CN112858549A - 一种双黄连口服液定量指纹图谱质量监测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双黄连口服液定量指纹图谱质量监测技术，属于复方质量分析技术领域。本发明基于高效液相色谱‑紫外检测技术建立了双波长定量指纹图谱质量控制方法，通过一次分析实现双黄连口服液的指纹图谱监测，同时实现绿原酸、黄芩苷和连翘苷三个指标成分的含量测定，以及新绿原酸、隐绿原酸的一标多测定量。本发明在一次分析中同时实现指纹图谱和定量检测，能够更加全面、准确地评价双黄连口服液的质量，实现不同厂家双黄连口服液的区分，同时最大程度缩短了检测时间，减少资源耗费。

Description

一种双黄连口服液定量指纹图谱质量监测方法

技术领域

本发明涉及一种双黄连口服液定量指纹图谱质量监测技术，属于复方质量分析技术领域。

技术背景

双黄连口服液由黄芩、金银花、连翘按1：1：2的组方剂量配伍而成。连翘为木犀科植物连翘Forsythiasuspensa(Thub.)Vahl的干燥果实，是组方中君药，以苯乙醇苷类如连翘酯苷A、木质素类如连翘苷、天然醇类如连翘醇为主要成分类型，具有清热解毒、消肿散结的功效[夏伟.中国现代中药,2016,18(12):1670-1674]；金银花为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，以绿原酸为主要活性物质，临床常用于抑菌、抗病毒、抗炎等[吴娇.中国实验方剂学杂志.2019,25(04):225-234]；黄芩为唇形科植物黄芩Scutellariabaicalensis Georgi.的干燥根，主要成分为黄酮类，以黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、汉黄芩苷及千层纸素A为代表性成分，临床多用于抗菌消炎及抗感染[罗燕子.临床合理用药杂志,2018,11(30):180-181]。三者配伍的双黄连口服液具有清热解毒、疏风解表功效，用于外感风热所致发热、咳嗽、咽痛等。药理学研究表明其具有显著的抗菌、抗病毒、消炎及增强免疫的作用，是一种广谱抗病毒药，临床上对病毒性感染症状有显著抑制作用，同时应用范围已从呼吸道扩展到消化、泌尿及生殖系统[郭洁.临床合理用药杂志,2017,10(21):161-163]。作为常用中成药，双黄连口服液已批准的生产厂家有数十个，如何建立简单有效的质量监测技术，实现双黄连口服液产品差异性和一致性的评价，对双黄连口服液的质量控制具有重要的意义。

中药指纹图谱作为中药质量控制的关键技术，能够全面综合地反映中药多种化学成分的整体轮廓，体现中药多成分协同作用的基本特性，已成为药材、饮片和中成药质量控制的主要手段[Li J.Food Chem.,2015,176:7-11.；曹建军.中草药,2014,45(2):265-269.；姚静.中草药,2019,50(11):2567-2574]。另一方面，随着分离分析技术的发展，基于高效液相色谱的多指标成分定量检测已被逐渐用于中药尤其是中成药的质量评价和差异性分析[Yao C.J.Chromatogra.A.,2015,1402:71-81.；Mohammat A.Molecules,2017,22(5)]，克服传统单指标成分的片面性和局限性。

现行中国药典标准，采用三个方法分别实现双黄连口服液中三味组方药材主成分绿原酸、黄芩苷及连翘苷的定量测定，方法繁琐耗时。另一方面，现行标准并未对整体指纹图谱进行有效的控制。文献中报道了双黄连制剂中11个成分的同时定量[卞婷婷.药物分析杂志,2012,32(1):52-56.；Yang D.Talanta,2011,85(2):885-890.]，大大简化了检测过程，但为了保证含量测定的准确性，往往需要很长的分析时间以达到较好的分离效果；与此同时，多指标成分的定量大大增加了对照品的获取难度和成本。此外，现有文献对双黄连口服液中金银花的定量检测主要针对绿原酸，而该成分与新绿原酸、隐绿原酸易发生结构互变[朱鹏.药学学报.2016,51(1):122-126.]，因此难以真实反映咖啡酰奎宁酸类成分的含量。如何建立高效的质量控制技术，监测整体指纹图谱轮廓的同时，能够实现关键活性成分的定量，系统全面地评价双黄连口服液的质量，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种双黄连口服液定量指纹图谱质量监测技术。基于高效液相色谱-紫外检测技术建立了双波长定量指纹图谱质量控制方法，在一次分析中同时实现指纹图谱分析和多指标成分包括黄芩苷、连翘苷、绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸的定量检测，能够更加全面、准确地评价双黄连口服液的质量，实现不同厂家双黄连口服液的区分，同时最大程度缩短了检测时间，减少资源耗费。

