要意义。然而至今为止，西藏木瓜的质量控制仍然停留在性状鉴别和少数主要活性成分含量测定，缺乏系统的研究报道。

多指标定量指纹图技术把指纹图谱技术与药效活性成分多指标定量相结合，可以更加全面地控制中药的质量。近年来，多指标定量指纹图技术在中药质量控制研究中发挥了重要作用，并且越来越多的被用于中药材及中成药的质量控制研究中。但目前还未有关于西藏木瓜多指标定量指纹图谱构建的报道，因此，有必要进行相关研究，以提高西藏木瓜的质量控制和真伪鉴别水平，以便于更好的开发利用西藏木瓜资源。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种西藏木瓜活性成分的检测方法。

本发明的另一目的是提供一种西藏木瓜多指标定量指纹图谱的构建方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种西藏木瓜活性成分的检测方法，步骤如下：

(1)对照品溶液的制备：分别制备绿原酸、香草酸、咖啡酸、藜芦酸、芸香苷、槲皮苷、金丝桃苷、齐墩果酸和熊果酸对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：采用匀浆提取法对西藏木瓜鲜药材进行提取，制备供试品溶液；

(3)采用高效液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾飞行时间质谱(HPLC-DAD-ESI-TOF/MS)联用技术对木瓜中的活性成分进行快速分析鉴别。

步骤(1)中，制备的对照品溶液的浓度均为1mg/mL。

步骤(2)中，所述匀浆提取法的操作为：向西藏木瓜鲜药材中加入甲醇溶液，水浴加热，再加入水，12000-14000r/min匀浆提取0.5-2min。

西藏木瓜鲜药材、甲醇溶液和水加入量的比为1g：2ml：1ml。

优选的，所述甲醇溶液的体积分数为70％。

优选的，水浴加热的温度为60℃，水浴时间为10min。

步骤(3)中，液相色谱条件为：乙腈作为流动相A，0.5％冰乙酸+10mM醋酸铵水溶液作为流动相B(即：以含有体积百分比为0.5％的冰乙酸和10mM醋酸铵的水溶液作为流动相B)，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～20min，7％A→8％A；20～30min，8％A→10％A；30～50min，10％A→11％A；50～65min，11％A→13％A；65～90min，13％A→15％A；90～110min，15％A→20％A；110～115min，20％A→20％A；115～140min，20％A→45％A；140～150min，45％A→45％A；150min-151min,45％A→90％A；151～156min，90％A→100％A；156～165min，100％A→100％A。

进一步的，液相色谱条件中，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C₁₈(4.6mm×250mm，5.0μm)；流速为0.8mL/min；柱温为25℃；检测波长为280nm；进样量为10μL。

步骤(3)中，质谱检测条件为：电喷雾正负离子全扫描检测；全扫描范围m/z100-1000；锥孔电压：60V；毛细管电压：5.0kV；裂解电压：100V；喷雾气压：310Kpa；干燥气流速：11.0L/min；干燥气温度：350℃。

经方法学考察，本发明检测方法的精密度、重复性、稳定性和准确性良好，采用本发明的检测方法可以对西藏木瓜中的绿原酸、香草酸、咖啡酸、藜芦酸、芸香苷、槲皮苷、金丝桃苷、齐墩果酸和熊果酸等九种活性成分进行鉴别和检测。

本发明还提供一种西藏木瓜多指标定量指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：采用匀浆提取法对西藏木瓜鲜药材进行提取，制备供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：分别制备绿原酸、香草酸、咖啡酸、藜芦酸、芸香苷、槲皮苷、金丝桃苷、齐墩果酸和熊果酸对照品溶液；

(3)测定：分别精密量取供试品和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，并记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并计算各样品中目标化合物的含量；

(4)用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得到西藏木瓜多指标定量指纹图谱。

步骤(1)中，所述匀浆提取法的操作为：向西藏木瓜鲜药材中加入甲醇，水浴加热，再加入水，12000-14000r/min匀浆提取1-2min。

西藏木瓜鲜药材、甲醇溶液和水加入量的比为1g：2ml：1ml。

优选的，所述甲醇溶液的体积分数为70％。

优选的，水浴加热的温度为60℃，水浴时间为10min。

步骤(2)中，测定的液相色谱条件为：乙腈作为流动相A，0.5％冰乙酸+10mM醋酸铵水溶液作为流动相B(即：以含有体积百分比为0.5％的冰乙酸和10mM醋酸铵的水溶液作为流动相B)，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～20min，7％A→8％A；20～30min，8％A→10％A；30～50min，10％A→11％A；50～65min，11％A→13％A；65～90min，13％A→15％A；90～110min，15％A→20％A；110～115min，20％A→20％A；115～140min，20％A→45％A；140～150min，45％A→45％A；150min-151min,45％A→90％A；151～156min，90％A→100％A；156～165min，100％A→100％A。

