CN108760903A - 一种双黄连口服制剂指纹图谱测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种双黄连口服制剂指纹图谱测定方法，属于药物分析技术领域。该测定方法通过以下步骤实现：制备对照品溶液、供试品溶液，最后利用高效液相色谱‑质谱进行分析检测。本发明采用不同的洗脱条件分进行HPLC检测，达到了良好的分离效果。本发明选用外加内标法，对含有内标物质的供试液进行指纹图谱的测定，采用共有峰与内标峰的相对峰面积比值作为该指纹图谱的数学表达，这样比通常选用中药自身成分做参照计算各共有峰的相对峰面积，更能体现各共有峰含量的绝对变化与相对变化。
Description
技术领域
本发明涉及一种双黄连口服制剂指纹图谱测定方法，属于药物分析技术领域。
背景技术
双黄连方剂由银翘散（《温病条辨》）精简化裁而来，是由双花（金银花）、黄芩、连翘三味中药所组成的现代中药复方制剂，具有辛凉解表、清热解毒的作用，是外感风热所致感冒的常用药，药理研究表明，具有良好的抗菌、抗病毒、解热抗炎等作用，是目前临床治疗呼吸道感染性疾病的首选药物之一。 《中国药典》从2000年收入，发展到2015年版（一部），其载入口服剂型已有口服液、片剂、颗粒剂和胶囊剂四种剂型，市场上获得国家食品药品监督管理总局批准，获得国药准字的生产企业共49家，其中片剂（片剂、含片、泡腾片、咀嚼片、分散片）18家，胶囊剂（包括软胶囊）9家，颗粒剂4家，口服液12家，糖浆剂3家，滴丸2家，合剂1家。面对如此之多的生产厂家，该制剂的质量稳定均一可控至关重要。
面对中药成分的复杂多样性，指纹图谱技术应运而生。指纹图谱包括了对已知成分和未知成分的分析，反映的化学成分信息（具体表现为相对保留时间和相对峰面积）具有高度特异性和选择性，可较充分地反映出中药复杂混合体系中各种化学成分量分布的整体状况，尤其是在现阶段有效成分绝大多数没有明确的情况下，能够结合各种色谱、光谱、波谱手段，特征性地鉴定中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。
文献《高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱定性分析双黄连粉针中化学成分及其药味归属》提供了一种采用液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法分析双黄连粉针中的化学分，通过质谱分析及文献对照，从双黄连粉针图谱中共准确推断43个峰的相对分子质量，推导出20个化合物，并对各化合物进行了药味归属。运用质谱技术，可以对指纹图谱中的色谱峰进行定性，但色谱图中由于各色谱峰没有达到有效分离，很难对色谱图中共有峰进行准确定量评价。
中国专利申请201510299374.2提供了一种对双黄连口服液中的5个成分进行的分离鉴定，鉴定成分少，双黄连制剂中，成分繁多，在指纹图谱检测中，需尽可能多的对药物成分进行指纹图谱表达和有效分离，这样才能对其成分进行精准定量，对药物质量进行客观评价。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明目的在于建立一种准确、灵敏、重复性好的双黄连口服制剂指纹图谱测定方法，作为双黄连口服制剂质量控制的技术手段，另一方面是为将来建立双黄连口服制剂谱-效相关质量评价系统提供技术方法和数据支撑。
为达到良好的分离效果，本试验采用两种色谱方法分两段对样品进行采集检测，同时创新性地在复杂的指纹图谱中定量加入一个内标峰，以共有峰与内标峰的相对峰面积比值作为该指纹图谱的数学表达，这样比通常选用中药自身成分做参照计算各共有峰的相对峰面积，更能体现各共有峰含量的绝对变化与相对变化。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种双黄连口服制剂指纹图谱测定方法，包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：称取紫草酸、黄芩苷、连翘苷、丹皮酚、槲皮素、黄芩素、木犀草苷、隐绿原酸、新绿原酸、牛蒡子苷、咖啡酸、异连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷B、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、迷迭香酸、千层纸素、白杨素、汉黄芩苷、汉黄芩素对照品，用70%甲醇稀释即得；