本发明所采用的技术方案提供了一种双黄连口服液定量指纹图谱质量监测技术及多厂家双黄连口服液差异性分析方法，其特征在于包括如下步骤：

1)对照品溶液制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，加水制成每1mL含绿原酸1000μg的储备液；取连翘苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇/水制成每1mL含连翘苷1000μg的储备液；取黄芩苷对照品适量，精密称定，加少量N,N-二甲基甲酰胺溶解完全，再加甲醇制成每1mL含黄芩苷1000μg的储备液。

2)混合标准品溶液的制备：各储备液以50％甲醇/水稀释为黄芩苷浓度100μg/mL、绿原酸浓度25μg/mL、连翘苷10μg/mL的混合标准品溶液。

3)供试品溶液制备：取双黄连口服液500μL于25mL的容量瓶中，加适量50％甲醇/水，超声10min，放置至室温，用50％甲醇/水定容至刻度，摇匀，即得。

4)分析检测：采用高效液相色谱-紫外检测进行分析。

色谱柱为Waters-ACCHROM Tnature C18(250mm×4.6mm,5μm)或Waters SunfireC18(250mm×4.6mm,5μm)；柱温为20℃～45℃；流速为0.6mL/min～1.5mL/min；0.05％～0.15％磷酸/乙腈溶液为流动相A，以0.05％～0.15％磷酸/水为流动相B，进行梯度洗脱。

洗脱梯度条件：0～10min，8％A；10～40min，8％～30％A；40～50min，30％～65％A；50～55min，65％～95％A；55～60min，95％A。

指纹图谱采用235nm进行检测；连翘苷的定量检测采用235nm，黄芩苷、绿原酸、新绿原酸及隐绿原酸的定量检测采用327nm。

连翘苷、黄芩苷及绿原酸采用外标定量法进行含量测定；隐绿原酸与新绿原酸采用一标多测技术进行定量检测，通过隐绿原酸、新绿原酸与绿原酸之间的校正因子，实现隐绿原酸和新绿原酸的定量。

5)数据分析：对不同厂家双黄连口服液的差异性分析，通过去除主峰黄芩苷，对其他所有指纹峰采用夹角余弦法计算相似度。

本发明的优点如下：

1.本发明通过一次分析，能够同时实现双黄连口服液的指纹图谱监测和关键指标成分的定量检测。

2.本发明以三个对照品包括黄芩苷、连翘苷、绿原酸实现五个主要指标成分黄芩苷、连翘苷、绿原酸、隐绿原酸和新绿原酸的含量测定。

3.本发明实现绿原酸、隐绿原酸和新绿原酸的同时定量，真实反映咖啡酰奎宁酸类成分在口服液中的含量。

4.本发明首次利用优化的数据分析方法，通过去除主峰后进行相似度评价，能够实现不同厂家双黄连口服液的有效区分。

5.本发明为双黄连制剂的质量评价提供了快速、简便、全面的分析方法及差异性分析策略。

附图说明

图1为使用实施例3双黄连口服液指纹谱色谱峰定性结果；

图2为双黄连口服液HPLC指纹图谱；

图3为使用实施例10不同厂家双黄连口服液的指纹图谱对比；

图4不同厂家59批次双黄连口服液中黄芩苷含量对比；

图5不同厂家59批次双黄连口服液中连翘苷含量对比；

图6不同厂家59批次双黄连口服液中咖啡酰奎宁酸总含量对比。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明的技术方案作进一步解释和说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

仪器：Waters Alliance高效液相色谱仪(2695梯度泵，2998二极管阵列检测器，自动进样器，柱恒温系统，Empower色谱工作站)。

试剂：乙腈(色谱纯，MERYER)，甲醇(色谱纯，MERYER，中国)，磷酸(色谱纯，Sigma-Aldrich)，实验用水为Mill-Q纯水系统生成；其余试剂均为分析纯。