上述方法构建得到的西藏木瓜多指标定量指纹图谱，其特征峰为30个。各色谱峰相对保留时间的RSD％均在1％以内，而相对峰面积的RSD％均在5％以内。

需要说明的是，本发明的指纹图谱的构建方法是经过科学实验而筛选得到的，并非是本领域的常规选择，本发明主要对供试品溶液的制备方法，色谱条件等进行了优选。

其中：

1)对于供试品溶液制备方法的优化：

供试品溶液的制备方法对于西藏木瓜活性成分的检测及指纹图谱的构建而言是至为关键，若供试品溶液制备方法选择不当，则可能会导致无法将西藏木瓜中的有效成分提取出来，从而无法正确的反应西藏木瓜的质量情况。本发明采用匀浆提取法对西藏木瓜的有效成分进行了提取，将适当溶媒加入到新鲜的生物组织中，在匀浆搅拌刀的强力作用下，细胞液中的活性成分迅速溶出到溶媒中的过程。具有操作简单、提取率高、能耗低、温度低、速度快等优点，物料破碎和有效成分的提取同步进行，特别适合于西藏木瓜有效成分的提取。本发明对不同提取溶剂(水、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇)、不同匀浆转速(14000r/min，13 000r/min，10 000r/min，8 000r/min)、不同提取时间(0.5min、1min、2min、3min)时的提取效果，所得提取液在相同的色谱条件进行分析。结果表明，当采用70％甲醇、13 000r/min、1min作为提取条件时，色谱峰较多，峰强度较好。

2)色谱条件的优化：

本发明选择了三根不同的反相色谱柱XSELECT^TM HSS T3(3.0mm×150mm，3.5μm)、Agilent Zorbax SB-C₁₈(4.6mm×250mm，5.0μm)、Agilent Kromasil 100-5C₁₈E103491(4.6mm×250mm，5.0μm)，按上述色谱条件进样分析，结果表明，当采用Agilent Zorbax SB-C₁₈(4.6mm×250mm，5.0μm)色谱柱时木瓜提取物中各化合物分离效果较好。木瓜果实中含有多种有机酸、黄酮、三萜等化学成分，采用等度洗脱难以实现其分离，因此采用梯度洗脱用于其分离研究。考察了甲醇-水和乙腈-水作为洗脱溶剂时的效果，结果表明，采用乙腈-水作为流动相时各峰分离度较好、分布均匀，因此选择乙腈-水用于木瓜提取物的分离研究。由于木瓜提取物中含有大量有机酸和黄酮成分，易与色谱柱填料残留羟基发生作用，造成谱峰拖尾现象。进一步考察了流动相加入不同比例弱酸(0.3％冰乙酸、0.5％冰乙酸、0.7％冰乙酸)及缓冲盐对色谱分离的影响，结果表明，水相中加入0.5％冰乙酸+10mM醋酸铵时各色谱峰对称性较好、峰型尖锐。为选取最佳的检测波长作为西藏木瓜指纹图谱的特征波长，经二极管阵列检测器考察木瓜在不同波长(190～400nm)下的色谱图，结果表明，当检测波长为280nm时西藏木瓜样品HPLC色谱峰较多、峰面积大、峰形对称性较好且基线较平，因此，选择280nm作为西藏木瓜样品指纹图谱的检测波长。

洗脱条件是指纹图谱构建的关键参数条件，本发明对指纹图谱构建的洗脱条件进行了优化和选择，对于针对西藏木瓜测定的洗脱条件，本发明设计了多组流动相体系和洗脱程序，例如，将洗脱过程调整为：流动相A和流动相B的变化为：0～60min，流动相A5％～20％；60～135min，流动相A20％～45％；135～150min，流动相A45％～50％；150～165min，流动相A50％～90％。结果发现，与之相比，采用本发明的流动相体系和洗脱条件，各色谱峰的保留时间适中，且基线平稳，不易漂移，同时提高了色谱图的分离度，有效避免了色谱图的拖尾现象，有利于色谱指纹图谱的检测和分析。