（2）供试品溶液制备：量取双黄连样品，置于25 mL容量瓶中，用70% 甲醇定容至刻度线，超声 ，放冷，补重，过滤，取续滤液与丹皮酚供试液混匀，经微孔滤膜滤过，即得供试液；
（3）利用高效液相色谱-质谱进行分析检测。
进一步的，所述对照品溶液用70%甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液。
本发明所使用的供试品溶液，具体制备方法为：量取双黄连样品，其中口服液精密量取8mL，颗粒、胶囊内容物、含片均研细，过80目筛，分别取4g、0.64g、1.6g，置于25 mL容量瓶中，均相当于原药材12g/25mL，用70% 甲醇定容至刻度线，超声20 min ，放冷，补重，过滤，取续滤液与丹皮酚供试液混匀，经0.45 µm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
进一步的，所述续滤液同丹皮酚供试液的体积比为1：1。
进一步的，所述丹皮酚供试液的浓度为55µg/mL；所述取丹皮酚供试液以70% 甲醇溶解并定容制成浓度为55µg·mL-1的内标溶液。
本发明所使用的高效液相色谱的条件为：色谱柱Thermo Hypersil Gold aQ C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；检测波长：260 nm；柱温：30℃；检测时间：200 min；进样量：10 µL；流动相为：乙腈-0.05%甲酸，梯度洗脱。
上述梯度洗脱为前半段梯度洗脱和后半段梯度洗脱，所述前半段梯度洗脱条件：0~18min，3%ACN；18~30min，3%→6%ACN；30~70min，6→3%ACN；70~75min，3%→8%ACN；75~110min，8%→12%ACN ；110~170min，12% ACN；170~210 min，12%→18% ACN；所述后半段梯度洗脱条件：0~15min，10%→13%ACN；15~65min，13%ACN；65~100min，13%→20%ACN；100~200min，20%→31% ACN。
进一步的，所述质谱的条件为：采用ESI离子源，在正、负离子电离模式下分别采集数据进行质谱检测，离子阱质量分析器，质量扫描范围：m/z 50～1500，毛细管电压：4000 V(+),3500 V(-)，干燥气流速：9.0L·min-1，干燥气温度：350 ℃，喷雾气压力：35.0 psi，碰撞气：氦气。
本发明所使用的70%甲醇为甲醇的水溶液，百分数为体积百分数。
本发明的有益效果为：
（1）本发明采用不同的洗脱条件分进行HPLC检测，达到了良好的分离效果。
（2）本发明选用外加内标法，对含有内标物质的供试液进行指纹图谱的测定，采用共有峰与内标峰的相对峰面积比值作为该指纹图谱的数学表达，这样比通常选用中药自身成分做参照计算各共有峰的相对峰面积，更能体现各共有峰含量的绝对变化与相对变化。
（3）该法针对成品所含有效成分的结构特点和理化特征，对供试品溶液配制方法、流动相、洗脱程序、色谱柱等条件进行了筛选和优化，选用的方法重复性及稳定性良好。
（4）该方法能够更全面地监控原料药材、半成品和成品质量，监控生产工艺的稳定性。
附图说明
图1为实施例1得到的双黄连口服制剂指纹图谱。
图2为本发明对60批双黄连口服制剂行了指纹图谱测定，采用中位数法生成对照指纹图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
1材料
1.1仪器
Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Waters 2998紫外检测器(美国Waters公司)，Waters Empower色谱工作站(美国Waters公司)；Simplicity纯水仪（美国密理博公司）。
1.2试药