对照品：供含量测定绿原酸(含量：96.8％；批号：110753-201817，中国食品药品检定研究院，供含测用)；黄芩苷(含量：93.5％；批号：110715-201720，中国食品药品检定研究院，供含测用)；连翘苷(含量：95.1％；批号：110821-201816，中国食品药品检定研究院，供含测用)；隐绿原酸(含量99.8％，批号11112203)；新绿原酸(含量99.4％，批号11112202)；黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷、千层纸素A、绿原酸、异绿原酸A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素、芦丁、连翘酯苷、连翘脂素、白桦脂酸、黄芩苷、连翘苷均购自成都普瑞法科技开发有限公司。

实施例1

实施方法

1.分析条件：

仪器：Alliance e2695-2998

色谱柱：Tnature C18(Acchrom-Tech，4.6×250mm，5μm)

流速：1mL/min

柱温：40℃

进样量：10μL

波长采集范围：190nm-600nm

提取波长：235nm，327nm

流动相：A.0.1％磷酸/乙腈(v/v)B.0.1％磷酸/水(v/v)

梯度：

2.取绿原酸对照品精密称定，加水制成每1mL含绿原酸1000μg的储备液；取连翘苷对照品精密称定，加体积浓度50％甲醇/水制成每1mL含连翘苷1000μg的储备液；取黄芩苷对照品精密称定，加储备液总体积10％体积的N,N-二甲基甲酰胺溶解完全，再加甲醇制成每1mL含黄芩苷1000μg的储备液。以上各储备液用体积浓度50％甲醇/水溶液稀释配制黄芩苷浓度为100μg/mL、绿原酸浓度25μg/mL、连翘苷浓度10μg/mL的混合标准品溶液，过0.22μm有机膜后分析，以此混标溶液进行样品定量。

3.供试品溶液制备：取双黄连口服液500μL于25mL的容量瓶中，用体积浓度50％甲醇/水进行定容，采用0.22μm水膜过滤后直接分析。

4.结果：经测定，该供试品中含有黄芩苷14.111mg/mL，连翘苷0.805mg/mL，绿原酸1.31mg/mL，新绿原酸1.194mg/mL，隐绿原酸0.89mg/mL。

实施例2

实施方法

1.分析条件：

仪器：Alliance e2695-2998

色谱柱：Tnature C18(Acchrom-Tech，4.6×250mm，5μm)

流速：1.2mL/min

柱温：40℃

进样量：10μL

波长采集范围：190nm-600nm

提取波长：235nm，327nm

流动相：A.体积浓度0.08％磷酸/乙腈B.体积浓度0.08％磷酸/水

梯度：

2.混标配制：同实施例1。

3.供试品溶液制备：同实施例1

4.结果：经测定，该供试品中含有黄芩苷14.386mg/mL，连翘苷0.758mg/mL，绿原酸1.288mg/mL，新绿原酸0.98mg/mL，隐绿原酸0.849mg/mL。

实施例3

实施方法

1.分析条件：同实施例1。

2.供试品溶液的制备：同实施例1。

3.混标的配制：分别配置1mg/mL黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷、千层纸素A、绿原酸、异绿原酸A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素、芦丁、连翘酯苷、连翘脂素、白桦脂酸标准品溶液，0.22μm有机膜过滤后直接分析。

4.分析结果：在最佳分离条件下，采用标准品对双黄连口服液的指纹峰进行定性，同时对未知的主成分峰进行质谱定性分析，如图1，双黄连口服液含有

5.新绿原酸(3)、Secologanoside*(4)、绿原酸(5)、獐牙菜苦苷*(6)、隐绿原酸(7)、Secologanoside-7-methyl ester*(10)、芦丁(12)、连翘酯苷A(13)、忍冬苷+槲皮苷*(14)、3,4-二咖啡酰奎宁酸(17)、异绿原酸A(18)、4,5-二咖啡酰奎宁酸(19)、黄芩苷(20)、连翘苷(21)、Oroxylin A-7-O-Glu acid*(22)、汉黄芩苷(24)、连翘脂素(27)、汉黄芩素(28)、千层纸素A(29)。