上述构建的指纹图谱在西藏木瓜质量评价中的应用也是本发明的保护范围。

本发明的有益效果：

本发明以西藏木瓜甲醇水提取物为研究对象，首次建立了HPLC-ESI-TOF/MS法分析测定西藏木瓜中活性成分的方法，在对多批次样品分析基础上，首次建立了西藏木瓜药材的多指标定量指纹图谱，结合相似度分析，可以实现西藏木瓜与其他品种木瓜的正确区分。本发明的研究结果可以对西藏木瓜药材的合理利用提供质量评价方法和技术支持。

附图说明

图1：西藏木瓜样品的HPLC图；

图2：西藏木瓜的HPLC特征指纹图谱；

图3：特征图谱对比。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明实施例中所用到的仪器、材料如下：

安捷伦1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；G6520型四级杆串联飞行时间质谱仪，配有电喷雾离子源(美国Agilent公司)；万分之一电子分析天平(SARTOURIUS BSA)；SB-5200D型高功率数控超声波仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；THZ-8恒温水浴锅(浙江嘉兴电热仪器厂)。色谱柱：XSELECT^TM HSS T3(3.0mm×150mm，3.5μm)，美国AgilentKromasil 100-5C₁₈E103491(4.6mm×250mm，5.0μm)，美国Agilent Zorbax SB-C₁₈(4.6mm×250mm，5.0μm)。

绿原酸(批号327-97-9)、香草酸(批号121-34-6)、咖啡酸(批号331-39-5)、藜芦酸(批号93-07-2)、芸香苷(批号153-18-4)、槲皮苷(批号522-12-3)、金丝桃苷(批号482-36-0)、齐墩果酸(批号508-02-1)、熊果酸(批号77-52-1)，标准品纯度均≥98％，均购于上海源叶生物科技有限公司。乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific)，甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司)，冰乙酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，无水乙醇(分析纯，天津市广成化学试剂有限公司)，实验用水为哇哈哈纯净水。样品信息见表1。

表1 样品来源

实施例1：西藏木瓜活性成分的检测及方法学考察

1.对照品溶液的制备

分别精密称取1.0mg的绿原酸、香草酸、咖啡酸、藜芦酸、芸香苷、槲皮苷、金丝桃苷、齐墩果酸、熊果酸对照品，各置于1mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成各化合物质量浓度为1mg/mL的标准液，备用。

2.供试品溶液的制备

精密称取5.0g木瓜鲜药材，置于50mL EP管中，加入10mL甲醇，于60℃水浴锅中水浴10min，再加入5mL水，用匀浆提取法(13000r/min，1min)提取，滤液过0.22μm微孔滤膜后作为供试品溶液。

3.将制备供试品溶液采用高效液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾飞行时间质谱(HPLC-DAD-ESI-TOF/MS)联用技术进行检测。其中：

3.1色谱分离条件

Agilent Zorbax SB-C₁₈(4.6mm×250mm，5.0μm)，流动相：乙腈(A)-0.5％冰乙酸+10mM醋酸铵水溶液(B)；梯度洗脱(0～20min，7％A→8％A；20～30min，8％A→10％A；30～50min，10％A→11％A；50～65min，11％A→13％A；65～90min，13％A→15％A；90～110min，15％A→20％A；110～115min，20％A→20％A；115～140min，20％A→45％A；140～150min，45％A→45％A；150min-151min,45％A→90％A；151～156min，90％A→100％A；156～165min，100％A→100％A)；流速为0.8mL/min；柱温为25℃；检测波长为280nm；进样量为10μL。样品色谱图见图1。

3.2质谱检测条件

电喷雾正负离子全扫描检测；全扫描范围m/z100-1000；锥孔电压：60V；毛细管电压：5.0kV；裂解电压：100V；喷雾气压：310Kpa；干燥气流速：11.0L/min；干燥气温度：350℃。

3.3 ESI-TOF/MS鉴别

在3.1的色谱条件下，采用电喷雾飞行时间质谱技术，对色谱图中的主要组分进行高分辨质谱鉴别，根据获得的化合物的精确分子量信息，DAD检测器获得的紫外吸收信息，并参考相关文献及中国科学院上海有机化学研究所化学专业数据库，对各化合物进行鉴别。结果如表2所示：