紫草酸（批号：150106）购自上海融禾医药科技有限公司。黄芩苷(批号: 110715-200514)、连翘苷（批号：0821-9930）、丹皮酚（110708-200505）、槲皮素（批号：100081-200406）、黄芩素(批号: 111595-200301)、木犀草苷(批号: 111720-200603)购自中国食品药品检定研究院。隐绿原酸(批号: 14030213)、新绿原酸(批号: 13112712)、牛蒡子苷（批号：7033101）、咖啡酸（批号：16013109）、异连翘苷（批号：7061722）、连翘酯苷A（批号：14102711）、连翘酯苷B（批号：7032522）、异绿原酸A(批号: 14041309)、异绿原酸B(批号:14022812)、异绿原酸C(批号: 14022805)、迷迭香酸（批号：14052812）、千层纸素(批号:14062410)、白杨素(批号: 13080712)、汉黄芩苷(批号: 13120401)、汉黄芩素(批号:13101809)购自成都普瑞法科技开发有限公司，纯度>98%。液相色谱用乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
实施例1
（1）对照品溶液制备
分别称取紫草酸、黄芩苷、连翘苷、丹皮酚、槲皮素、黄芩素、木犀草苷、隐绿原酸、新绿原酸、牛蒡子苷、咖啡酸、异连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷B、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、迷迭香酸、千层纸素、白杨素、汉黄芩苷、汉黄芩素对照品（精确至0.01 mg），加70%甲醇定容至每1mL含0.1mg的溶液，作为对照品溶液；
（3）双黄连供试品溶液制备
精密量取双黄连样品（口服液、胶囊、颗粒、片剂）适量，口服液精密量取8mL，颗粒、胶囊内容物、含片均研细，过80目筛，分别取4g、0.64g、1.6g，置于25 mL容量瓶中，均相当于原药材12g/25mL，用70% 甲醇定容至刻度线，超声20 min ，放冷，补重，过滤，取续滤液与丹皮酚供试液(55µg/mL)1:1混匀经0.45 µm微孔滤膜滤过，即得供试液；
（4）色谱及质谱条件
色谱柱Thermo Hypersil Gold aQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为：乙腈-0.05%甲酸，前半段梯度洗脱条件：0~18min，3%ACN（流速0.9ml/min）；18~30min，3%→6%ACN(流速1.0ml/min)；30~70min，6→3%ACN(流速1.0ml/min)；70~75min，3%→8%ACN(流速1.0ml/min)；75~110min，8%→12%ACN(流速1.0ml/min) ；110~170min，12% ACN(流速1.0ml/min)；170~210 min，12%→18% ACN(流速1.0ml/min)；后半段梯度洗脱条件(流速1.0ml/min)：0~15min，10%→13%ACN；15~65min，13%ACN；65~100min，13%→20%ACN；100~200min，20%→31% ACN。检测波长：260 nm；柱温：30℃；检测时间：200 min；进样量：10 µL；
质谱条件为：采用ESI离子源，在正、负离子电离模式下分别采集数据进行质谱检测，离子阱质量分析器，质量扫描范围：m/z 50～1500，毛细管电压：4000 V(+),3500 V(-)，干燥气流速：9.0L·min-1，干燥气温度：350 ℃，喷雾气压力：35.0 psi，碰撞气：氦气。
（5）仪器精密度考察与稳定性考察
取同一样品供试液，10 µL进样，连续进样 6次，按照2.2.1中方法进行测定，以丹皮酚为参照峰，考察主要共有峰的相对保留时间及相对峰面积的标准偏差（RSD%）。结果主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0 %，表明仪器精密度良好。连续检测时间共24小时，说明供试品溶液24 h内稳定性良好。见表1-4。
表1 双黄连指纹图谱前半段精密度(相对保留时间)
表2 双黄连指纹图谱前半段精密度(相对峰面积)
表3双黄连指纹图谱后半段精密度(相对保留时间)
表4 双黄连指纹图谱后半段精密度(相对峰面积)
内标物的选择共考察了丹皮酚、紫草酸、金丝桃苷、葛根素等对照品，最终选择了丹皮酚为内标。丹皮酚在前后两段色谱图中均能与相邻峰达到基线分离，且出峰时间适宜，在供试液中溶解度、稳定性均较好。
（6）按照上述建立的指纹图谱测定方法，得到色谱图，如图1所示：
对双黄连口服制剂进行指纹图谱分析，以丹皮酚为参照峰（S），标定了31个共有峰，共有峰面积占总面积的84%，通过对照品保留时间和紫外吸收光谱的比对，结合质谱解析结果，确定了25个共有峰的化学成分，分解结果见表5。
表5 双黄连中部分共有峰化合物成分解析