*4、6、10、14、22号峰为质谱鉴定结果

6.取15批次双黄连口服液按实施例1方法进行指纹图谱分析，通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)”生成对照指纹谱如图2，标定13个共有峰(峰1：新绿原酸；峰2：Secologanoside；峰3：绿原酸；峰4：獐牙菜苦苷；峰5：隐绿原酸；峰6：Secologanoside-7-methyl ester；峰7：连翘酯苷A；峰8：忍冬苷+槲皮苷；峰9：4,5-二咖啡酰奎宁酸；峰11：连翘苷；峰12：Oroxylin A-7-O-Glu acid；峰13：连翘脂素)。

实施例4

实施方法

1.仪器精密度验证

依照实施例1样品制备方法及色谱条件，制备一份供试品溶液连续进样6次。以黄芩苷(峰10)为参照峰，考察各共有峰(峰1：新绿原酸；峰2：Secologanoside；峰3：绿原酸；峰4：獐牙菜苦苷；峰5：隐绿原酸；峰6：Secologanoside-7-methyl ester；峰7：连翘酯苷A；峰8：忍冬苷+槲皮苷；峰9：4,5-二咖啡酰奎宁酸；峰11：连翘苷；峰12：Oroxylin A-7-O-Gluacid；峰13：连翘脂素)与参照峰的相对保留时间(表1)和相对峰面积值(表2)。

结果表明，双黄连口服液同一供试品连续进样六针，各共有峰相对保留时间的RSD为0.03％～0.44％，相对峰面积的RSD为0.27％～1.74％，表明所用仪器精密度良好。

表1相对保留时间RSD(精密度考察)

表2相对峰面积RSD(精密度考察)

2.日内重复性验证

依照实施例1样品制备方法及色谱条件，制备六份供试品溶液进行分析，以黄芩苷(峰10)为参照峰，考察各共有峰(峰1：新绿原酸；峰2：Secologanoside；峰3：绿原酸；峰4：獐牙菜苦苷；峰5：隐绿原酸；峰6：Secologanoside-7-methyl ester；峰7：连翘酯苷A；峰8：忍冬苷+槲皮苷；峰9：4,5-二咖啡酰奎宁酸；峰11：连翘苷；峰12：Oroxylin A-7-O-Glu acid；峰13：连翘脂素)与参照峰的相对保留时间(表3)和相对峰面积值(表4)。

结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD为0.05％～0.51％，相对峰面积的RSD为0.42％～2.73％，表明本方法日内重复性良好。

表3相对保留时间RSD(日内重复性考察)

表4相对峰面积RSD(日内重复性考察)

3.日间重复性验证

连续三天，每天依照实施例1样品制备方法及色谱条件，制备三份供试品溶液进行分析，每份供试品溶液连续进样三针，以黄芩苷(峰10)为参照峰，考察各共有峰(峰1：新绿原酸；峰2：Secologanoside；峰3：绿原酸；峰4：獐牙菜苦苷；峰5：隐绿原酸；峰6：Secologanoside-7-methyl ester；峰7：连翘酯苷A；峰8：忍冬苷+槲皮苷；峰9：4,5-二咖啡酰奎宁酸；峰11：连翘苷；峰12：Oroxylin A-7-O-Glu acid；峰13：连翘脂素)与参照峰的相对保留时间(表5)和相对峰面积值(表6)。

结果表明，双黄连口服液连续三天进样分析，各共有峰相对保留时间的RSD为0.07％～0.66％，相对峰面积的RSD为0.16％～2.73％，表明本方法日间重复性良好。

表5相对保留时间RSD(日间重复性考察)

表6相对峰面积RSD(日间重复性考察)

4.稳定性验证

依照实施例1样品制备方法及色谱条件，制备一份供试品溶液，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h进行分析，以黄芩苷(峰10)为参照峰，考察各共有峰(峰1：新绿原酸；峰2：Secologanoside；峰3：绿原酸；峰4：獐牙菜苦苷；峰5：隐绿原酸；峰6：Secologanoside-7-methyl ester；峰7：连翘酯苷A；峰8：忍冬苷+槲皮苷；峰9：4,5-二咖啡酰奎宁酸；峰11：连翘苷；峰12：Oroxylin A-7-O-Glu acid；峰13：连翘脂素)与参照峰的相对保留时间(表7)和相对峰面积值(表8)。

结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD为0.06％～1.30％，相对峰面积的RSD为0.04％～3.94％，表明24h内供试品溶液稳定性良好。

表7相对保留时间RSD(稳定性)

表8相对峰面积RSD(稳定性)