表2 9个化合物的HPLC-ESI-TOF/MS精确质量测量结果

4.方法学考察

4.1线性关系考察

配置不同浓度的混合标准液，按“2。”项下的色谱条件进样分析，测定各化合物的峰面积，以各化合物质量浓度(μg·mL-¹)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程。将标准溶液稀释至低浓度进样，以3倍信噪比计算各成分的检测限，以10倍信噪比计算定量限，结果见表3。

表3 9种化合物的回归方程、线性范围及检出限、定量限

4.2精密度考察

精密称取“S1”号木瓜样品，按“2.供试品溶液的制备”项下方法制成供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件连续进样6次，分别测得其中9个化合物的峰面积和保留时间，分别计算其相对标准偏差(RSD)，其保留时间RSD依次是0.31％、0.24％、0.25％、0.17％、0.12％、0.15％、0.22％、0.27％、0.24％，均小于1％，峰面积RSD依次是0.80％、0.20％、1.35％、3.45％、1.98％、3.38％、1.09％、1.23％、1.14％，均小于5％，说明所使用的仪器性能良好,随机误差小，所采用的色谱分析方法适宜。

4.3重复性考察

准确称取“S1”号木瓜样品6份，按“2.供试品溶液的制备”项下处理方法制成供试品溶液，按照“3.1”项下色谱条件进样测定，测得9个化合物的峰面积和保留时间，并计算其相对标准偏差。结果9个化合物的保留时间RSD依次是0.48％、0.43％、0.40％、0.26％、0.54％、0.65％、0.34％、0.51％、0.48％，均小于1％，峰面积RSD依次是1.63％、3.04％、1.93％、3.64％、2.86％、3.60％、3.34％、1.78％、2.01％，均小于5％，结果表明方法重现性良好。

4.4稳定性考察

取“S1”号木瓜供试品溶液按照“3.1”项下色谱条件，分别在0、3、6、12、18、24h进样分析，记录色谱图。结果9个化合物保留时间RSD依次是0.35％、0.45％、0.44％、0.33％、0.18％、0.29％、0.34％、0.32％、0.29％，均小于1％，峰面积RSD依次是2.87％、3.36％、1.35％、3.45％、2.33％、3.58％、1.08％、2.45％、2.51％，均小于5％，表明样品在24h内化学性质稳定。

4.5加标回收率实验

精密称取已知各目标化合物含量的木瓜样品2.50g，分别准确加入绿原酸、香草酸、咖啡酸、藜芦酸、芸香苷、槲皮苷、金丝桃苷、齐墩果酸、熊果酸对照品适量，按照供试品溶液制备方法处理6份，按上述色谱条件进样分析，测定各目标化合物峰面积，计算平均加样回收率(n＝6)分别为96.87％、98.80％、99.57％、97.74％、97.94％、96.94％、99.04％、97.70％、98.40％,RSD分别为3.28％、2.32％、2.15％、3.35％、1.45％、2.25％、1.19％、2.30％、3.27％。从试验结果可知，本方法的回收率良好。

5.样品含量测定

按“2.供试品溶液的制备”项下的供试品溶液制备方法制备10批样品溶液，采用“3.1”项下色谱条件分别进样分析，得到10批西藏木瓜和3批不同品种木瓜样品中9种化合物的色谱峰面积，将测得结果带入表3线性回归方程中，得出木瓜样品中9种化合物的含量(见表4)。

表4 木瓜中9种化合物含量(μg·g^-1)测定结果

从表4可以看出，西藏木瓜9种活性成分中槲皮苷的平均含量相对最高，其平均值556.14μg/g；金丝桃苷的含量相对最低，其平均值9.87μg/g；9种活性成分的加和平均值为1250.15μg/g。相比之下，皱皮木瓜、毛叶木瓜和光皮木瓜中9种活性成分的加和平均值相对较低，分别为1 016.14μg/g、573.44μg/g和732.36μg/g。