（一）对60批双黄连口服制剂进行了指纹图谱测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）》，采用中位数法生成对照指纹图谱，见图2。样品间相似度为0.22~0.99，可见不同批次间样品差异比较大。图中，前半段指纹图谱：p1:10.174min，p2:11. 1min，p3:16.479min，p4:25.006min，p5:26.378min， p6:28.426min，p7:34.01min，p8:38.978min，p9:46.173min，p10:48.575min， p11:52.663min，p12:57.215min，p13:82.35min，p14:99.956min，p15:124.031min，p16:139.659min，p17:142.867min，p18:145.857min，p19:151.252min，p20:160.438min；后半段指纹图谱：p21:58.355min，p22:61.748min，p23:69.456min，p24:90.793min，p25：96.346min，p26:113.522min， p27:115.994min， p28:123.194min， p29:184.262min， p30:192.221min， p31:197.208min
（二）重复性试验
取同一批供试品(三精口服液，批号:15082221)5份，按照2.1.2中方法制成供试品溶液，按照2.2.1中方法进行测定，以丹皮酚为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和峰面积比值。结果显示各共有峰的相对保留时间RSD＜3 %，相对峰面积RSD＜3 %，表明分析方法重现性良好。见表6-9。
表6 双黄连指纹图谱前半段重复性(相对峰面积)
表7 双黄连指纹图谱前半段重复性(相对保留时间)
表8 双黄连指纹图谱后半段重复性(相对保留时间)
表9 双黄连指纹图谱后半段重复性(相对峰面积)
（三）测定法
取不同批号双黄连制剂样品，按照2.1.2方法制备供试品溶液，分别取供试品溶液按照2.2.1中方法进行测定，以丹皮酚为参照，计算30个共有峰的相对峰面积和相对保留时间。
（四）指纹图谱主要色谱峰的选择和标定
对双黄连样品进行指纹图谱分析，以丹皮酚为参照，选取90%样品均包括的成分为共有成分，标定了31个共有峰。
对比例1
步骤（1）-（3）同实施例1。
（4）色谱条件
色谱柱Thermo Hypersil Gold aQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为：乙腈-0.05%甲酸，梯度洗脱条件：0~18min，3%ACN（流速0.9ml/min）；18~30min，3%→6%ACN(流速1.0ml/min)；30~70min，6→2%ACN(流速1.0ml/min)；70~75min，2%→8%ACN(流速1.0ml/min)；75~110min，8%→13%ACN(流速1.0ml/min) ；110~170min，12→15.5% ACN(流速1.0ml/min)；170~180min，15.5→17%A CN(流速1.0ml/min)；180~190min，17→17% ACN(流速1.0ml/min)；190~240min，17→22% ACN(流速1.0ml/min)； 240~310min，22→35% ACN(流速1.0ml/min)。检测波长：260 nm；柱温：30℃；检测时间：310min；进样量：10 µL。
该对比例中分离效果差，尤其是17号峰（木樨草苷）与20/21号峰无法达到基线分离；无法得到本发明的指纹图谱。
对比例2
步骤（1）-（4）同实施例1。
（4）色谱条件 ：色谱柱Thermo Hypersil Gold aQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为：乙腈-0.05%甲酸；洗脱条件： 0~18min，3%ACN（流速0.9ml/min）；18~30min，3%→6%ACN(流速1.0ml/min)；30~70min，6→3%ACN(流速1.0ml/min)；70~75min，3%→8%ACN(流速1.0ml/min)；75~110min，8%→13%ACN(流速1.0ml/min) ；110~170min，13% ACN(流速1.0ml/min)；170~220min，13→15%A CN(流速1.0ml/min)；220~350min，15→35% ACN(流速1.0ml/min)。检测波长：260 nm；柱温：30℃；检测时间：350min；进样量：10 µL。