5.经本实施例中各项验证，本发明建立的定量指纹谱方法进行指纹图谱分析可靠。

实施例5

实施方法

1.标曲的建立

1)供试品溶液的制备：取双黄连口服液按实施例1制备一份供试品溶液。

2)标曲溶液的配制

单标的配制：精密称取绿原酸(含量：96.8％)10mg左右，用水溶解，并转移到5mL容量瓶中用水定容(约2mg/mL)；精密称取连翘苷(含量：94.9％)10mg左右，用甲醇溶解，并转移到10mL容量瓶中用甲醇定容(约1mg/mL)；精密称取黄芩苷(含量：93.5％)10mg左右，用500μLN,N-二甲基甲酰胺溶解，转移到10mL容量瓶中用甲醇定容(约1mg/mL)。

混标的配制：量取5mL黄芩苷溶液，1mL连翘苷溶液，1mL绿原酸溶液于10mL容量瓶中，并用50％的甲醇/水定容，得到混标1；然后取5mL混标1于10mL容量瓶中，用50％的甲醇/水定容，得到混标2；依次配制，得到混标3，4，5，6。

3)标准曲线：按实施例1色谱条件进行液相色谱分析，连翘苷在235nm波长进行数据采集；绿原酸及黄芩苷在327nm波长下进行数据采集，得到如下表所示标准曲线。

表9标准曲线

1：绿原酸在327nm下的标准曲线 2：连翘苷在235nm下的标准曲线 3：黄芩苷在327nm下的标准曲线

2.校正因子

1)标曲溶液配制

单标的配制：精确称取绿原酸(纯度96.8％)，隐绿原酸，新绿原酸的标样10mg左右，用水溶解，转移到5mL容量瓶中并用水定容；

混标的配制：将上述单标样品，即绿原酸，新绿原酸，隐绿原酸各量取1mL于10mL容量瓶中，并用水定容，即可制得混标1；然后取5mL混标1于10mL容量瓶中，并用水定容，得到混标2；依照此方法依次得到混标3，4，5和6。

2)标准曲线：按实施例1色谱条件进行液相色谱分析，绿原酸、新绿原酸及隐绿原酸在327nm波长下进行数据采集，得到如下表所示标准曲线。

表10绿原酸、隐绿原酸和新绿原酸的标准曲线

1，2，3分别为绿原酸、隐绿原酸和新绿原酸

3)标样稳定性：利用上述混标4，进行标样的稳定性测试，按实施例1色谱条件进行液相色谱分析，统计0h，2h，4h，8h，12h，18h，24h和35h峰面积。

新绿原酸，绿原酸和隐绿原酸峰面积的RSD值均小于0.5％，证明其35h内稳定性很好。

表11标样稳定性考察峰面积RSD

4)双黄连口服液加标实验：

不加标溶液的配制：精确量取双黄连口服液250μL于25mL的容量瓶中，加50％甲醇/水进行定容至刻线。

加标溶液的配制：精确量取双黄连口服液250μL于25mL的容量瓶中，再加绿原酸单标(2mg/mL)150μL，新绿原酸标样(2mg/mL)150μL，隐绿原酸标样(2mg/mL)135μL，然后加50％甲醇/水进行定容至刻线。

分析结果：两次的不加标结果进行平均处理，通过标准曲线进行计算，新绿原酸含量为0.345mg，绿原酸含量为0.304mg，隐绿原酸的含量为0.292mg。新绿原酸的平均加标回收率为104.330％，RSD为0.550％；绿原酸的平均加标回收率为100.644％，RSD为0.862％；隐绿原酸的平均加标回收率为104.526％，RSD为0.685％，加标回收率在100％～105％，且RSD<1％(表12)。

加标回收率＝(加标样品测定值-不加标样品测定值)/加标量×100％

表12双黄连口服液的加样回收率

5)校正因子的计算方法：f＝fm/fk＝(Wm×Ak)/(Wk×Am)