实施例2：西藏木瓜指纹图谱的构建

将表1中S1-S10这10批不同批次的木瓜样品，按实施例1中“2.供试品溶液的制备”项下的处理方法将其制备成供试品溶液，各取10μL分别进样，按“3.1”项下的色谱条件进样分析，建立木瓜的HPLC特征指纹图谱，见图2。在本发明所建立的分析系统下，特征性明显的主要有30个色谱峰，这30个色谱峰即构成木瓜HPLC指纹图谱的特征峰。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD％均在1％以内，而相对峰面积的RSD％均在5％以内。

采用本发明的方法对西藏木瓜、皱皮木瓜、毛叶木瓜和光皮木瓜进行HPLC分析，所得色谱图如图3所示。从图中可以看出，西藏木瓜与其他三种不同类型木瓜HPLC图存在明显不同，说明本发明建立的西藏木瓜HPLC指纹图谱可以反应西藏木瓜的特有属性。

实施例3：相似度评价

通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(《国家药典委员会》2004A版)对表1中13批木瓜样品的指纹图谱进行相似度分析。将色谱工作站数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，选定上述30个共有峰进行谱峰匹配，采用共有模式作为对照指纹图谱，用于10批西藏木瓜和3批其他品种木瓜样品的相似度评价，采用夹角余弦法用于其相似度计算，结果见表5。从表中可以看出，不同批次西藏木瓜的相似度较为接近，说明其质量差别不大，而西藏木瓜与其他品种木瓜的相似度差别加大，所得结果与多指标含量测定结果一致。

表5 相似度评价结果

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种西藏木瓜活性成分的检测方法，其特征在于，步骤如下：

(2)供试品溶液的制备：采用匀浆提取法对西藏木瓜鲜药材进行提取，制备供试品溶液；所述匀浆提取法的操作为：向西藏木瓜鲜药材中加入甲醇溶液，水浴加热，再加入水，12000-14000r/min匀浆提取0.5-2min；西藏木瓜鲜药材、甲醇溶液和水加入量的比为1g：2ml：1ml；

(3)采用高效液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾飞行时间质谱联用技术对木瓜中的活性成分进行快速分析鉴别；所述高效液相色谱条件为：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C184.6mm×250mm，5.0μm，流动相：乙腈作为流动相A，0.5％冰乙酸+10mM醋酸铵水溶液作为流动相B；梯度洗脱：0～20min，7％A→8％A；20～30min，8％A→10％A；30～50min，10％A→11％A；50～65min，11％A→13％A；65～90min，13％A→15％A；90～110min，15％A→20％A；110～115min，20％A→20％A；115～140min，20％A→45％A；140～150min，45％A→45％A；150min-151min,45％A→90％A；151～156min，90％A→100％A；156～165min，100％A→100％A；流速为0.8mL/min；柱温为25℃；检测波长为280nm；进样量为10μL。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述质谱检测条件为：电喷雾正负离子全扫描检测；全扫描范围m/z100-1000；锥孔电压：60V；毛细管电压：5.0kV；裂解电压：100V；喷雾气压：310Kpa；干燥气流速：11.0L/min；干燥气温度：350℃。

3.一种西藏木瓜多指标定量指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：采用匀浆提取法对西藏木瓜鲜药材进行提取，制备供试品溶液；所述匀浆提取法的操作为：向西藏木瓜鲜药材中加入甲醇溶液，水浴加热，再加入水，12000-14000r/min匀浆提取0.5-2min；西藏木瓜鲜药材、甲醇溶液和水加入量的比为1g：2ml：1ml；

(3)测定：分别精密量取供试品和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，并记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并计算各样品中目标化合物的含量；所述高效液相色谱条件为：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18 4.6mm×250mm，5.0μm，流动相：乙腈作为流动相A，0.5％冰乙酸+10mM醋酸铵水溶液作为流动相B；梯度洗脱：0～20min，7％A→8％A；20～30min，8％A→10％A；30～50min，10％A→11％A；50～65min，11％A→13％A；65～90min，13％A→15％A；90～110min，15％A→20％A；110～115min，20％A→20％A；115～140min，20％A→45％A；140～150min，45％A→45％A；150min-151min,45％A→90％A；151～156min，90％A→100％A；156～165min，100％A→100％A；流速为0.8mL/min；柱温为25℃；检测波长为280nm；进样量为10μL；

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述甲醇溶液的体积分数为70％。

5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中水浴加热的温度为60℃，水浴时间为10min。

6.权利要求3-5任一项所述的构建方法构建的指纹图谱在西藏木瓜质量评价中的应用。