该对比例中分离效果差，尤其是17号峰（木樨草苷）与20/21号峰无法达到基线分离；无法得到本发明的指纹图谱。
Claims (8)
1.一种双黄连口服制剂指纹图谱测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：称取紫草酸、黄芩苷、连翘苷、丹皮酚、槲皮素、黄芩素、木犀草苷、隐绿原酸、新绿原酸、牛蒡子苷、咖啡酸、异连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷B、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、迷迭香酸、千层纸素、白杨素、汉黄芩苷、汉黄芩素对照品，用70%甲醇稀释即得；
（2）供试品溶液制备：量取双黄连样品，置于25 mL容量瓶中，用70% 甲醇定容至刻度线，超声 ，放冷，补重，过滤，取续滤液与丹皮酚供试液混匀，经微孔滤膜滤过，即得供试液；
（3）利用高效液相色谱-质谱进行分析检测。
2.根据权利要求1所述的双黄连口服制剂指纹图谱测定方法，其特征在于，所述对照品溶液用70%甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液。
3.根据权利要求1所述的双黄连口服制剂指纹图谱测定方法，其特征在于，所述供试品溶液的具体制备方法为：量取双黄连样品，其中口服液精密量取8mL，颗粒、胶囊内容物、含片均研细，过80目筛，分别取4g、0.64g、1.6g，置于25 mL容量瓶中，均相当于原药材12g/25mL，用70% 甲醇定容至刻度线，超声20 min ，放冷，补重，过滤，取续滤液与丹皮酚供试液混匀，经0.45 µm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
4.根据权利要求1所述的双黄连口服制剂指纹图谱测定方法，其特征在于，所述续滤液同丹皮酚供试液的体积比为1：1。
5.根据权利要求1或4所述的双黄连口服制剂指纹图谱测定方法，其特征在于，所述丹皮酚供试液的浓度为55µg/mL；所述取丹皮酚供试液以70% 甲醇溶解并定容制成浓度为55µg·mL-1的内标溶液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的双黄连口服制剂指纹图谱测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱的条件为：色谱柱Thermo Hypersil Gold aQ C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；检测波长：260 nm；柱温：30℃；检测时间：200 min；进样量：10 µL；流动相为：乙腈-0.05%甲酸，梯度洗脱。
7.根据权利要求6所述的双黄连口服制剂指纹图谱测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱为前半段梯度洗脱和后半段梯度洗脱，
所述前半段梯度洗脱条件：0~18min，3%ACN；18~30min，3%→6%ACN；30~70min，6→3%ACN；70~75min，3%→8%ACN；75~110min，8%→12%ACN ；110~170min，12% ACN；170~210 min，12%→18% ACN；
所述后半段梯度洗脱条件：0~15min，10%→13%ACN；15~65min，13%ACN；65~100min，13%→20%ACN；100~200min，20%→31% ACN。
8.根据权利要求6或7所述的双黄连口服制剂指纹图谱测定方法，其特征在于，所述质谱的条件为：采用ESI离子源，在正、负离子电离模式下分别采集数据进行质谱检测，离子阱质量分析器，质量扫描范围：m/z 50～1500，毛细管电压：4000 V(+),3500 V(-)，干燥气流速：9.0L·min-1，干燥气温度：350 ℃，喷雾气压力：35.0 psi，碰撞气：氦气。
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