Ak为内标物峰面积，Wk为内标物质量，Am为其他组分m峰面积，Wm为其他组分m质量。

利用一测多评方法得出新绿原酸相对于绿原酸的校正因子为1.075，隐绿原酸相对于绿原酸的校正因子为1.098。

3.校正因子定量验证

1)分析条件：同实施例1。

2)供试品溶液制备：取9个厂家18批次双黄连口服液，按实施例1供试品制备方法进行样品制备。

3)利用标准曲线进行绿原酸、新绿原酸及隐绿原酸的含量测定。

4)利用校正因子以绿原酸含量进行新绿原酸及隐绿原酸的含量标定。

5)含量测定结果：通过标准曲线测定与校正因子测定，新绿原酸含量的相对偏差均小于3％；隐绿原酸含量的相对偏差均小于5％，证明一测多评结果准确。

表13不同厂家和批号的双黄连口服液中绿原酸含量

厂家	绿原酸含量μg/mL	厂家	绿原酸含量μg/mL
				F1	15.917	D1	17.368
F2	13.341	H2	18.480
				G1	13.033	I2	18.780
B1	14.145	B3	14.075
				H1	16.455	A1	22.946
B2	15.208	A2	22.592
				C1	19.753	A3	21.817
I1	16.920	A4	20.645
				E1	20.804	A5	21.509

表14双黄连口服液中两种方法新绿原酸的含量对比

表15双黄连口服液中两种方法隐绿原酸的含量对比

实施例6

实施方法

1.仪器精密度

按照实施例1样品制备方法及色谱条件，制备一份供试品溶液连续进行6次分析。绿原酸和黄芩苷结果于327nm采集，连翘苷于235nm采集。绿原酸含量的RSD为0.695％，黄芩苷含量的RSD为0.479％，连翘苷含量的RSD为1.119％，RSD<3％，仪器的含量测定精密度好。

表16绿原酸、黄芩苷和连翘苷含量RSD(精密度考察)

2.日内重复性

按照实施例1方法制备方法及色谱条件，制备六份供试品溶液进行分析。绿原酸和黄芩苷结果于327nm采集，连翘苷于235nm采集。绿原酸含量的RSD为0.801％，黄芩苷含量的RSD为0.705％，连翘苷含量的RSD为0.923％，RSD<3％，双黄连口服液供试品含量测定的日内重复性较好。

表17绿原酸、黄芩苷和连翘苷含量RSD(日内重复性考察)

3.日间重复性

连续三天，每天按照实施例1方法制备方法及色谱条件，制备六份供试品溶液进行分析。绿原酸和黄芩苷结果于327nm采集，连翘苷于235nm采集。绿原酸含量的RSD为1.831％，黄芩苷含量的RSD为2.001％，连翘苷含量的RSD为2.161％，RSD<3％，双黄连口服液供试品含量测定的日间重复性很好。

表18绿原酸、黄芩苷和连翘苷含量RSD(日间重复性考察)

4.稳定性

按照实施例1方法制备方法及色谱条件，制备一份供试品溶液进行分析。分别统计0h，2h，4h，8h，13h，18h，24h，36h和48h的色谱分析结果。绿原酸和黄芩苷结果于327nm采集，连翘苷于235nm采集。绿原酸含量的RSD为2.595％，黄芩苷含量的RSD为1.873％，连翘苷含量的RSD为2.823％，RSD<3％，厂家A双黄连口服液供试品在48h的含量测定稳定性很好。

表19绿原酸、黄芩苷和连翘苷含量RSD(稳定性考察)

5.加标回收

1)不加标溶液：取双黄连口服液按实施例1方法制备供试品溶液。

2)加标溶液：取250μL双黄连口服液于25mL的容量瓶中，加绿原酸标样(2mg/mL)150μL，加黄芩苷标样(1mg/mL)3mL，加连翘苷标样(1mg/mL)135μL，然后用50％的甲醇/水进行定容。平行样品共六份，标记为加标样品1，2，3，4，5，6。

3)分析方法：按照实施例1色谱条件，进行分析。

4)分析结果：绿原酸加标回收率为96.918％，RSD为0.520％，黄芩苷的加标回收率为103.941％，RSD为0.806％，连翘苷的加标回收率为104.743％，RSD为1.420％，各物质回收率在95％～105％之间，且RSD<3％，加标结果符合标准。

表20各样品加标回收率统计表

实施例7

实施方法

采用经实施例4、5、6验证后的定量指纹谱方法，对5批次厂家D双黄连口服液按上述方法制备供试品溶液进行分析，并测定含量。

经测定，5批次厂家D双黄连口服液中，平均含绿原酸1.0056mg/mL，黄芩苷13.3520mg/mL，连翘苷0.4748mg/mL，新绿原酸1.1584mg/mL，隐绿原酸0.9732mg/mL。

实施例8

实施方法

1.采用实施例5建立定量指纹谱方法，对来源于不同厂家的双黄连口服液产品59批(厂家A 15批、厂家B 8批、厂家C 4批、厂家D 5批、厂家E 4批、厂家F 6批、厂家G 5批、厂家H 6批、厂家I 6批)指纹图谱分析，记录色谱图，分别选取不同厂家具有代表性的样品色谱图进行对比，图3(S1：厂家G S2:厂家B S3：厂家D S4：厂家C S5：厂家F S6：厂家A S7：厂家I S8：厂家H S9：厂家E)。

2.本实施例中对所有样本，去除主峰黄芩苷后，其余指纹图谱峰通过夹角余弦法计算相似度，产品差异性显现，如表21。

3.厂家A产品与大部分厂家相似度差异较大，尤其是与厂家C、D、E、F的产品能够显著区分开，相似度差异很大；与厂家B、G、I相似度差异较小。

4.除厂家E和厂家H产品外，其他各厂家不同批次的产品相似度大于0.96，厂家E和厂家H产品批次间一致性较差。

表21-1不同厂家59批双黄连口服液去黄芩苷后指纹图谱相似度评价结果

(1)

表21-2不同厂家59批双黄连口服液去黄芩苷后指纹图谱相似度评价结果

(2)

实施例9

实施方法

1.采用经实施例4、5、6验证后的定量指纹谱方法，对来源于不同厂家的双黄连口服液产品59批(厂家A15批、厂家B8批、厂家C4批、厂家D 5批、厂家E4批、厂家F 6批、厂家G 5批、厂家H 6批、厂家I6批)进行含量测定。

表22不同厂家不同批次样本定量结果

表23不同厂家多批次样本平均含量结果

2.如图4，厂家H双黄连口服液黄芩苷含量最高，但不同批次含量差异大；厂家A、G双黄连口服液中黄芩苷含量高于厂家B、I、C、E和F，且不同批次黄芩苷含量稳定。

3.如图5，相比于其他厂家双黄连口服液，厂家A产品中连翘苷含量比所有厂家均有所提升；厂家C和E不同批次连翘苷含量差异大。

4.如图6，厂家A、I、C、D和E双黄连口服液中咖啡酰奎宁酸总含量高于厂家G、H、B和F，厂家F和厂家C的双黄连口服液不同批次咖啡酰奎宁酸总含量差异较大。

5.多厂家多批次含量测定结果：以测定成分含量高低及批次间稳定性为指标，厂家A双黄连口服液明显优于其他8个厂家。

Claims (7)

1.一种双黄连口服液定量指纹图谱质量监测方法，其特征在于，同时完成多成份的指纹图谱监测及主要指标成分的定量检测包括以下步骤：

1)对照品储备液的制备：

取绿原酸对照品精密称定，加水制成每1mL含绿原酸800-1200μg的储备液；

取连翘苷对照品精密称定，加体积浓度40-60％甲醇/水制成每1mL含连翘苷800-1200μg的储备液；

取黄芩苷对照品精密称定，加储备液总体积5-10％体积的N，N-二甲基甲酰胺溶解完全，再加甲醇制成每1mL含黄芩苷800-1200μg的储备液；

2)混合对照品溶液的制备：以上所述各储备液用体积浓度40-60％甲醇/水稀释为黄芩苷浓度80-120μg/mL、绿原酸浓度15-35μg/mL、连翘苷8-15μg/mL的混合标准品溶液，然后再将混合标准品溶液用体积浓度40-60％甲醇/水稀释成2个以上不同浓度上述三种物质的溶液，3个以上不同浓度溶液共同作为标准溶液；

3)待测供试品溶液的制备：取双黄连口服液400-600μL于25mL的容量瓶中，加18-22mL体积浓度40-60％甲醇/水，超声10-15min，放置至室温，用40-60％甲醇/水定容至刻度25mL，摇匀，即得待测供试品溶液；

4)分析检测：采用高效液相色谱-紫外检测系统分别对标准溶液和待测供试品溶液进行分析；

5)含量测定：

定量检测的主要指标成分包括黄芩苷、连翘苷、绿原酸、隐绿原酸和新绿原酸；

分别以标准溶液检测获得的黄芩苷、绿原酸、连翘苷峰面积为横坐标，以标准溶液中黄芩苷、绿原酸、连翘苷浓度μg/mL纵坐标，分别建立黄芩苷、绿原酸、连翘苷的标准曲线；黄芩苷、连翘苷及绿原酸采用外标法定量，测得面积根据标准曲线进行含量计算；

隐绿原酸和新绿原酸采用一标多测技术进行定量，在测得绿原酸含量同时，利用相对校正因子实现隐绿原酸和新绿原酸的含量测定；

隐绿原酸含量(％)

＝(r_隐绿原酸/r_{绿原酸对照品})×(C_{绿原酸对照品}/C_供试品)×1.098×100

新绿原酸含量(％)

＝(r_新绿原酸/r_{绿原酸对照品})×(C_{绿原酸对照品}/C_供试品)×1.075×100

r为对应物质的峰面积，C为对应物质的浓度；

将待测供试品溶液检测获得的对应物质黄芩苷、连翘苷、绿原酸的峰面积代入对应物质的标准曲线，分别获得它们的含量；

将待测供试品溶液检测获得的对应物质隐绿原酸和新绿原酸的峰面积代入上述对应物质的公式，分别获得它们的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件为：色谱柱为Waters-ACCHROM Tnature C18(250mm×4.6mm，5μm)或Waters Sunfire C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温为20℃～45℃；流速为0.6mL/min～1.5mL/min；体积浓度0.05％～0.15％磷酸/乙腈溶液为流动相A，以体积浓度0.05％～0.15％磷酸/水为流动相B，进行梯度洗脱(V/V)，梯度为0～10min，8％A；10～40min，线性梯度8％～30％A；40～50min，线性梯度30％～65％A；50～55min，线性梯度65％～95％A；55～60min，95％A。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，指纹图谱紫外检测波长采用235nm，对2个以上不同厂家双黄连口服液进行检测，通过标照品及质谱检测指认13个共有峰，分别为新绿原酸、Secologanoside、绿原酸、獐牙菜苦苷、隐绿原酸、Secologanoside-7-methylester、连翘酯苷A、忍冬苷+槲皮苷、4，5-二咖啡酰奎宁酸、连翘苷、Oroxylin A-7-O-Gluacid和连翘脂素。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过去除谱图中主峰黄芩苷的信息，突出其他指纹峰贡献，对其他所有指纹峰采用夹角余弦法计算相似度进行比较，可以对不同厂家和/或相同厂家不同批次双黄连口服液的进行差异性分析。

5.根据权利要求4所述的方法，用于不同厂家双黄连口服液差异性分析或同一厂家制剂不同批次间的的差异性分析，其特征在于，所述的夹角余弦法原理为将二张色谱指纹图谱中，一组对应保留时间下的峰面积的数值，看作多维空间中的向量，使两个指纹图谱间相似性的问题转化为多维空间的两个向量(

和

)的相似性问题。利用cosθ值来定量表征指纹图谱间的相似性，如果cosθ越接近1，则说明两个向量越相似；通过计算所有共有峰和非共有峰的相似度，可以区分各个不同厂家的口服液制剂的差异，或同一厂家制剂不同批次间的差异，说明同一厂家制剂不同批次间稳定性；

其中a_i、b_i分别代表两张谱图中相应保留时间下的峰面积数值，i为第i个峰，n为峰的个数。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，黄芩苷、连翘苷及绿原酸采用外标法定量，测得面积根据标准曲线进行含量计算；隐绿原酸和新绿原酸采用一标多测技术进行定量，通过分别建立绿原酸、隐绿原酸和新绿原酸标准曲线，计算隐绿原酸与绿原酸及新绿原酸与绿原酸之间的相对校正因子，在测得绿原酸含量同时，利用相对校正因子实现隐绿原酸和新绿原酸的含量测定；

f＝fm/fk＝(Wm×Ak)/(Wk×Am)

(Ak为绿原酸峰面积，Wk为绿原酸质量，Am为隐绿原酸或新绿原酸峰面积，Wm为隐绿原酸或新绿原酸质量)。

7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，紫外检测采用双波长紫外检测器或者多波长阵列式检测器，同时进行两个波长的检测；连翘苷的定量检测采用235nm，黄芩苷、绿原酸的定量检测采用327nm。

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